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    長沙臭豆腐鹵水發(fā)酵過程特征風(fēng)味物質(zhì)及其關(guān)聯(lián)菌群分析

    2022-12-22 09:08:44康林芝鐘瑞敏劉國凌蔣立文
    食品科學(xué) 2022年22期
    關(guān)鍵詞:臭豆腐鹵水吲哚

    唐 輝,陳 霖,康林芝,李 跑,鐘瑞敏,劉國凌,蔣立文,3,*

    (1.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512005;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 400128;3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128)

    “食臭”自古有之,雖然其氣味不甚友好,但因獨特的風(fēng)味、濃厚的地域特色和深厚的文化底蘊,彰顯著其存在的價值。中國的臭豆腐、法國的臭奶酪、韓國的鰩魚片、日本的咸圓鯵魚干和納豆、瑞典的鯡魚罐頭等都以其獨特的風(fēng)味享譽世界[1]。以秦嶺淮河為界,臭豆腐可分為北方發(fā)酵型和南方半發(fā)酵型。長沙臭豆腐“聞起來臭、吃起來香”,是南方半發(fā)酵型臭豆腐代表之一,主要工藝是將豆腐坯浸入發(fā)酵鹵水一段時間,油炸后拌佐料供人們休閑食用,其加工和風(fēng)味來源關(guān)鍵在于發(fā)酵鹵水[2]。鹵水制作多沿用傳統(tǒng)敞口式發(fā)酵,風(fēng)味品質(zhì)不穩(wěn)定。目前關(guān)于鹵水的研究主要集中在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和微生物多樣性等方面。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究,一方面是其分析方法的優(yōu)選,李里[3]比較了固相微萃?。╯olid phase micro-extraction,SPME)、溶劑萃取法、同時蒸餾萃取法的提取效果,結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)檢測,發(fā)現(xiàn)SPME能提取到臭豆腐及其鹵水更多揮發(fā)性成分。Tang Hui等[4]采用頂空-SPME-GC-MS(headspace SPME-GCMS,HS-SPME-GC-MS)方法對不同品牌的長沙臭豆腐鹵水中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行研究,系統(tǒng)優(yōu)化了SPME萃取纖維種類、平衡時間、萃取溫度、萃取時間和不同極性色譜柱等提取和分析條件。另一方面是鹵水揮發(fā)性成分定性和定量研究,鄭小芬等[5]比較了深色和淺色2種鹵水的揮發(fā)性成分,結(jié)果發(fā)現(xiàn),深色鹵水中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有38種,以酯類、醇類和酸類為主,酯類的含量最高,乙酸丙酯、乙酸丁酯的含量達到10%以上;淺色鹵水中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有42種,以雜環(huán)類化合物、含硫化合物、烷烴類物質(zhì)為主,雜環(huán)類化合物的含量最高,間甲基苯酚含量達到37.92%。賀靜[6]對不同發(fā)酵階段鹵水的揮發(fā)性成分進行研究,發(fā)現(xiàn)僅在鹵水發(fā)酵初期檢測出酸類物質(zhì),酮類、醇類、醛類、酚類、烷類、烯類、酯類等物質(zhì)在發(fā)酵初、中、晚3個時期都存在,但種類和含量在不同時期有不同變化,3-甲基吲哚是貫穿整個發(fā)酵過程的物質(zhì)。Tang Hui等[4]發(fā)現(xiàn)對甲基苯酚、苯酚、3-甲基吲哚、吲哚、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和3-甲基丁酸等成分是不同品牌長沙鹵水共有的氣味貢獻物質(zhì)。關(guān)于臭豆腐鹵水中微生物的研究,目前主要采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)[7]、16S rRNA[8]和454焦磷酸[9]等高通量測序技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌較高頻的被分離檢測到[7],浙江臭豆腐鹵水中的主要優(yōu)勢菌群為普雷沃菌屬、乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和克里斯滕森氏菌屬[8],長沙臭豆腐鹵水中主要優(yōu)勢菌有厭氧球菌屬、卟啉單胞菌屬和氨基桿菌屬等[9]。

    相關(guān)學(xué)者對鹵水中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析方法、定性和定量分析、微生物的多樣性等方面做了大量研究,但鹵水發(fā)酵過程中的特征風(fēng)味成分和優(yōu)勢菌群的變化及其相關(guān)性方面的研究卻鮮有報道,明確鹵水中特征風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)菌群,對促進長沙臭豆腐風(fēng)味品質(zhì)的穩(wěn)定具有重要的意義。

