長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜差異代謝物及其關(guān)聯(lián)代謝通路分析

張鈺麟，陳泓帆，趙志平,,*，王 衛(wèi)，聶 鑫，程 杰，張 崟，劉達(dá)玉，徐躍成，羅淮良

（1.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106；2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；3.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；4.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610100；5.自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠，四川 自貢 643101）

大頭菜又名芥菜，是一種十字花科蕓苔屬草本植物，常用來(lái)制成醬腌菜，因其脆嫩爽口而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。大頭菜含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素以及膳食纖維[1-2]。食用大頭菜可降低某些癌癥、心血管和退行性疾病、免疫功能障礙以及老年黃斑變性的發(fā)生率[3]。新鮮大頭菜因含有辛辣味的異硫氰酸酯而不能直接食用，發(fā)酵后香而微辣。不同工藝條件及不同地區(qū)生產(chǎn)的大頭菜風(fēng)味具有明顯差異，曾凡坤等[4]利用蒸餾萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析了新工藝大頭菜、傳統(tǒng)腌制大頭菜和脫鹽大頭菜，分別檢測(cè)出68、56種和28種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。郭壯等[5]利用電子舌分析了四川成都、湖北襄陽(yáng)和山東菏澤大頭菜的滋味品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)山東菏澤大頭菜的酸味顯著高于其他兩種大頭菜，而咸味、苦味、鮮味和后味-B顯著低于其他兩種大頭菜。大頭菜代謝物與其后續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)密切，而目前關(guān)于代謝物的研究主要以短期發(fā)酵3～4個(gè)月大頭菜為對(duì)象，且聚焦于差異代謝物，涉及代謝通路的研究偏少。

通常，大頭菜經(jīng)過(guò)3～4個(gè)月短期發(fā)酵即可成熟[6-7]，作為佐餐菜食用。自貢市某大頭菜加工企業(yè)采用傳統(tǒng)工藝工業(yè)化生產(chǎn)了3種不同發(fā)酵年限的大頭菜；超長(zhǎng)周期發(fā)酵大頭菜主要用于制作菜肴，革新了其作為佐餐菜的傳統(tǒng)食用方式。長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜的代謝物組成與其后續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)密切相關(guān)，目前缺乏關(guān)于長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜代謝物及關(guān)聯(lián)代謝通路的研究報(bào)道。代謝組學(xué)常用的技術(shù)手段包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、核磁共振，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析如主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）可進(jìn)一步篩選出差異代謝物，最后將差異代謝物注釋到京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得受到擾動(dòng)的相關(guān)代謝通路[8]。

為了研究不同超長(zhǎng)周期發(fā)酵大頭菜代謝物差異和主要差異代謝物及其關(guān)聯(lián)代謝通路，本研究從自貢市某大頭菜加工企業(yè)采集了工業(yè)化生產(chǎn)的3種不同發(fā)酵年限的大頭菜，利用LC-MS/MS技術(shù)分析其差異代謝物，以期為定向調(diào)控大頭菜特征代謝物的生物合成提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵0、5、10 a大頭菜由自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠提供。

甲醇（≥99.90%）、乙腈（≥99.90%） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；2-氯苯丙氨酸（98.50%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜純）、甲酸銨（≥99.90%） 北京伊諾凱科技有限公司；Milli-Q超純水 上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QL-866旋渦混合器 拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司；Scientz-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；KW-100TDV高頻超聲波清洗器昆山舒美超聲儀器有限公司；UltiMate 3000基礎(chǔ)液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive Plus LC-MS系統(tǒng) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大頭菜加工工藝

大頭菜采收后用清水洗凈，去除泥沙和雜質(zhì)，自然風(fēng)干20～40 d。風(fēng)干結(jié)束后，添加6%～10%（底層、中層和上層占比分別為10%、30%、60%）食鹽腌制2～6 d后；翻缸添加2%～5%食鹽（每層占比同上）腌制2～5 d后起缸；再次添加2%～15%的黃糖拌勻，入壇密封發(fā)酵5 a以及10 a。

