貝萊斯芽孢桿菌對(duì)濃香型白酒酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

楊 陽(yáng)，李子健,2，張玲玲，王 洪，黃 丹,2，羅惠波,2,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒是中國(guó)白酒中較為典型的代表，以糧谷為原料，采用中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾調(diào)而成。濃香型白酒生產(chǎn)采用的是復(fù)雜且獨(dú)特的半開放、固態(tài)發(fā)酵模式[1]，其中酒醅發(fā)酵過程是影響濃香型白酒酒質(zhì)好壞的一個(gè)重要因素[2]。

酒醅是微生物發(fā)酵的主要載體和白酒呈香物質(zhì)的直接來(lái)源[3]，其微生物來(lái)源于大曲及窖泥，種類豐富，細(xì)菌和真菌屬數(shù)量分別高達(dá)496種和155種，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）等是優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬，哈薩克斯坦酵母菌屬（Kazachstania）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、酵母菌屬（Saccharomyces）等為優(yōu)勢(shì)的真菌屬[4-5]。近年來(lái)為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)白酒風(fēng)味物質(zhì)合成的影響因素，白酒功能微生物對(duì)釀酒微生物組結(jié)構(gòu)及功能的影響越來(lái)越受到關(guān)注。王鵬[6]將地衣芽孢桿菌強(qiáng)化后的大曲應(yīng)用到窖池中，改變了酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，顯著提高了酒醅中芳香族化合物的含量。黃曉寧等[7]將優(yōu)選得到的具有產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力的地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌分別應(yīng)用于清香型白酒釀造過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過強(qiáng)化發(fā)酵后均出現(xiàn)了差異代謝物，且4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和四甲基吡嗪含量均顯著增加。周新虎等[8]將4 株篩選得到的高產(chǎn)蛋白酶活性和液化酶活性的芽孢桿菌制成復(fù)合培養(yǎng)液應(yīng)用到調(diào)味型酒的堆積和窖池發(fā)酵中，增加了酒體中雜環(huán)化合物的種類和含量。芽孢桿菌屬是酒醅微生物中的重要菌屬之一，能分泌水解淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等底物的酶類，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程的順利進(jìn)行[9]。而貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus νelezensis）是芽孢桿菌屬中的一種，具有產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的特性[10]。貝萊斯芽孢桿菌在白酒領(lǐng)域已有報(bào)道，楊斌等[11]從大曲中獲得1 株具有高發(fā)酵力的貝萊斯芽孢桿菌；胡寶東等[12]從醬香型大曲中分離出了甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（現(xiàn)已歸屬于貝萊斯芽孢桿菌），因其能產(chǎn)高活性的中性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶等，對(duì)提高醬香型大曲的品質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前貝萊斯芽孢桿菌在酒醅微生物組中的研究還鮮有報(bào)道。因此，本研究以貝萊斯芽孢桿菌為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，探究與未接種的對(duì)照組酒醅相比微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，以期提高濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌FZB42由四川某酒廠中高溫大曲中篩選出。本研究所用酒醅、大曲、黃水、高粱、糠殼均由四川省宜賓市某酒廠提供。

乙酸正戊酯 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA）、Na2HPO4、NaH2PO4、蝸牛酶、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；CHCl3（分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；異丙醇 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LYNX 6000高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；HVE全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；LS-l201生化培養(yǎng)箱 美國(guó)Fisher Scientific公司；50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；5975B-7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；ST2100 pH計(jì) 奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

