張風(fēng)亭,胡 坦,潘思軼
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)
橙皮苷是存在于柑橘類水果中的一種黃烷酮化合物,具有抗炎、抗氧化、促進成骨細胞分化等多種藥理活性[1],除此之外,還可用作食品添加劑、果蔬保鮮劑等[2]。但由于橙皮苷的水溶性較差(2 mg/100 g)[3],生物利用度較低,因此,必須對其進行改性,增加水溶性,從而擴大橙皮苷在醫(yī)藥、食品以及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。
目前國內(nèi)外對橙皮苷改性方法研究較多的是生物轉(zhuǎn)化法[4]。生物法避免了化學(xué)法存在的反應(yīng)不易控制、反應(yīng)條件劇烈以及環(huán)境污染嚴重等缺陷,憑借其反應(yīng)效率高、特異性強、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢在一定程度上取代了化學(xué)法[5]。生物轉(zhuǎn)化包括酶法和微生物發(fā)酵法。近年來,微生物發(fā)酵法因其易于培養(yǎng)、菌種資源豐富、產(chǎn)生的酶系強大等特點,在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域備受關(guān)注。李小莉[6]在篩選高產(chǎn)且傳代穩(wěn)定的橙皮苷酶生產(chǎn)菌株時發(fā)現(xiàn),雪腐鐮刀菌(Fusarium nivale)是最佳的發(fā)酵菌株。劉曉晶[7]利用雪腐鐮刀菌發(fā)酵產(chǎn)橙皮苷酶的特性研究并優(yōu)化了橙皮苷改性的工藝條件。橙皮苷酶和柚皮苷酶都是含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的復(fù)合酶,均可用于橙皮苷的轉(zhuǎn)化,一般途徑為橙皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的作用下生成橙皮素單葡萄糖苷(hesperitin-7-O-glucoside,HMG),HMG在β-D-葡萄糖苷酶的作用下繼續(xù)生成橙皮素[8-9]。鄭美瑜等[10]研究發(fā)現(xiàn),柚皮苷酶可以更快酶解橙皮苷。與此同時,國外研究報道指出[11-12],從韓國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的醬油曲霉(Aspergillus sojae)具有較強的柚皮苷酶活性,該酶作用于橙皮苷得到了溶解度較高的HMG。但迄今為止,鮮有關(guān)于該菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化橙皮苷的研究報道。因此,本研究基于雪腐鐮刀菌和醬油曲霉均可轉(zhuǎn)化橙皮苷這一理論,以雪腐鐮刀菌、醬油曲霉和混合菌(雪腐鐮刀菌-醬油曲霉1∶1)這3種菌株作為出發(fā)菌株,比較其發(fā)酵轉(zhuǎn)化橙皮苷的效果,旨在篩選出更為適合橙皮苷轉(zhuǎn)化的菌株。
1.1.1 材料與菌種
橙皮苷(純度95%) 上海源葉生物科技有限公司;雪腐鐮刀菌(14 mm試管斜面)、醬油曲霉(凍干粉) 北納生物科技有限公司。
1.1.2 試劑
醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)、橙皮苷、HMG及橙皮素標準品 上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、88%甲酸(分析純) 武漢飛揚生物科技有限公司;葡萄糖 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;酵母膏(微生物級)、三水合磷酸氫二鉀(分子生物級)生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,馬鈴薯浸出粉5 g,瓊脂14 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然,121 ℃滅菌15 min;液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g,酵母膏5 g,K2HPO4·3H2O 2 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然,121 ℃滅菌15 min。
PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;LK50T顯微鏡 天津徠科光學(xué)儀器有限公司;LX-C35L高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;AllegraX-30R高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特有限公司;THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;e2695高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、MA 01757超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源及UNIFI科學(xué)信息系統(tǒng))美國Waters公司。