1.3.2 代謝物的提取

將樣本按照等比例凍干處理；移取1 000 μL甲醇復(fù)溶凍干粉末于離心管中，渦旋振蕩1 min后12 000 r/min離心10 min，取上清液450 μL至離心管中，用真空濃縮儀濃縮至盡干；加入150 μL 80%甲醇溶液配制的2-氯苯丙氨酸溶液復(fù)溶樣品，經(jīng)過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾。自每個(gè)待測(cè)樣本各取20 μL混合成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本，用剩余待測(cè)樣本進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為8 ℃，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣2 μL進(jìn)行梯度洗脫。流動(dòng)相：A相為5 mmol/L甲酸銨溶液，B相為乙腈，C相為0.1%甲酸溶液，D相為0.1%甲酸-乙腈；正離子模式C-D，負(fù)離子模式A-B。洗脫程序：0～1 min，98% A/C，2% B/D；1～9 min，98%～50% A/C，2%～50% B/D；9～12 min，50%～2% A/C，50%～98% B/D；12～13.5 min，2% A/C，98% B/D；13.5～14 min，2%～98% A/C，98%～2% B/D；14～17 min，負(fù)離子模式98% A相，2% B相，14～20 min，正離子模式98% C相，2% D相。

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助氣壓力10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，在m/z81～1 000范圍內(nèi)以70 000的分辨率進(jìn)行全掃描，并采用高能誘導(dǎo)裂解技術(shù)進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除不必要的MS/MS信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計(jì)

通過(guò)Proteowizard軟件（v3.0.8789）將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式。利用R（v3.3.2）的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊，得到包括m/z、保留時(shí)間以及峰面積等信息的矩陣，將矩陣進(jìn)行缺失值填補(bǔ)、歸一化等處理后導(dǎo)入至SIMCA（14.1）進(jìn)行PCA以及OPLS-DA。根據(jù)代謝物的分子質(zhì)量（分子質(zhì)量誤差＜3×10-5）對(duì)差異代謝物定性，然后根據(jù)MS/MS模式下獲得的碎片信息在HMDB、Metlin、Massbank、LipMaps、mzclound以及帕諾米克自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步匹配注釋獲得代謝物準(zhǔn)確信息。將篩選到的差異代謝物映射到MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)中（https://www.metaboanalyst.ca/），進(jìn)行相關(guān)代謝通路分析，并用超幾何檢驗(yàn)的P值確定其顯著性。利用R的pheatmap包進(jìn)行層次聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大頭菜代謝物的PCA

基于LC-MS/MS結(jié)合多元變量統(tǒng)計(jì)方法，以探究3種大頭菜代謝物的差異。為得到高質(zhì)量代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，通常需要進(jìn)行QC。QC樣本的聚集程度良好，且分布在原點(diǎn)附近，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，如圖1所示。0 a組、5 a組與10 a組均分布在不同的區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明3種不同發(fā)酵周期大頭菜代謝物之間存在顯著差異，因此基于PCA得分圖確定3個(gè)處理組[9]：0 a與5 a為A1，5 a與10 a為A2，0 a與10 a為A3。和Q2是評(píng)判PCA模型的主要參數(shù)，其中、Q2＝0.64表明所建立的PCA模型具有較好的可解釋度。

圖1 發(fā)酵大頭菜樣本的PCA模型得分散點(diǎn)圖Fig. 1 PCA score scatter plot of fermented kohlrabi samples