采用濃香型白酒生產(chǎn)工藝流程在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行發(fā)酵。將高粱粉碎為4～6 瓣，再加入約高粱質(zhì)量70%的80 ℃以上的熱水，潤(rùn)糧4 h；將約高粱質(zhì)量20%的糠殼清蒸30 min；配料時(shí)糧糟比為1∶4.5，再與清蒸后的糠殼混合均勻上甑蒸餾，蒸完酒后再蒸50 min左右，使高粱達(dá)到熟而不黏、內(nèi)無(wú)生心；攤晾時(shí)潑灑高粱質(zhì)量20%的50 ℃溫水補(bǔ)充水分，攤晾至25 ℃；加入高粱質(zhì)量20%的大曲、高粱質(zhì)量3%的黃水，實(shí)驗(yàn)組加入高粱質(zhì)量15%的濃度為106CFU/mL的菌液，對(duì)照組以蒸餾水補(bǔ)足水分，分別均勻混合后，裝入滅菌冷卻后的玻璃瓶中，裝瓶量為0.65 kg，要求疏松程度適中且各處均勻，用封口膜封口，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各18 瓶。將密封好的36個(gè)玻璃瓶放入生化培養(yǎng)箱發(fā)酵，根據(jù)酒廠溫度曲線進(jìn)行溫度設(shè)置，初始溫度為20 ℃，以0.5 ℃/d升至23 ℃，再以2 ℃/d升至29 ℃后以1 ℃/d升至32 ℃，保持20 d，再以0.5 ℃/d的降溫幅度降至26 ℃，發(fā)酵期結(jié)束，共45 d。在發(fā)酵的第0、6、12、22、32、45天取樣檢測(cè)，每組每次各取3 瓶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酒醅風(fēng)味代謝物組分析

取3 g酒醅于20 mL頂空瓶中，加入2 g NaCl、20 μL內(nèi)標(biāo)物（乙酸正戊酯），50 ℃平衡5 min，插入50/30 μm DVB/CAR on PDMS固相微萃取頭，萃取45 min，解吸3.5 min[13]。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度50 ℃，維持2 min，然后以4 ℃/min升溫至230 ℃，維持5 min；氦氣以1 mL/min的恒定流速用作柱載氣。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度100 ℃，恒壓10 Pa，全掃描。

1.3.3 酒醅微生物DNA的提取和測(cè)序

提取酒醅總基因組DNA[14]，以引物對(duì)338F（5'-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列中的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物對(duì)ITS5F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）、ITS1R（5'-GCTG CGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)真菌ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。由上海美吉生物科技有限公司在Illumina MiSeq 2500平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

按照QIIME 2標(biāo)準(zhǔn)流程對(duì)原始序列進(jìn)行處理。使用DADA2對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量過濾、去噪、合并和去除嵌合體[15]。使用多樣性插件計(jì)算α多樣性指數(shù)。在R（version 4.0.3）的vegan（version 2.5-7）軟件包中進(jìn)行了物種組成分析、相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）。利用SIMCA-P 13軟件建立偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）模型，對(duì)風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化趨勢(shì)分析，并篩選差異揮發(fā)性風(fēng)味化合物。利用R語(yǔ)言繪制層次聚類-熱圖和計(jì)算酒醅微生物與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)間的Spearman相關(guān)性系數(shù)，使用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物α多樣性的影響

由表1可知，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組酒醅細(xì)菌群落豐富度指數(shù)Chao1具有先降低再升高的趨勢(shì)，而多樣性指數(shù)Shannon具有先升高再逐漸降低趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組酒醅真菌群落豐富度指數(shù)Chao1具有先升高后降低的趨勢(shì)，而多樣性指數(shù)Shannon呈持續(xù)增加的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組酒醅細(xì)菌群落和真菌群落的豐富度及多樣性與對(duì)照組酒醅相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

表1 酒醅發(fā)酵過程中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組α多樣性Table 1 α-Diversity of microbial communities in the experimental and control groups during the fermentation process

2.2 貝萊斯芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落演替規(guī)律的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中分別共檢測(cè)到107個(gè)屬和152個(gè)屬的細(xì)菌微生物。如圖1A所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度＞0.05%）為沙雷氏菌屬（Serratia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、卡氏伯克霍爾德菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）、未分類的腸桿菌屬（unclassified Enterobacteriaceae）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）。沙雷氏菌屬相對(duì)豐度在對(duì)照組酒醅0～22 d呈下降趨勢(shì)，在22～45 d逐漸上升。而實(shí)驗(yàn)組酒醅中沙雷氏菌屬相對(duì)豐度屬在0～6 d呈下降趨勢(shì)而在6～45 d逐漸上升。乳桿菌屬相對(duì)豐度在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅的12～22 d均呈現(xiàn)較高的豐度，其中對(duì)照組酒醅第22天乳桿菌屬相對(duì)豐度達(dá)到75.4%。對(duì)照組酒醅與實(shí)驗(yàn)組酒醅中卡氏伯克霍爾德菌屬、未分類的腸桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、醋酸桿菌屬、魏斯氏菌屬均呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。對(duì)照組酒醅中芽孢桿菌屬相對(duì)豐度含量極低為0.06%～1.7%。而實(shí)驗(yàn)組酒醅中芽孢桿菌屬相對(duì)豐度在0～6 d呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第6天達(dá)到最大值23.9%，隨后在第6～22天開始逐漸減少，第22～45天芽孢桿菌相對(duì)豐度幾乎消失。ANOSIM分析表面實(shí)驗(yàn)組酒醅與對(duì)照組酒醅細(xì)菌群落（R＝-0.077 8，P＝0.802）不存在明顯差異。