1.3.1 菌種活化
雪腐鐮刀菌:試管斜面經(jīng)表面消毒之后,在超凈工作臺中打開,用無菌接種鋤和接種鏟切0.5 cm×0.5 cm的小正方形塊,然后將其平放至平板中心,28 ℃培養(yǎng)4 d,菌種長出即可使用。
醬油曲霉:將0.3~0.5 mL無菌水或液體培養(yǎng)基注入凍干管中,輕輕敲打,充分溶解成菌懸液。吸取菌懸液,均勻打入2個平板瓊脂表面上(每個約200 μL),涂布均勻,然后放入培養(yǎng)箱中,28 ℃培養(yǎng)4 d,活化成功后即可進行下一步實驗。
1.3.2 菌株的形態(tài)特征
取活化成功后的雪腐鐮刀菌平板和醬油曲霉平板各一個,觀察菌體在固體平板上的形狀、顏色、黏稠度、透明度等特征,然后用無菌水制備菌懸液,在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)[13]。
1.3.3 接種發(fā)酵
1.3.3.1 橙皮苷的預(yù)處理
將0.2%橙皮苷置于超凈工作臺中,紫外燈持續(xù)照射30 min。然后將其倒入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基中,充分搖勻,制備發(fā)酵培養(yǎng)基,用于后續(xù)實驗。
1.3.3.2 單菌發(fā)酵
雪腐鐮刀菌:選取長勢較好的雪腐鐮刀菌平板,加入無菌水制備菌懸液,然后取6%的菌懸液注入種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后,再按4%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)一段時間。此后,每隔12 h取一次發(fā)酵液,發(fā)酵液經(jīng)煮沸、離心之后進行檢測。醬油曲霉操作同雪腐鐮刀菌。
1.3.3.3 混菌發(fā)酵(雪腐鐮刀菌-醬油曲霉1∶1)
參照單菌發(fā)酵方法,首先制備不同菌株的種子培養(yǎng)基,然后均按照4%的比例同時接種于同一發(fā)酵培養(yǎng)基中,并于30 ℃、160 r/min培養(yǎng),每隔12 h取樣一次,煮沸、離心后進行發(fā)酵液的檢測。
1.3.4 發(fā)酵液pH值的測定
取不同菌株不同時間段的發(fā)酵液,采用室溫、10 000 r/min離心5 min后測定其pH值。
1.3.5 酶活力的測定[14-15]
用pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液將橙皮苷配成0.1%的底物溶液,取底物溶液10 mL于30 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱5 min,然后加入發(fā)酵液10 mL,充分搖勻,30 ℃保溫10 min,立即用沸水滅活5 min,采用高效液相色譜法測得HMG生成量。將在30 ℃、pH 5.5條件下,每分鐘生成1 μg HMG所需的酶量,定義為一個酶活力單位(U)。
1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定
1.3.6.1 HMG的定性分析
稱取HMG標準樣品2 mg溶于10 mL甲醇中,采用反相高效液相色譜法測定其出峰時間。稱取橙皮苷、HMG及橙皮素標準樣品溶于10 mL甲醇中,測定混合標準品中三者各自的出峰時間。將取出的發(fā)酵液置于沸水浴5 min,離心、過濾,同樣采用高效液相法進行檢測。
高效液相色譜法的檢測條件[16]:色譜柱:Amethyst C18-H(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為甲醇-0.2%甲酸溶液,梯度洗脫;進樣量20 μL;檢測波長283 nm;柱溫控制在30 ℃,一個梯度程序的跑樣時間為30 min,具體的洗脫程序如表1所示。
表1 高效液相色譜法梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for high performance liquid chromatography
1.3.6.2 發(fā)酵液中HMG的結(jié)構(gòu)驗證
稱取HMG標準樣品2 mg溶于10 mL色譜級甲醇中,對其進行質(zhì)譜檢測。將取出的發(fā)酵液置于沸水浴5 min,離心、過濾,采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行測定。
超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的洗脫條件如表2所示。質(zhì)譜條件:電子電離源;毛細管電壓4 kV;離子源溫度135 ℃;脫溶劑溫度350 ℃;脫溶劑氣體流速600 L/h;掃描范圍m/z50~1 000。
表2 超高效液相色譜-質(zhì)譜法梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry
1.3.6.3 發(fā)酵產(chǎn)物HMG的定量檢測
橙皮苷、HMG及橙皮素標準原液的配制:準確稱取橙皮苷2.5 mg、HMG 2 mg及橙皮素2 mg,分別用色譜級甲醇定容至10 mL,超聲輔助溶解,即配成2.5 mg/mL的橙皮苷、2 mg/mL的HMG及2 mg/mL的橙皮素溶液,置于4 ℃的冰箱中貯藏備用。