2.2 大頭菜代謝物的OPLS-DA

對(duì)3個(gè)處理組，采用OPLS-DA進(jìn)一步分析均得到了較好的分離，如圖2A1～C1所示。每個(gè)處理組中兩兩組別均顯著分離，說(shuō)明發(fā)酵周期的不同導(dǎo)致大頭菜代謝物種類及含量產(chǎn)生顯著差異，這可能與長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜中耐鹽微生物活力一直處于較高水平有關(guān)，如乳酸菌可產(chǎn)生多種氨基酸，通過(guò)厭氧發(fā)酵產(chǎn)生丙酸、乳酸；酵母菌可產(chǎn)生有機(jī)醇，基于利用還原糖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，使其更能適應(yīng)發(fā)酵過(guò)程的高鹽、高酸環(huán)境[10]，加之代謝物之間的相互作用使得組別間差異較明顯。OPLS-DA模型參數(shù)為均大于0.5，且＝0.988說(shuō)明該模型可以解釋和預(yù)測(cè)兩種大頭菜代謝物之間的差異。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型是否出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，采用200次循環(huán)迭代置換檢驗(yàn)，結(jié)果如圖2A2～C2所示。Q2回歸線與Y軸交點(diǎn)都在負(fù)半軸，表明OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

圖2 發(fā)酵大頭菜OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖與置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Scatter plots and permutation test of OPLS-DA model for fermented kohlrabi samples

2.3 大頭菜差異代謝物的篩選與鑒定

差異代謝物的篩選往往依托于OPLS-DA模型變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值大于1且學(xué)生式t檢驗(yàn)的P值小于0.05[11]，本研究以VIP＞1.3且P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。如圖3A所示，3個(gè)處理組差異代謝物主要以有機(jī)酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和核酸及其衍生物為主，發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)使得微生物通過(guò)酶促反應(yīng)利用大頭菜中底物能力增強(qiáng)。研究顯示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，鹽厭氧菌屬、鹽單胞菌屬和色鹽桿菌屬逐漸成為相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌群[12]；在高鹽的環(huán)境下，優(yōu)勢(shì)耐鹽菌群充分利用能源物質(zhì)，使得大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被降解成小分子物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸等[13]，這體現(xiàn)在A3較A2及A1組差異代謝物種類及個(gè)數(shù)均更加豐富。利用Venn圖對(duì)各處理組的差異代謝物分析表明，A1、A2、A3共鑒定到53、113種和174種差異代謝物，如圖3B所示。取3個(gè)處理組共有的19種差異代謝物定義為主要差異代謝物，包括3種氨基酸及其衍生物（L-苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、4-乙酰氨基丁酸），5種有機(jī)酸（6-羥基煙酸、3-(2-羥基苯基)丙酸、2-氨基苯磺酸、L-3-苯乳酸、煙酸），3種核酸及其衍生物（N-D-核糖嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、7-甲基腺嘌呤），2種脂肪酸（辛酸、癸二酸），2種酮糖（β-D-果糖-6-磷酸、D-核酮糖），1種黃酮類物質(zhì)（根皮苷），1種酚類物質(zhì)（苯酚），1種酚酸（水楊酸），1種生物堿（β-咔啉）。

圖3 大頭菜差異代謝物分類信息（A）及Venn圖（B）Fig. 3 Classification information (A) and Venn diagram (B) for differential metabolites of fermented kohlrabi

氨基酸及其衍生物在植物中發(fā)揮各種功能，除了參與合成蛋白質(zhì)外，還與能量代謝、植物的脅迫反應(yīng)等有關(guān)。發(fā)酵周期的不同使得微生物代謝功能基因表達(dá)程度不同，尤其是氨基酸的相關(guān)代謝活動(dòng)[14]。氨基酸的種類直接決定發(fā)酵蔬菜的滋味，Xiao Yangsheng等[15]通過(guò)對(duì)四川泡菜、江西鹽菜和東北酸菜研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蔬菜都富含谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸，均在本研究中被檢出。徐亞洲等[16]研究證實(shí)，泡菜發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量變化趨勢(shì)并非一致，這在本研究中體現(xiàn)在天冬氨酸為上調(diào)的差異代謝物，而絲氨酸與丙氨酸為下調(diào)的差異代謝物。多種氨基酸共同作用有助于大頭菜滋味的形成，賦予大頭菜鮮辣等味覺(jué)特征。