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中分別共檢測(cè)到93個(gè)和115個(gè)屬的真菌微生物。如圖1B所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅中優(yōu)勢(shì)真菌屬（相對(duì)豐度＞0.05%）為熱子囊菌屬（Thermoascus）、未分類的曲霉菌屬（unclassified Aspergillaceae）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、unclassified Rozellomycota、紅曲霉屬（Monascus）。對(duì)照組酒醅和實(shí)驗(yàn)組酒醅真菌群落在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)高度相似的變化過程。熱子囊菌屬相對(duì)豐度在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中占主要地位，并且在兩組中都呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。嗜熱真菌屬在實(shí)驗(yàn)組酒醅和對(duì)照組酒醅的32～45 d具有較高豐度。畢赤酵母屬和紅曲霉屬分別在對(duì)照組酒醅的第32天和第45天時(shí)達(dá)到最大豐度27%和10.3%。對(duì)照組酒醅和實(shí)驗(yàn)組酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)在第12天開始逐漸復(fù)雜，直到發(fā)酵過程結(jié)束。ANOSIM分析表面實(shí)驗(yàn)組酒醅與對(duì)照組酒醅真菌群落（R＝-0.103 7，P＝0.916）不存在明顯差異。

復(fù)雜的微生物群落對(duì)其他物種的入侵具有一定的抵御能力——系統(tǒng)魯棒性[16]。由于魯棒性的存在微生物群落結(jié)構(gòu)面對(duì)外源物種擾動(dòng)時(shí)不會(huì)發(fā)生太大的改變，只會(huì)發(fā)生微小的變化[17]。貝萊斯芽孢桿菌的接種不可避免會(huì)與酒醅原微生物群落發(fā)生相互作用，導(dǎo)致發(fā)酵過程中微生物的相對(duì)豐度出現(xiàn)短暫變化。而酒醅中微生物群落認(rèn)為是一種復(fù)雜的微生物集合體具有系統(tǒng)魯棒性。本研究中接種貝萊斯芽孢桿菌并沒有打破該生態(tài)的系統(tǒng)魯棒性，因此不足以改變整個(gè)發(fā)酵過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)。貝萊斯芽孢桿菌受酸度和酒精度的影響較大[18]。酒醅的酸度和乙醇含量在發(fā)酵過程中會(huì)不斷增加[6]，使芽孢桿菌生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致在22～45 d對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅的芽孢桿菌相對(duì)豐度接近消失。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅真菌群落表現(xiàn)出極為相似的變化規(guī)律且兩組群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異，說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌的接種對(duì)真菌群落的影響較小。

圖1 酒醅發(fā)酵過程中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組微生物群落演替規(guī)律Fig. 1 Succession of microbial communities in the control and experimental groups during the fermentation process