    鳥槍法宏基因組學(xué)等高通量測序技術(shù)克服了以往研究手段的局限性,以環(huán)境樣品中的微生物群體全基因組為研究對象,用于分析微生物群落的分類組成和功能潛力,鑒定到微生物的種、株水平,能更全面準確地監(jiān)測環(huán)境樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)情況[10],因此被廣泛應(yīng)用于奶酪[11-12]、醬油[13]、酸菜[14]、食醋[15]等發(fā)酵食品中。Escobar-Zepeda等[12]利用鳥槍法宏基因組學(xué)揭示了Cotija奶酪中獨特的微生物群落結(jié)構(gòu),并成功檢測出與Cotija奶酪多種風(fēng)味形成有關(guān)的微生物。本實驗以豆腐、冬筍、梅干菜、香菇等原料為基質(zhì)發(fā)酵長沙臭豆腐鹵水,利用HS-SPME-GC-MS、內(nèi)標定量法結(jié)合香氣活性值(odor activity value,OAV)跟蹤鹵水發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分、特征風(fēng)味物質(zhì)及其動態(tài)變化情況,在此基礎(chǔ)上,采用鳥槍法宏基因組學(xué)探究不同發(fā)酵時期鹵水的優(yōu)勢菌群,通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析鹵水中優(yōu)勢菌群與特征風(fēng)味成分之間的相關(guān)性,尋找鹵水中風(fēng)味關(guān)聯(lián)菌,以期為穩(wěn)定長沙臭豆腐風(fēng)味品質(zhì),促進其現(xiàn)代化生產(chǎn)提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    冬筍、梅干菜、香菇、豆腐花、豆豉、鹽、食用純堿湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場;C7~C30正構(gòu)烷烴混合標準品、鄰二氯苯標準品(99.99%) 美國Supelco公司;D4015-02型E.Z.N.A.?Stool DNA Kit、Ambion試劑盒、AM9932型Nuclease-free Water試劑盒、FC-121-4001型TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit-Set A試劑盒美國Omega公司;瓊脂糖 西班牙Biowest公司;甲醇、乙醇、甲醛、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞(均為分析純) 國藥集團上?;瘜W(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    GC-MS-QP2010 GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司;CD-WAX極性色譜柱 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;85 μm Polyacrylate萃取纖維 美國Supelco公司;HiSeq4000高通量測序平臺 美國Illumina公司;Power Pac 3000型瓊脂糖凝膠電泳儀、Gel Doc XR+型凝膠成像儀 美國Biorad公司;LONG GENE MG96型梯度PCR儀 中國杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;Allegra 6R型冷凍離心機 德國貝克曼公司;Q32857型核酸蛋白檢測儀 美國Invitrogen公司;UCD-200超聲波破碎儀比利時Diagenode公司。

    1.3 方法

    1.3.1 長沙臭豆腐鹵水生產(chǎn)工藝流程

    長沙臭豆腐鹵水工藝流程見圖1。

    圖1 長沙臭豆腐鹵水工藝流程Fig. 1 Flow chart for the production process of Changsha stinky tofu brine

    工藝說明:按比例稱取冬筍(去除外衣)、梅干菜、干香菇蒂、黑豆、豆豉等原料,清洗后用粉碎機粉碎,加入涼白開水,在高壓滅菌鍋中121 ℃蒸煮滅菌120 min,冷卻后按比例加入豆腐花、食用純堿、鹽,攪拌均勻后分裝入9個10 L的發(fā)酵罐中,封口,在37 ℃的培養(yǎng)箱中保溫發(fā)酵,定時取樣。其中,每3個桶為一個平行樣,9個發(fā)酵罐為3個平行樣,當樣品發(fā)酵至0、6、15、30、45、60、90、120 d每個平行樣分別取1 kg左右,放入-80 ℃冰箱,待用。每次取樣前后均需將樣品攪拌均勻,取樣后樣品需封口,待下次取樣時再開啟攪拌。

    1.3.2 長沙臭豆腐鹵水理化指標的測定

    pH值:采用pH計,每個樣品平行測定3次。氨基酸態(tài)氮的測定:參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》酸度計法[16],每個樣品平行測定3次。

    1.3.3 長沙臭豆腐鹵水揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測

    分別取發(fā)酵0、6、15、30、45、60、90、120 d鹵水各2.0 mL于固相微萃取頂空瓶中,添加5 μL內(nèi)標稀釋液(取15 μL鄰二氯苯于250 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度),再分別進行HP-SPME萃取和GC-MS測定。萃取和測定條件參考文獻[17],每個樣品平行測定3次。