有機(jī)酸是植物光合及呼吸作用的中間產(chǎn)物，其含量直接反映植物的代謝活性[17]。本研究鑒定的大部分有機(jī)酸含量隨著發(fā)酵周期延長(zhǎng)而增加。研究顯示，發(fā)酵蔬菜中有機(jī)酸主要來(lái)源于蔬菜原料及發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝作用。隨著發(fā)酵周期的增加，乳酸及乙酸等有機(jī)酸由于糖代謝作用逐漸積累增加[18-19]，郝懿[20]研究發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵香椿泡菜乳酸及乙酸含量變化也有著相同結(jié)果，且加鹽量4%香椿泡菜乳酸桿菌隨發(fā)酵周期延長(zhǎng)逐步成為優(yōu)勢(shì)菌群；肖陽(yáng)生[14]通過(guò)監(jiān)測(cè)四川泡菜發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸含量逐漸升高，且與乳桿菌屬呈正相關(guān)。煙酸也被稱為VB3，存在于各種植物組織中，其是一種水溶性的維生素，具有舒張血管的作用。L-3-苯乳酸被認(rèn)為是一種可逆的混合型多酚氧化酶抑制劑[21]，其在大頭菜發(fā)酵過(guò)程中起抗褐變作用，為后續(xù)有關(guān)產(chǎn)品護(hù)色以及延長(zhǎng)貨架期提供一定理論支持。

次生代謝物以產(chǎn)量較大的初生代謝物為前體，通過(guò)糖代謝、莽草酸延伸、氨基酸延伸、乙酸延伸途徑所合成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。次生代謝物種類很多，包括生物堿、色素、抗生素等。由于色素含量的不同，0、5 a和10 a大頭菜的色澤表現(xiàn)出顯著差異，如圖4所示。酚酸及其衍生物廣泛分布在植物中[22]，發(fā)酵過(guò)程中酚酸的積累有助于大頭菜口感、酸度、風(fēng)味的形成[23]，如在芥菜和客家擦菜中可檢測(cè)出40余種酚酸[24]，與本研究檢出的大多數(shù)酚酸變化趨勢(shì)一致，但主要差異代謝物水楊酸與傳統(tǒng)發(fā)酵的芥菜變化趨勢(shì)不一致。傳統(tǒng)芥菜水楊酸含量隨發(fā)酵周期延長(zhǎng)含量逐漸下降，而本研究水楊酸含量呈上升趨勢(shì)。與水楊酸代謝有關(guān)的酶為苯丙氨酸解氨酶，其通過(guò)介導(dǎo)肉桂酸途徑從而合成水楊酸。鄒同雷等[25]發(fā)現(xiàn)龍須菜中苯丙氨酸解氨酶在高鹽濃度下活性增加，而5 a和10 a大頭菜的食鹽含量高于0 a，因此5 a和10 a大頭菜水楊酸含量顯著高于0 a。生物堿主要為植物中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物，其種類很多，主要包括有機(jī)胺類、異喹啉類、吡啶類等，通常具有抗腫瘤[26]、鎮(zhèn)痛[27]的作用。本研究鑒定到的主要差異生物堿為β-咔啉，其含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，β-咔啉生物堿在新藥開(kāi)發(fā)上具有廣闊的前景，基于其在長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜中的含量變化規(guī)律，后續(xù)可針對(duì)5 a大頭菜進(jìn)行相關(guān)功能性代謝物的生物合成調(diào)控。

圖4 發(fā)酵0（A）、5 a（B）及10 a（C）大頭菜剖面圖Fig. 4 Cross-sectional views of kohlrabi samples fermented for 0 (A),5 (B) and 10 years (C)