2.3 貝萊斯芽孢桿菌對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)照組酒醅發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有46種，其中酯類物質(zhì)23種、醇類物質(zhì)12種、酸類物質(zhì)4種、酚類物質(zhì)3種、醚類物質(zhì)2種、酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)各1種。實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有44種，其中酯類物質(zhì)22種、醇類物質(zhì)11種、酸類物質(zhì)4種、酚類物質(zhì)3種、醚類物質(zhì)2種、酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)各1種。圖2中每種成分含量用不同顏色表示，紅色越深代表其含量越多，而藍(lán)色越深代表其含量越少。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較高的有己酸（D04）、己酸乙酯（A03）、乙酸（D01）、乳酸乙酯（A01）、乙酸乙酯（A08）、棕櫚酸乙酯（A04）、庚酸乙酯（A05）、辛酸乙酯（A02）。其中兩組酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最高的是己酸。對(duì)照組酒醅中己酸含量在發(fā)酵過程中呈平穩(wěn)狀態(tài)，而實(shí)驗(yàn)組酒醅己酸含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在第12天達(dá)到最高值。己酸乙酯在兩組酒醅發(fā)酵過程中都呈不斷增長(zhǎng)趨勢(shì)，均在第45天達(dá)到最大值。

圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析Fig. 2 Heatmap analysis of volatile flavor compounds in the control and experimental groups during the fermentation process

由于酚類、醚類、酮類和醛類物質(zhì)所檢測(cè)到的種類和含量較少，因此將其歸為其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。如圖3所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅中總酯、總酸、總醇及其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量具有相同變化趨勢(shì)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅的總酯含量在發(fā)酵過程中逐漸增加直至發(fā)酵過程結(jié)束，總酸、總醇和其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。與對(duì)照組酒醅相比實(shí)驗(yàn)組酒醅總酯含量在12～45 d顯著增加，總酸含量在6～45 d顯著增加，總醇含量在第22天時(shí)顯著降低隨后在32～45 d顯著增加，其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)僅在第45天時(shí)顯著增加。

圖3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅發(fā)酵過程中總酯（A）、總酸（B）、總醇（C）和其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（D）含量的變化情況Fig. 3 Changes in contents of total esters (A), total acids (B), total alcohols (C) and other volatile flavor substances (D) in the control and experimental groups during the fermentation process

微生物的相互作用會(huì)影響參與食品發(fā)酵的微生物的代謝行為，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生一定的變化[19]。因此接種貝萊斯芽孢桿菌會(huì)對(duì)原微生物群落的代謝活性產(chǎn)生一定的影響。酯類、酸類和醇類等香味物質(zhì)是濃香型白酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)，它們彼此相互協(xié)調(diào)共同構(gòu)成濃香型白酒獨(dú)特的風(fēng)味[20]。酸類、酯類、醇類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間會(huì)相互轉(zhuǎn)化[21]，因此實(shí)驗(yàn)組酒醅中酸類、酯類、醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生顯著性改變可能不只是由于原微生物群落的代謝活性發(fā)生改變所導(dǎo)致，還可能與它們自身之間相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。酸類物質(zhì)在濃香型白酒中主要起呈味和協(xié)調(diào)作用[22]，更是在酒醅中作為酯類物質(zhì)合成的重要前體物，因此酸類物質(zhì)含量的增加不可避免會(huì)使酒醅中酯類物質(zhì)含量增加。酒醅中酯類物質(zhì)的形成不單是靠大曲中酯化酶以及脂肪酶作用下由酸和醇反應(yīng)生成，還與微生物直接代謝有關(guān)[21,23]。因此實(shí)驗(yàn)組酒醅中酯類物質(zhì)增加一方面可能與酸類物質(zhì)增加有關(guān)，另一方面可能與貝萊斯芽孢桿菌接種后改變了原微生物群落有關(guān)。

2.4 貝萊斯芽孢桿菌影響酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異分析

為了進(jìn)一步探究對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，利用SIMCA-P 13軟件基于兩組酒醅發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量結(jié)果建立了PLS-DA分類模型進(jìn)行可視化分析，如圖4所示。PLS-DA是基于PLS法回歸的一種判別方式，因其分析有監(jiān)督，預(yù)設(shè)了分組變量，可彌補(bǔ)主成分分析方法的不足，強(qiáng)化組間差異[24]。通過PLS-DA模型分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在第0天時(shí)無(wú)顯著差異。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在第6天時(shí)開始出現(xiàn)差異直至發(fā)酵過程結(jié)束。模型分類良好，模型的解釋變量和預(yù)測(cè)能力分別為0.809和0.647。

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅PLS-DA散點(diǎn)圖Fig. 4 PLS-DA scatter plot for the control and experimental groups