    總離子流色譜圖經(jīng)NIST2014s標準譜庫檢索定性鑒定出成分,并結(jié)合計算保留指數(shù)(retention index,RI)共同確定化合物。RI按式(1)計算:

    式中:n為碳數(shù);ti為待測揮發(fā)性成分的保留時間/min;tn為具有n個碳原子正構(gòu)烷烴的保留時間/min;tn+1為具有n+1個碳原子正構(gòu)烷烴的保留時間/min。

    將計算的RI與數(shù)據(jù)庫(http://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser.html)中參考RI進行比較,相近者則為同一種物質(zhì)。

    采用內(nèi)標法定量長沙臭豆腐鹵水中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的絕對含量,按式(2)計算:

    式中:C1為待檢化合物的質(zhì)量濃度/(μg/mL);C0為加入內(nèi)標化合物的質(zhì)量濃度/(μg/mL);A1為待檢化合物的峰面積;A0為加入內(nèi)標化合物的峰面積;V1為每次萃取鹵水樣品的體積(2.0 mL);V0為加入內(nèi)標化合物的體積(5 μL)。

    OAV按式(3)計算:

    式中:Ci為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度/(μg/mL);OTi為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣味閾值/(μg/mL)。

    當OAV≥1時,認為該風(fēng)味物質(zhì)是關(guān)鍵的風(fēng)味化合物,對樣品風(fēng)味具有重要貢獻,OAV越大,風(fēng)味貢獻度就越大;當0.1≤OAV<1時,認為該風(fēng)味物質(zhì)對樣品風(fēng)味有一定的貢獻;OAV<0.1時,認為該風(fēng)味物質(zhì)對整體風(fēng)味影響不大。

    1.3.4 微生物鳥槍法宏基因組測序分析

    依據(jù)鹵水發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和特征風(fēng)味成分變化的關(guān)鍵時間點,分別取發(fā)酵0、15、30、45、60 d(記為stb0、stb15、stb30、stb45、stb60)的鹵水樣品,每個關(guān)鍵時間點取樣重復(fù)3次,采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit試劑盒提取各鹵水樣品中微生物總DNA,選取樣品DNA電泳條帶較好,無明顯降解,OD260/OD280值在1.8~2.0之間的DNA送杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司測序平臺進行高通量測序,測序模式為PE150。

    下機后的原始數(shù)據(jù)采用FastQ files(version 1.33)軟件(https://github.com/najoshi/sickle)進行預(yù)處理,參考文獻進行基因組裝[18]、CDS預(yù)測[19]、去冗余基因[20]等信息處理,獲得最終用于后續(xù)分析的Unigenes[21]。將Unigenes與NR_meta庫(根據(jù)NR數(shù)據(jù)總庫對微生物數(shù)據(jù)庫進行構(gòu)建后的子庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和KEGG功能數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway)進行比對,獲得各層級的物種分類和功能信息。

    1.3.5 相關(guān)性分析

    根據(jù)長沙臭豆腐鹵水中特征風(fēng)味物質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)的變化情況,采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析鹵水中優(yōu)勢菌群與特征揮發(fā)性風(fēng)味成分之間的相關(guān)性。

    1.4 數(shù)據(jù)處理軟件

    采用Excel 2007、Visio 2007、R 3.6.3、Matelab 7.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析和處理;宏基因組原始數(shù)據(jù)已上傳https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/(查詢號PRJNA731658)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 長沙臭豆腐鹵水發(fā)酵過程中理化指標的變化情況

    如圖2所示,鹵水pH值先降后升,在發(fā)酵第6天降到最低,發(fā)酵60 d左右趨于穩(wěn)定。這主要是因為發(fā)酵前期,糖類、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)在微生物的代謝下產(chǎn)酸,鹵水的pH值急速下降,于發(fā)酵第6天降到最低。隨著發(fā)酵時間的推移,微生物此消彼長,一些產(chǎn)堿微生物的復(fù)蘇和繁殖,糖類、脂肪和蛋白質(zhì)不斷分解代謝出堿性物質(zhì),導(dǎo)致pH值升高,發(fā)酵60 d左右時,體系pH值趨于穩(wěn)定,這與賀靜[6]和李雨楓等[22]的研究結(jié)果一致。