橙皮苷、HMG及橙皮素標準曲線的制作[17]:用一定量的色譜級甲醇將橙皮苷、HMG及橙皮素標準原液進行稀釋并混勻,分別配制5、10、20、60、80 μg/mL的橙皮苷標準溶液,1、5、10、25、100 μg/mL的HMG標準溶液,1、2、5、30、40 μg/mL的橙皮素標準溶液,將配好的所有樣品溶液過0.22 μm濾膜后進行檢測,且每種標準品的每個質(zhì)量濃度均做3個平行,進樣量為20 μL,用高效液相色譜法進行測定并記錄峰面積,以各物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標分別繪制橙皮苷、HMG及橙皮素標準曲線,即橙皮苷的標準曲線為y=55 560x-69 549,R2=0.999 6;HMG的標準曲線為y=55 575x-40 577,R2=0.999 8;橙皮素的標準曲線為y=79 183x+248.88,R2=0.999 9。橙皮苷、HMG及橙皮素分別在5~80、1~100 μg/mL及1~40 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,可以用于這3種物質(zhì)的定量檢測。
應(yīng)用Origin和Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析,實驗結(jié)果取3次平行測定的平均值。
雪腐鐮刀菌是一種減毒、弱毒或低致病性的小型絲狀真菌,在綜合PDA培養(yǎng)基上菌落明顯,菌絲白色,密集低平,向平板邊緣蔓延生長,培養(yǎng)基背面淡黃色(圖1a);不產(chǎn)生小分生孢子,大分生孢子小,棒狀,平直或略彎(圖1b)。
醬油曲霉在綜合PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d之后,質(zhì)地絲絨狀,較薄,中央有氣生菌絲,具輻射狀溝紋,顏色為暗草綠色或黃綠色,培養(yǎng)基背面無色(圖1c);分生孢子頭幼時為球形,后成輻射形,分生孢子梗大多生自基質(zhì),壁近于光滑或有時在近頂囊處現(xiàn)粗糙,頂囊近球形(圖1d)。
圖1 菌株的形態(tài)特征(×400)Fig. 1 Morphological characteristics of F. nivale and A. sojae (× 400)
圖2 發(fā)酵液pH值的變化Fig. 2 Changes in pH of the fermentation broth
由圖2可知,無論是單一菌株還是混合菌株發(fā)酵,在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液均表現(xiàn)出pH值不斷下降的趨勢,而且混合菌株發(fā)酵pH值下降程度較單菌株更為明顯。橙皮苷轉(zhuǎn)化為HMG是通過微生物產(chǎn)生的酶實現(xiàn),而pH值又對酶解反應(yīng)過程尤為重要[18-19],只有當發(fā)酵液pH值始終處在該酶的最適pH值范圍內(nèi),酶分子活性中心必需基團的解離程度才會處于較高水平,從而使得反應(yīng)速率變快,達到目標產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率較高的最終目的。所以,通過探究發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的變化以及各個階段的酶活力變化,對于后期嚴格控制發(fā)酵環(huán)境、指導(dǎo)HMG的生成具有重要意義[20-21]。
圖3 各菌株產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶的活力Fig. 3 Change in α-L-rhamnosidase activity during fermentation
由圖3可見,三者的酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。通過單因素方差分析可知,雪腐鐮刀菌與醬油曲霉差異并不顯著,而雪腐鐮刀菌與混合菌、醬油曲霉與混合菌分別呈顯著差異(P<0.05)。雪腐鐮刀菌和醬油曲霉發(fā)酵12 h無酶活力,隨后酶活力逐步上升;而混合菌持續(xù)發(fā)酵36 h后仍檢測不出酶活力,可能與菌株自身的適應(yīng)期、繁殖以及彼此之間的競爭等密切相關(guān)[22-23]。雪腐鐮刀菌和醬油曲霉發(fā)酵60 h達到了酶活力最高點,但混合菌發(fā)酵60 h后,酶活力仍在不斷攀升,84 h獲得最大酶活力(104.81 U/mL)。因此,就酶活力而言,混合菌的產(chǎn)酶能力完全高于雪腐鐮刀菌和醬油曲霉[24-25],前者也極有可能在發(fā)酵84 h積累較多的HMG。
2.4.1 HMG出峰時間的確定
圖4 HMG標準樣品(a)和橙皮苷、HMG及橙皮素的混合標準樣品(b)色譜圖Fig. 4 Chromatograms of HMG standard (a) and mixed standard of hesperidin, HMG and hespcretin (b)