變量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）可以量化PLS-DA每個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)度，是PLS-DA變量的重要性因子。如圖5所示，VIP值越大，變量在兩組酒醅間的差異越顯著[25]。為了篩選出兩組酒醅間差異的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，確定了兩組酒醅間有顯著差異的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)15種，包含丁酸（VIP＝1.695）、己酸（VIP＝1.592）、八乙二醇（VIP＝1.448）、正戊酸（VIP＝1.387）、2,4-二叔丁基苯酚（VIP＝1.335）、己酸己酯（VIP＝1.294）、四甘醇（VIP＝1.289）、乙酸丁酯（VIP＝1.137）、苯酚（VIP＝1.118）、15-冠醚-5（VIP＝1.116）、戊酸丁酯（VIP＝1.112）、糠醇（VIP＝1.095）、對(duì)甲基苯酚（VIP＝1.084）、庚酸乙酯（VIP＝1.044）、戊酸乙酯（VIP＝1.032）。與對(duì)照組酒醅相比實(shí)驗(yàn)組酒醅中丁酸、己酸、正戊酸、2,4-二叔丁基苯酚、己酸乙酯、苯酚、15-冠醚-5、糠醇、對(duì)甲基苯酚、庚酸乙酯、戊酸乙酯含量顯著增加，而八乙二醇、四甘醇、乙酸丁酯、戊酸丁酯含量顯著降低。其中丁酸、己酸、八乙二醇是差異最大的前3種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

接種貝萊斯芽孢桿菌后不會(huì)立刻改變酒醅中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，隨著酒醅發(fā)酵過程的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組酒醅微生物群落及代謝活性與對(duì)照組酒醅相比發(fā)生變化，從而導(dǎo)致差異揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的出現(xiàn)。兩組中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異最大的是酯類，共有5種，占總差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的1/3，說(shuō)明接種貝萊斯芽孢桿菌對(duì)酒醅酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響最大。丁酸和己酸是濃香型白酒中重要的酸類物質(zhì)，其中己酸是作為濃香型白酒中產(chǎn)窖香的主要成分之一[22]，丁酸起呈味助香的作用同時(shí)還是己酸生成過程中的前提物質(zhì)[26]，并且它們分別是合成丁酸乙酯和己酸乙酯的重要前體物，因此實(shí)驗(yàn)組酒醅中己酸乙酯含量的增加與丁酸和己酸含量的增加有密切的聯(lián)系。己酸乙酯是濃香型白酒中的主要特征風(fēng)味物質(zhì)，其含量的高低直接決定了濃香型白酒的品質(zhì)[27]。

圖5 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅PLS-DA VIP值Fig. 5 PLS-DA VIP value for differential volatile flavor compounds between the control and experimental groups

2.5 酒醅微生物與差異風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析

進(jìn)行了基于Spearman等級(jí)相關(guān)性（|ρ|＞0.5和P＜0.05）的網(wǎng)絡(luò)分析，以評(píng)估對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組酒醅微生物（相對(duì)豐度＞0.05%）與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系，利用Cytoscape軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析。如圖6A所示，對(duì)照組酒醅中有3種細(xì)菌和8種真菌表現(xiàn)出與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。魏斯氏菌屬與糠醇、對(duì)甲基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、戊酸乙酯、庚酸乙酯呈負(fù)相關(guān)，而相對(duì)豐度較高的沙雷氏菌屬僅與戊酸丁酯呈負(fù)相關(guān)。紅曲霉屬和曲霉菌屬與對(duì)甲基苯酚，2,4-二叔丁基苯酚，戊酸乙酯，庚酸乙酯呈正相關(guān)，此外紅曲霉屬還與糠醇、苯酚呈正相關(guān)。而熱子囊菌屬卻與對(duì)甲基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、戊酸乙酯、庚酸乙酯呈負(fù)相關(guān)。畢赤酵母屬與戊酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸丁酯呈正相關(guān)。如圖6B所示，實(shí)驗(yàn)組酒醅中有4種細(xì)菌和6種真菌表現(xiàn)出與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。乳桿菌屬與2,4-二叔丁基苯酚、對(duì)甲基苯酚、苯酚、己酸呈正相關(guān)。而未分類的腸桿菌屬與對(duì)甲基苯酚、苯酚、己酸呈負(fù)相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)組酒醅中紅曲霉屬僅與乙酸丁酯呈正相關(guān)，畢赤酵母屬和威克漢姆酵母屬僅與己酸乙酯呈正相關(guān)。而芽孢桿菌屬在實(shí)驗(yàn)組酒醅中僅與己酸乙酯呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，與己酸乙酯呈負(fù)相關(guān)的還有熱子囊菌屬和魏斯氏菌屬。