    鹵水發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量先升后降,在發(fā)酵第45天升到最高,隨后下降,至發(fā)酵60 d左右趨于穩(wěn)定。發(fā)酵0~45 d時,微生物利用蛋白酶系降解原料中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量游離氨基酸,鹵水中的氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高。發(fā)酵45 d后,氨基酸態(tài)氮逐漸下降,這可能一方面是微生物生長繁殖對游離氨基酸的必需消耗所引起,另一方面是由于Strecker降解反應(yīng)將游離氨基酸降解為揮發(fā)性的醛、酚、醇等風(fēng)味物質(zhì)[23]導(dǎo)致鹵水體系中氨基酸態(tài)氮含量下降。這個結(jié)果與酸菜[24]和燕麥[25]等發(fā)酵食品發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化趨勢相同。

    圖2 鹵水發(fā)酵過程pH值和氨基酸態(tài)氮的變化Fig. 2 Changes in pH and amino acid nitrogen content of stinky tofu brine during fermentation

    2.2 長沙臭豆腐鹵水發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和特征風(fēng)味物質(zhì)的變化情況

    圖3 鹵水發(fā)酵過程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總種類和總含量的變化Fig. 3 Changes in the total number and amount of volatile components in stinky tofu brine during fermentation

    如圖3所示,鹵水發(fā)酵過程共鑒定到75種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中,醇類22種、酸類8種、醛類2種、酮類9種、酯類18種、醚類3種、苯酚類4種、吲哚類2種和其他類7種。發(fā)酵0、6、15、30、45、60、90、120 d鹵水中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總種類分別為16、30、31、42、27、33、25、14種,在發(fā)酵第30天出現(xiàn)高峰;總質(zhì)量濃度分別為3.01、305.42、562.05、365.8、629.56、120.62、21.87、2.49 μg/mL,在發(fā)酵第15、45天出現(xiàn)2個高峰(562.05 μg/mL和629.56 μg/mL)。綜合pH值的變化趨勢,推測發(fā)酵0~15 d,鹵水中一些產(chǎn)酸菌大量繁殖,促使氨基酸、揮發(fā)性脂肪酸等代謝產(chǎn)物、風(fēng)味前體物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生,導(dǎo)致?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量在第15天左右出現(xiàn)第1個高峰;隨著發(fā)酵時間繼續(xù)延長,pH值逐漸升高,菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化,氨基酸、脂肪酸、糖類等風(fēng)味前體物質(zhì)在微生物和酶的作用下經(jīng)過一系列生化反應(yīng),進一步產(chǎn)生大量的酚、醇、醛、酮、酯等風(fēng)味物質(zhì),使總量在第45天左右出現(xiàn)第2個高峰。

    由圖4a可知,苯酚和吲哚類物質(zhì)種類較穩(wěn)定(苯酚有3~4種,吲哚有2種),且含量很高,但含量在發(fā)酵過程中的變化較大,呈先升后降,再升再降的變化趨勢,且兩者都在發(fā)酵第15、45天出現(xiàn)峰值。其中,苯酚類物質(zhì)在第45天,出現(xiàn)最高峰值(428.32 μg/mL),吲哚類物質(zhì)在發(fā)酵第15天出現(xiàn)最高峰值(244.19 μg/mL)。由圖4b可知,醇、酸、酯類物質(zhì)種類和含量較高,變化較大,都呈先升后降的變化趨勢,其中,醇類在發(fā)酵第30天達最高種類(15種),酯類的種類在發(fā)酵第6、30天(12種)達到2個高峰期,酸類在發(fā)酵第15天達到最高種類(6種),三者的含量均在發(fā)酵第6天,達到較高水平。由圖4c可知,醛、酮和醚類物質(zhì)種類較少,含量也較低,整個發(fā)酵過程較為穩(wěn)定。

    圖4 鹵水發(fā)酵過程各種揮發(fā)性成分含量和種類的變化Fig. 4 Changes in the number and amount of phenols and indoles (a),alcohols, acids and esters (b), and aldehyde, ketones and ethers (c) in stinky tofu brine during fermentation