由圖4a可知,HMG標準樣品的出峰時間為19.668 min。橙皮苷經(jīng)微生物發(fā)酵之后可能產(chǎn)生HMG及橙皮素物質(zhì),為了便于區(qū)分發(fā)酵液中可能同時存在的這3種物質(zhì),進行了橙皮苷、HMG及橙皮素混合標準品的檢測,得到三者的出峰時間分別為19.229、19.655 min和23.485 min(圖4b)。結(jié)合圖4a、b看,HMG的出峰時間可能會發(fā)生微小偏移,而它與橙皮苷出峰時間又較為接近,因此,后續(xù)實驗要特別注意發(fā)酵液中HMG的產(chǎn)生情況,必要時可以對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。
2.4.2 發(fā)酵液中HMG的生成情況
圖5為雪腐鐮刀菌、醬油曲霉、混合菌在發(fā)酵過程中同一時間點(84 h)取樣進行高效液相色譜檢測的結(jié)果。結(jié)果表明,3種發(fā)酵液中均含有HMG,雖然出峰時間略有不同,但始終維持在19.6 min左右,并且通過內(nèi)標法進一步證實了HMG的存在。從峰高看,混合菌發(fā)酵液中HMG含量明顯高于單菌,證實了上述對混合菌在發(fā)酵84 h可能積累較多HMG的推論。所以,就雪腐鐮刀菌和醬油曲霉轉(zhuǎn)化橙皮苷生成HMG效果而言,混合菌發(fā)酵84 h較為理想[26]。
圖5 菌種發(fā)酵液的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of HMG in fermentation broths
2.4.3 產(chǎn)物HMG的鑒定結(jié)果
圖6 HMG標準樣品(a)及菌種發(fā)酵液(b)的超高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig. 6 UPLC-MS chromatograms of HMG standard (a) and mixedstrain fermentation broth (b)
已知HMG的相對分子質(zhì)量為464[27-28],檢測得出其保留時間為4.93 min(圖6a)。在負離子作用下,一級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z463.12的碎片離子峰,說明HMG丟失一個H,形成了[M-H]-的碎片離子峰,而二級質(zhì)譜圖中孤立且強度較大m/z301.07的碎片離子峰,是HMG被打碎之后形成的新的碎片離子峰。圖6b是混合菌某一時間點發(fā)酵液的檢測結(jié)果,對比圖6a看,其保留時間發(fā)生較小偏移,為4.95 min。根據(jù)相對分子質(zhì)量和保留時間這兩個條件尋找相對應(yīng)的物質(zhì),該物質(zhì)經(jīng)分子擬合之后證實確為HMG。雪腐鐮刀菌和醬油曲霉單獨發(fā)酵的液相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果也得到了同樣的結(jié)論??傊?,通過高效液相色譜的初步檢測和超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)構(gòu)驗證,證實了雪腐鐮刀菌、醬油曲霉以及混合菌轉(zhuǎn)化橙皮苷一定時間之后均可得到HMG[29-32]。
2.4.4 產(chǎn)物HMG質(zhì)量濃度變化
圖7 菌種發(fā)酵液中HMG質(zhì)量濃度的變化Fig. 7 Changes in HMG concentration of fermentation broths at different time points
圖7為雪腐鐮刀菌、醬油曲霉及混合菌某次發(fā)酵過程中HMG質(zhì)量濃度變化情況。通過單因素方差分析可知,雪腐鐮刀菌與醬油曲霉差異并不顯著,而雪腐鐮刀菌與混合菌、醬油曲霉與混合菌分別呈顯著差異(P<0.05),該顯著性分析與酶活力的分析結(jié)果保持一致?;旌暇l(fā)酵84 h獲得最大酶活力(104.81 U/mL)的同時,產(chǎn)生了最大質(zhì)量濃度(63.52 μg/mL)HMG,若此時對其發(fā)酵液進行分離純化,1 L發(fā)酵液可得63.52 mg HMG(不考慮損失),其他任一組合均無法達到該效果。HMG質(zhì)量濃度可直觀地表達發(fā)酵效果,是衡量發(fā)酵質(zhì)量的關(guān)鍵因素和重要指標。
雪腐鐮刀菌、醬油曲霉及混合菌均在酸性條件(pH 4~6)下完成搖瓶發(fā)酵,pH值對微生物的生長及發(fā)酵產(chǎn)酶至關(guān)重要,適宜pH值可以提高發(fā)酵效果。微生物轉(zhuǎn)化橙皮苷生成HMG是通過其產(chǎn)生的α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷完成,酶活力越高的時間點,該處積累的發(fā)酵產(chǎn)物可能就越多,混合菌發(fā)酵84 h達到最大酶活力(104.81 U/mL)的同時,也產(chǎn)生了最大質(zhì)量濃度(63.52 μg/mL)的HMG,此時它的酶活力明顯優(yōu)于雪腐鐮刀菌(24.73 U/mL)和醬油曲霉(26.17 U/mL),這表明多種微生物之間存在協(xié)同作用,混菌發(fā)酵可以彌補菌種之間的代謝差異性,相輔相成能起到單一菌株起不到的作用。發(fā)酵產(chǎn)物-HMG經(jīng)高效液相色譜初步檢測和超高效液相色譜-質(zhì)譜結(jié)構(gòu)驗證證明確實存在,并成為衡量發(fā)酵效果的關(guān)鍵因素和重要指標。