2.4 大頭菜主要差異代謝物熱圖分析

為了更好地判斷主要差異代謝物在發(fā)酵大頭菜中的代謝模式，以大頭菜主要差異代謝物的相對(duì)含量做層次聚類分析，結(jié)果以熱圖的形式展示，如圖5所示，主要差異代謝物在各個(gè)組別中含量分布具有一定的規(guī)律特征。0 a中3種下調(diào)的主要差異代謝物與其他兩組差別明顯，其中以3-(2-羥基苯基)丙酸和β-D-果糖-6-磷酸變化最為顯著。5 a組中含量較高的有β-咔啉、癸二酸、辛酸、苯酚，它們多為脂肪酸、生物堿和酚類物質(zhì)，可能對(duì)大頭菜發(fā)酵前期褐色的形成起重要作用。10 a中含量較高的有根皮苷、L-苯丙氨酸、2-氨基苯磺酸、L-3-苯乳酸、煙酸、6-羥基煙酸、N-D-核糖嘌呤。

圖5 發(fā)酵大頭菜中主要差異代謝物層級(jí)聚類分析熱圖Fig. 5 Heatmap for hierarchical clustering analysis of major differential metabolites in fermented kohlrabi samples

2.5 主要差異代謝物通路分析

植物的生長(zhǎng)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的代謝過(guò)程，不能僅僅從單一物質(zhì)表達(dá)量的高低進(jìn)行整體判斷[28]，因此需要對(duì)主要差異代謝物所富集的代謝通路進(jìn)行分析。將主要差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，主要富集到苯丙氨酸代謝（Impact＝0.47）、磷酸戊糖途徑（Impact＝0.13）、果糖和甘露糖代謝（Impact＝0.21）3 條代謝通路上，如圖6所示。芳香族氨基酸除了作為蛋白質(zhì)的組成成分外，還是許多次生代謝物生物合成的前體[29]，通過(guò)莽草酸途徑在質(zhì)體內(nèi)部合成。由于缺乏完整的糖酵解過(guò)程，使其只能通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸特異性的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體從胞漿導(dǎo)入。L-苯丙氨酸是許多酚類化合物的前體物質(zhì)，包括木質(zhì)素、縮合單寧以及苯丙烷類物質(zhì)。在一些植物中，苯丙氨酸生物合成的主要途徑是芳香酸途徑[30]。β-D-果糖-6-磷酸作為連接磷酸戊糖途徑與果糖和甘露糖代謝的主要代謝產(chǎn)物，其含量隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)而下降，可能是由于6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶活性減弱，使來(lái)源于糖酵解過(guò)程的α-D-葡萄糖-6-磷酸向其轉(zhuǎn)化能力減弱；作為呼吸作用的底物，通過(guò)三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑及果糖和甘露糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷以維持正常的生命活動(dòng)[31]。

圖6 主要代謝通路整合分析圖Fig. 6 Integrated analysis of major metabolic pathways

3 結(jié) 論

基于LC-MS/MS探究了工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵0、5 a和10 a的傳統(tǒng)大頭菜代謝物的差異，差異代謝物主要以有機(jī)酸、氨基酸和核苷酸衍生物為主?；赩enn圖得到3個(gè)處理組共有的19種主要差異代謝物，將主要差異代謝物通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出3 條最顯著的代謝通路，為基于代謝通路定向調(diào)控大頭菜代謝物合成提供一定的理論基礎(chǔ)。

大頭菜在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，代謝物種類繁多。深入解析長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜代謝物組成及變化規(guī)律是大頭菜后續(xù)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的前提，也是未來(lái)的主要研究方向之一。此外，微生物是影響發(fā)酵大頭菜代謝物組成最為關(guān)鍵的因素之一，利用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)深度揭示工業(yè)化生產(chǎn)長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)，明確功能微生物及活性基因，闡明微生物調(diào)控長(zhǎng)期發(fā)酵大頭菜代謝物合成的機(jī)理是未來(lái)的研究方向。同時(shí)，基于代謝通路利用定向調(diào)控技術(shù)加速特征代謝產(chǎn)物生物合成進(jìn)程也是工業(yè)化生產(chǎn)亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。