    如表1所示(僅列出不同發(fā)酵階段鹵水中OAV不小于1的19種特征風(fēng)味物質(zhì),其余56種物質(zhì)在各階段鹵水中OAV均小于1,因此未列出),發(fā)酵0、6、15、30、45、60、90、120 d的鹵水中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV不小于1的分別有3、9、13、11、9、10、3、3種,新鮮鹵水原料中(發(fā)酵0 d)1-辛烯-3-醇的OAV較高(220),是其主要的特征風(fēng)味物質(zhì),呈蘑菇和蔬菜香[26];在鹵水發(fā)酵過程中(發(fā)酵6~120 d)OAV較高的特征風(fēng)味物質(zhì)主要有苯酚、對甲基苯酚、吲哚和3-甲基吲哚等。苯酚和對甲基苯酚呈先升后降的變化趨勢,苯酚質(zhì)量濃度在0.39~89.96 μg/mL之間,OAV在0.07~15.25之間,發(fā)酵第15天出現(xiàn)峰值;對甲基苯酚質(zhì)量濃度在0.19~389.62 μg/mL之間,OAV在3.45~7 084.00之間,發(fā)酵第45天出現(xiàn)峰值。苯酚和對甲基苯酚在長期發(fā)酵的“臭味”食品中經(jīng)常出現(xiàn)[4,27],呈酚醛、窖泥等特殊風(fēng)味[27],LD50分別為530 μg/mg和1 800 μg/mg(大鼠,經(jīng)口),GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規(guī)定兩者作為香料均可安全用于食品。鹵水中苯酚和對甲基苯酚濃度雖偏高,但遠低于其LD50值,且鹵水不直接食用,只作為長沙臭豆腐的浸泡原料,其中的苯酚和對甲基苯酚經(jīng)傳遞和高溫油炸后(長沙臭豆腐需油炸后食用),大量揮發(fā),濃度大幅度下降,因此不存在安全危害,且一定量的苯酚和對甲基苯酚賦予了長沙臭豆腐特殊的風(fēng)味。有研究表明,苯酚和對甲基苯酚是腸道中細菌降解酪氨酸的代謝產(chǎn)物,一些腸道微生物可代謝酪氨酸產(chǎn)苯酚或(和)對甲基苯酚,如梭菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸菌等[27]。吲哚和3-甲基吲哚也是鹵水發(fā)酵過程中主要的特征風(fēng)味物質(zhì),其中,吲哚的質(zhì)量濃度較高,在1.14~242.97 μg/mL之間,OAV在8.14~1 735.50之間,在發(fā)酵第15天出現(xiàn)最高值;3-甲基吲哚質(zhì)量濃度雖不高,在0.14~3.00 μg/mL之間,但閾值極低,風(fēng)味強烈,OAV在23.33~500.00之間,在發(fā)酵第45天出現(xiàn)最高值。吲哚LD50為1 000 μg/mg(大鼠,經(jīng)口),3-甲基吲哚無毒性,具有一定刺激性,兩者都是GB 2760—2014中規(guī)定允許使用的食品用合成香料,呈糞便臭味,但低濃度時具有特殊芳香氣味[26]。鹵水中的吲哚和3-甲基吲哚經(jīng)傳遞和高溫油炸后,濃度大幅度下降,亦賦予了長沙臭豆腐特殊的風(fēng)味。據(jù)報道,吲哚和3-甲基吲哚的產(chǎn)生與原料中色氨酸的代謝有關(guān),目前發(fā)現(xiàn)只有一些腸道細菌,包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、嗜熱共生菌(Symbiobacterium thermophilum)、芽孢菌(Bacillussp.)等[28-29]細菌可以代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚。臭豆腐鹵水中的主要原料有豆腐、冬筍、梅干菜、香菇等,含有豐富的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等,為臭豆腐鹵水主要特征風(fēng)味的形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

    另外,鹵水發(fā)酵過程中還含有一些不斷變化的醇、酸、醛、酯、胺等特征風(fēng)味物質(zhì),它們在不同發(fā)酵階段鹵水中的OAV均不小于1,具有一定的貢獻度,主要有丁酸、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、三甲胺等物質(zhì)強化了發(fā)酵6~60 d鹵水的主體臭味,賦予了其酸臭和腥臭味[26]。異戊醇、2-庚醇、正己醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-十一醇、苯乙醇、合金歡醇、3-苯丙酸乙酯、丙位十二內(nèi)酯和壬醛豐富了發(fā)酵6~60 d鹵水濃郁的蘑菇和蔬菜香、花香、果香、酒香和油脂香等[26]。發(fā)酵90 d后,這些香味物質(zhì)在鹵水中逐漸消失。

    綜上所述,鹵水在整個發(fā)酵過程中,特征風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量不斷變化,其中,苯酚、對甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚貫穿鹵水整個發(fā)酵過程,是其中主要的特征風(fēng)味物質(zhì),亦或是長沙臭豆腐“聞起來臭,吃起來香”的主要原因。丁酸、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、三甲胺是長沙臭豆腐“聞起來臭”的另一原因。異戊醇、2-庚醇、正己醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-十一醇、苯乙醇、合金歡醇、3-苯丙酸乙酯、丙位十二內(nèi)酯和壬醛等特征風(fēng)味物質(zhì)或是長沙臭豆腐“吃起來香”的另一原因。