在對(duì)照組酒醅中紅曲霉屬是與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有最多相關(guān)性的微生物。曲霉菌屬和紅曲霉菌屬是酒醅中重要的功能微生物，它們可代謝產(chǎn)生對(duì)白酒釀造過程中至關(guān)重要的糖化酶和酯化酶等[9,28]，而酯化酶能催化酸類和醇類合成酯類物質(zhì)，因此在兩組酒醅中曲霉菌屬和紅曲霉菌屬均表現(xiàn)出與酯類差異性揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)。然而，在實(shí)驗(yàn)組酒醅中，乳桿菌屬與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有最多相關(guān)性。這一結(jié)果也表現(xiàn)出貝萊斯芽孢桿菌的生物擾動(dòng)會(huì)改變微生物的原位代謝活性。乳桿菌屬能代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸、乙醇和CO2[29]，而己酸菌可以利用乙酸和乙醇生成己酸[30]，己酸和乙醇又能夠被酒醅中的酯化酶催化生成己酸乙酯，因此在實(shí)驗(yàn)組酒醅中己酸乙酯能和乳桿菌屬呈正相關(guān)。梭狀芽孢桿菌在酒醅中的含量極少（＜0.01%），主要存在與窖泥中[31]，而梭狀芽孢桿菌是產(chǎn)生丁酸和己酸的主要微生物。胡承等[32]發(fā)現(xiàn)窖泥中硫酸還原菌、硝酸還原菌的存在并不直接產(chǎn)生呈香物質(zhì)，但是它們與己酸菌等產(chǎn)氫菌相耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)“種間氫轉(zhuǎn)移”，促進(jìn)己酸菌等功能菌生長(zhǎng)。本研究雖未檢測(cè)到梭狀芽孢桿菌屬，但接種貝萊斯芽孢桿菌后的生物擾動(dòng)可能使微生物間發(fā)生某種相互關(guān)系，導(dǎo)致梭狀芽孢桿菌屬含量發(fā)生改變從而使得己酸和丁酸增加。因此在實(shí)驗(yàn)組酒醅中芽孢桿菌屬并不會(huì)直接參與己酸乙酯的合成，芽孢桿菌屬與己酸乙酯間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系并不代表芽孢桿菌屬的增殖會(huì)抑制己酸乙酯的合成，在復(fù)雜的微生物群落中，貝萊斯芽孢桿菌的接種反而改變了微生物間的代謝活性使得己酸和己酸乙酯的含量增加。

圖6 相對(duì)豐度大于0.05%的細(xì)菌和真菌與差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間顯著相關(guān)性的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 6 Co-occurrence network diagram showing significant correlation between bacteria and fungi with relative abundance greater than 0.05%and differential volatile flavor compounds

3 結(jié) 論

結(jié)果顯示添加貝萊斯芽孢桿菌酒醅微生物的豐富度和均勻度并沒有發(fā)生顯著改變，且微生物群落結(jié)構(gòu)在整個(gè)發(fā)酵過程中也沒有顯著差異。然而，實(shí)驗(yàn)組酒醅中酸類、酯類、醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與對(duì)照組酒醅相比都出現(xiàn)明顯增加，兩組間共有15種顯著差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)組酒醅中己酸和己酸乙酯的含量顯著增加，己酸與乳桿菌屬有顯著正相關(guān)，己酸乙酯與畢赤酵母屬和威克漢姆酵母屬呈正相關(guān)，與熱子囊菌屬、芽孢桿菌和魏斯氏菌屬呈負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果揭示了貝萊斯芽孢桿菌對(duì)濃香型酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。