    2.3 長沙臭豆腐鹵水發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化

    2.3.1 臭豆腐鹵水微生物群落界水平的組成

    通過注釋得到不同發(fā)酵階段鹵水中微生物在界水平的豐度統(tǒng)計與差異比較,見表2。鹵水發(fā)酵過程中,界水平各組成的物種差異顯著(P<0.01),其中,細菌占絕對優(yōu)勢,平均豐度占比達90%以上。谷靜思[8]、賀靜[9]等研究發(fā)現(xiàn)鹵水中微生物主要是細菌,這與本研究結(jié)果一致。病毒、古生菌、真核生物在鹵水發(fā)酵過程中平均豐度占比較低,分別為0.86%、0.08%和0.04%。另外,鹵水中還有平均豐度占比8.73%的未知物種,限于數(shù)據(jù)庫物種數(shù)以及技術(shù)水平,本實驗不做深入分析,但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)庫的更新,這些寶貴的生物資源將會越來越多的被認識和利用。

    表1 不同發(fā)酵時期鹵水中特征風(fēng)味物質(zhì)含量、OAV與風(fēng)味特征描述Table 1 Contents, OAVs and flavor characteristics of flavor compounds in stinky tofu brine at different fermentation periods

    表2 界水平物種豐度統(tǒng)計與差異比較Table 2 Statistics and comparison of microbial abundance at the kingdom level

    2.3.2 基于種水平臭豆腐鹵水微生物多樣性結(jié)果

    從圖5可以看出,基于種水平,發(fā)酵鹵水5個樣本中微生物數(shù)目依次為stb45>stb60>stb15>stb30>stb0,共鑒定出8 483種微生物,其中,2 817種微生物在不同發(fā)酵階段的鹵水中被檢測到,這些菌可能與鹵水發(fā)酵過程中共同檢測到的風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)。有42、234、10、32、87種微生物分別為stb0、stb15、stb30、stb45、stb60獨有,這些微生物可能與鹵水在不同發(fā)酵階段的獨特代謝產(chǎn)物的形成相關(guān)。

    圖5 基于種水平的微生物upset圖Fig. 5 Upset plot of microbiota at the species level

    2.3.3 臭豆腐鹵水發(fā)酵過程菌群結(jié)構(gòu)變化情況

    如圖6所示,本實驗僅將每個樣品中相對豐度不小于1%的種單獨呈現(xiàn)于柱形圖中,小于1%的統(tǒng)一歸屬為其他(others)。5個樣品中相對豐度不小于1%的菌種總豐度占微生物總豐度60%以上,即能表達樣本總微生物的主要信息[30]。雖然在不同發(fā)酵階段鹵水中鑒定到大量的共有物種(2 817種),但是相對豐度不小于1%的物種差異較大,發(fā)酵前(0 d)與發(fā)酵后(15、30、45、60 d)鹵水樣本中的主要物種種類差異明顯,這是由于發(fā)酵前后鹵水體系的pH值發(fā)生較大變化(見2.1節(jié)結(jié)果),一些非嗜酸菌如微小桿菌等逐漸被替代。發(fā)酵后鹵水中的主要物種有一定演替變化,但總體上比較相近,推測發(fā)酵后鹵水中共有的主要物種是發(fā)酵階段的主要特征風(fēng)味形成的功能菌種。

    基于注釋得到的鹵水中微生物種類和相對豐度,本實驗將相對豐度不小于4%的種定義為優(yōu)勢菌[31],基于種水平,鹵水發(fā)酵前(0 d)樣品中的優(yōu)勢微生物主要為微小桿菌屬(Exiguobacteriumunclassified、E. alkaliphilum、Exiguobacteriumsp.AB2、E. chiriqhucha,相對豐度分別為22.13%、16.71%、12.96%、7.75%)、糞腸球菌屬(Enterococcus faecalis)14.69%。鹵水發(fā)酵后(15~60 d)共篩選出11種優(yōu)勢菌,即梭菌科中4個屬5個種(Clostridiales bacteriumSYSU GA17129、Clostridialesunclassified、Clostridium ultunense、Sporanaerobacter acetigenes、Keratinibaculum paraultunense)、芽孢桿菌科中3個屬3個種(Massilibacterium senegalense、Aneurinibacillus aneurinilyticus、Pseudogracilibacillus auburnensis)、產(chǎn)堿菌科1個屬1個種(Paenalcaligenes hominis)、依格納季氏菌屬2個種(Ignatzschineriasp.F8392、Ignatzschineria indica)。其中,發(fā)酵初期(15 d)鹵水中優(yōu)勢菌有4種,包括C. bacteriumSYSU GA17129、S. acetigenes、M. senegalense和A. aneurinilyticus,相對豐度分別為12.74%、11.48%、7.69%和7.22%。發(fā)酵中期(30 d)鹵水中優(yōu)勢菌有6種,包括M. senegalense、S. acetigenes、Clostridialesunclassified、C. ultunense、K. paraultunense和C. bacteriumSYSU GA17129,相對豐度分別為15.67%、9.92%、9.58%、6.05%、5.07%和4.25%。發(fā)酵中、后期(45 d和60 d)鹵水中優(yōu)勢菌種共包括Clostridialesunclassified、C. ultunense、K. paraultunense、P. hominis、Ignatzschineriasp.F8392和I. indica,發(fā)酵第45天鹵水中的優(yōu)勢菌還包括M. enegalense和P. auburnensis,除了發(fā)酵第60天鹵水中P. hominis相對豐度高達12.92%,其他菌種在鹵水中的相對豐度均在4.08%~7.05%之間。有研究表明,微小桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、芽孢桿菌屬等是健康人群腸道中主要菌群組成部分[32],其中,微小桿菌和糞腸球菌具有較高的降解蛋白質(zhì)和多肽物質(zhì)的能力[33-34],這對鹵水發(fā)酵初期降解鹵水原料中大量蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì),形成大量風(fēng)味前體物質(zhì)起著重要的作用。鹵水發(fā)酵過程中,優(yōu)勢菌之一的梭菌科大多數(shù)在pH值為6.5~8.5,溫度30~37 ℃時生長最快,能分泌蛋白酶、淀粉酶、氨基酸脫羧酶、脂酶等代謝糖類化合物、氨基酸、醇類、纖維素類、嘌呤、類固醇和其他有機物合成醇類、酸類及苯酚類物質(zhì)等[35-36]。芽孢桿菌科是鹵水中的另一優(yōu)勢菌科,大多數(shù)芽孢桿菌科在pH值為6~8、溫度30~37 ℃時最宜生長,能分泌蛋白酶、淀粉酶、氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶等多種酶,代謝各種糖類物質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生醇、酸、酯、酚、含硫、雜環(huán)類等多種風(fēng)味化合物[37]。研究報道,梭菌屬、芽孢桿菌屬在臭豆腐及其鹵水中也較高頻的被分離鑒定到[6-9,38],這與本研究結(jié)果一致。由此可知,鹵水體系環(huán)境非常適宜梭菌科、芽孢桿菌科的生長和代謝,從而使得鹵水形成復(fù)雜的風(fēng)味。

    綜上所述,微小桿菌屬(4個種)和糞腸球菌是鹵水發(fā)酵前的優(yōu)勢菌種,梭菌科(5個種)和芽孢桿菌科(3個種)的細菌從種類和數(shù)量上都是發(fā)酵階段鹵水中主要的優(yōu)勢菌,尤其在鹵水發(fā)酵初、中期占絕對優(yōu)勢,后期逐漸減少。鹵水原料中氨基酸、糖類物質(zhì)非常豐富,可作為風(fēng)味前體物質(zhì),大量的特征風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵初、中期產(chǎn)生,由此推測發(fā)酵前、初、中期的優(yōu)勢菌為鹵水特征風(fēng)味物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌。

    圖6 鹵水不同發(fā)酵階段基于種水平的群落結(jié)構(gòu)變化Fig. 6 Change in the structure of microbial community at the species level as a function of fermentation time

    2.3.4 菌群結(jié)構(gòu)與特征風(fēng)味成分之間的相關(guān)性分析

    為了進一步探究優(yōu)勢菌群與特征風(fēng)味之間的關(guān)系,以種水平下微生物相對豐度不小于4%的優(yōu)勢菌群與19種特征風(fēng)味成分含量進行Pearson相關(guān)性分析,見圖7,圖中越接近紅色,正相關(guān)性越強,越接近藍色,負相關(guān)性越強。從圖7可以看出,與19種特征風(fēng)味物質(zhì)有相關(guān)性(P<0.05)的優(yōu)勢菌群有11種,其中,與C. bacteriumSYSU GA17129有相關(guān)性的特征風(fēng)味物質(zhì)數(shù)目最多,有8種,包括苯酚、丁酸、丙位十二內(nèi)酯、吲哚、對甲基苯酚、3-甲基丁酸、2-庚醇、正己醇。與A. aneurinilyticus有相關(guān)性的特征風(fēng)味物質(zhì)數(shù)目較多,有6種,包括3-甲基丁酸、苯酚、3-甲基吲哚、丁酸、丙位十二內(nèi)酯、1-辛烯-3-醇。與S. acetigenes有相關(guān)性的特征風(fēng)味物質(zhì)數(shù)目也較多,有5種,包括2-庚醇、正己醇、3-苯丙酸乙酯、丁酸、異戊醇。這3種優(yōu)勢菌與12種特征風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)(P<0.05),涵蓋了大部分的特征風(fēng)味物質(zhì),尤其是C. bacteriumSYSU GA17129、A. aneurinilyticus與主要特征風(fēng)味物質(zhì)苯酚、對甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚有顯著相關(guān)性(P<0.05)。C. bacteriumSYSU GA17129屬梭菌科,據(jù)報道,梭菌科可代謝酪氨酸及其代謝物(4-羥苯丙酮酸、4-羥基苯乙酸和對羥基苯甲酸等)產(chǎn)苯酚或(和)對甲基苯酚[39-40],這與本實驗結(jié)果一致。芽孢桿菌科屬被認為是幾種大豆基質(zhì)發(fā)酵食品中的關(guān)鍵微生物[41],A. aneurinilyticus屬芽孢桿菌科,譚金萍[42]在鹵水中分離鑒定出產(chǎn)苯酚微生物A.aneurinilyticus,這與本實驗結(jié)果也一致。

    相關(guān)性分析說明優(yōu)勢菌種C. bacteriumSYSU GA17129、A. aneurinilyticus、S. acetigenes等與大部分特征風(fēng)味物質(zhì)存在顯著相關(guān)(P<0.05),是鹵水中主要的風(fēng)味關(guān)聯(lián)菌。

    圖7 優(yōu)勢菌群與特征風(fēng)味成分Pearson相關(guān)性熱圖Fig. 7 Heat map showing Pearson’s correlation coefficients between the predominant microbial community and the characteristic flavor components

    3 結(jié) 論

    采用HS-SPME-GC-MS、內(nèi)標法結(jié)合OAV研究長沙臭豆腐鹵水發(fā)酵過程揮發(fā)性成分、特征風(fēng)味物質(zhì)及其變化情況,結(jié)果表明,鹵水發(fā)酵過程中共鑒定到75種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),主要包括苯酚類、吲哚類、醇類、酸類、醛類、酮類、酯類、醚類等。其中,苯酚、對甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚、丁酸、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、三甲胺、異戊醇、2-庚醇、正己醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-十一醇、苯乙醇、合金歡醇、3-苯丙酸乙酯、丙位十二內(nèi)酯和壬醛19種物質(zhì)是鹵水發(fā)酵過程中的特征風(fēng)味物質(zhì)。采用鳥槍法宏基因組學(xué),研究鹵水發(fā)酵過程菌群變化和優(yōu)勢菌群,結(jié)果顯示,鹵水發(fā)酵過程中共鑒定出11種優(yōu)勢菌種,即梭菌科(Clostridiales bacteriumSYSU GA17129、Clostridialesunclassified、Clostridium ultunense、Sporanaerobacter acetigenes、Keratinibaculum paraultunense)、芽孢桿菌科(Massilibacterium senegalense、Aneurinibacillus aneurinilyticus、Pseudogracilibacillus auburnensis)、產(chǎn)堿菌科(Paenalcaligenes hominis)、依格納季氏菌屬(Ignatzschineriasp. F8392、Ignatzschineria indica)。其中,優(yōu)勢菌C. bacteriumSYSU GA17129、A. aneurinilyticus和S. acetigene與12種特征風(fēng)味物質(zhì)存在顯著正相關(guān)(P<0.05),是鹵水中主要的風(fēng)味關(guān)聯(lián)菌。

    本實驗對長沙臭豆腐鹵水發(fā)酵過程特征風(fēng)味物質(zhì)和優(yōu)勢菌群及其相關(guān)性進行研究,明確與鹵水特征風(fēng)味關(guān)系密切的主要風(fēng)味關(guān)聯(lián)優(yōu)勢菌,但這些優(yōu)勢菌群的功能基因、參與的代謝通路及對特征風(fēng)味物質(zhì)形成所起的作用、鹵水發(fā)酵商業(yè)菌種的開發(fā)等還需進一步研究。

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