雪腐鐮刀菌和醬油曲霉轉(zhuǎn)化橙皮苷生成橙皮素單葡萄糖苷效果

張風(fēng)亭，胡 坦，潘思軼

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

橙皮苷是存在于柑橘類水果中的一種黃烷酮化合物，具有抗炎、抗氧化、促進成骨細胞分化等多種藥理活性[1]，除此之外，還可用作食品添加劑、果蔬保鮮劑等[2]。但由于橙皮苷的水溶性較差（2 mg/100 g）[3]，生物利用度較低，因此，必須對其進行改性，增加水溶性，從而擴大橙皮苷在醫(yī)藥、食品以及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前國內(nèi)外對橙皮苷改性方法研究較多的是生物轉(zhuǎn)化法[4]。生物法避免了化學(xué)法存在的反應(yīng)不易控制、反應(yīng)條件劇烈以及環(huán)境污染嚴重等缺陷，憑借其反應(yīng)效率高、特異性強、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢在一定程度上取代了化學(xué)法[5]。生物轉(zhuǎn)化包括酶法和微生物發(fā)酵法。近年來，微生物發(fā)酵法因其易于培養(yǎng)、菌種資源豐富、產(chǎn)生的酶系強大等特點，在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域備受關(guān)注。李小莉[6]在篩選高產(chǎn)且傳代穩(wěn)定的橙皮苷酶生產(chǎn)菌株時發(fā)現(xiàn)，雪腐鐮刀菌（Fusarium nivale）是最佳的發(fā)酵菌株。劉曉晶[7]利用雪腐鐮刀菌發(fā)酵產(chǎn)橙皮苷酶的特性研究并優(yōu)化了橙皮苷改性的工藝條件。橙皮苷酶和柚皮苷酶都是含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的復(fù)合酶，均可用于橙皮苷的轉(zhuǎn)化，一般途徑為橙皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的作用下生成橙皮素單葡萄糖苷（hesperitin-7-O-glucoside，HMG），HMG在β-D-葡萄糖苷酶的作用下繼續(xù)生成橙皮素[8-9]。鄭美瑜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷酶可以更快酶解橙皮苷。與此同時，國外研究報道指出[11-12]，從韓國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的醬油曲霉（Aspergillus sojae）具有較強的柚皮苷酶活性，該酶作用于橙皮苷得到了溶解度較高的HMG。但迄今為止，鮮有關(guān)于該菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化橙皮苷的研究報道。因此，本研究基于雪腐鐮刀菌和醬油曲霉均可轉(zhuǎn)化橙皮苷這一理論，以雪腐鐮刀菌、醬油曲霉和混合菌（雪腐鐮刀菌-醬油曲霉1∶1）這3種菌株作為出發(fā)菌株，比較其發(fā)酵轉(zhuǎn)化橙皮苷的效果，旨在篩選出更為適合橙皮苷轉(zhuǎn)化的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

橙皮苷（純度95%） 上海源葉生物科技有限公司；雪腐鐮刀菌（14 mm試管斜面）、醬油曲霉（凍干粉） 北納生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）、橙皮苷、HMG及橙皮素標準品 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、88%甲酸（分析純） 武漢飛揚生物科技有限公司；葡萄糖 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母膏（微生物級）、三水合磷酸氫二鉀（分子生物級）生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯浸出粉5 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121 ℃滅菌15 min；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，酵母膏5 g，K2HPO4·3H2O 2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LK50T顯微鏡 天津徠科光學(xué)儀器有限公司；LX-C35L高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AllegraX-30R高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；e2695高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、MA 01757超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及UNIFI科學(xué)信息系統(tǒng)）美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

雪腐鐮刀菌：試管斜面經(jīng)表面消毒之后，在超凈工作臺中打開，用無菌接種鋤和接種鏟切0.5 cm×0.5 cm的小正方形塊，然后將其平放至平板中心，28 ℃培養(yǎng)4 d，菌種長出即可使用。

醬油曲霉：將0.3～0.5 mL無菌水或液體培養(yǎng)基注入凍干管中，輕輕敲打，充分溶解成菌懸液。吸取菌懸液，均勻打入2個平板瓊脂表面上（每個約200 μL），涂布均勻，然后放入培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)4 d，活化成功后即可進行下一步實驗。

1.3.2 菌株的形態(tài)特征

取活化成功后的雪腐鐮刀菌平板和醬油曲霉平板各一個，觀察菌體在固體平板上的形狀、顏色、黏稠度、透明度等特征，然后用無菌水制備菌懸液，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)[13]。

1.3.3 接種發(fā)酵

1.3.3.1 橙皮苷的預(yù)處理

將0.2%橙皮苷置于超凈工作臺中，紫外燈持續(xù)照射30 min。然后將其倒入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基中，充分搖勻，制備發(fā)酵培養(yǎng)基，用于后續(xù)實驗。

1.3.3.2 單菌發(fā)酵

雪腐鐮刀菌：選取長勢較好的雪腐鐮刀菌平板，加入無菌水制備菌懸液，然后取6%的菌懸液注入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，再按4%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)一段時間。此后，每隔12 h取一次發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)煮沸、離心之后進行檢測。醬油曲霉操作同雪腐鐮刀菌。

1.3.3.3 混菌發(fā)酵（雪腐鐮刀菌-醬油曲霉1∶1）

參照單菌發(fā)酵方法，首先制備不同菌株的種子培養(yǎng)基，然后均按照4%的比例同時接種于同一發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次，煮沸、離心后進行發(fā)酵液的檢測。

1.3.4 發(fā)酵液pH值的測定

取不同菌株不同時間段的發(fā)酵液，采用室溫、10 000 r/min離心5 min后測定其pH值。

1.3.5 酶活力的測定[14-15]

用pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液將橙皮苷配成0.1%的底物溶液，取底物溶液10 mL于30 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱5 min，然后加入發(fā)酵液10 mL，充分搖勻，30 ℃保溫10 min，立即用沸水滅活5 min，采用高效液相色譜法測得HMG生成量。將在30 ℃、pH 5.5條件下，每分鐘生成1 μg HMG所需的酶量，定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

1.3.6.1 HMG的定性分析

稱取HMG標準樣品2 mg溶于10 mL甲醇中，采用反相高效液相色譜法測定其出峰時間。稱取橙皮苷、HMG及橙皮素標準樣品溶于10 mL甲醇中，測定混合標準品中三者各自的出峰時間。將取出的發(fā)酵液置于沸水浴5 min，離心、過濾，同樣采用高效液相法進行檢測。

高效液相色譜法的檢測條件[16]：色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%甲酸溶液，梯度洗脫；進樣量20 μL；檢測波長283 nm；柱溫控制在30 ℃，一個梯度程序的跑樣時間為30 min，具體的洗脫程序如表1所示。

表1 高效液相色譜法梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for high performance liquid chromatography

1.3.6.2 發(fā)酵液中HMG的結(jié)構(gòu)驗證

稱取HMG標準樣品2 mg溶于10 mL色譜級甲醇中，對其進行質(zhì)譜檢測。將取出的發(fā)酵液置于沸水浴5 min，離心、過濾，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行測定。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的洗脫條件如表2所示。質(zhì)譜條件：電子電離源；毛細管電壓4 kV；離子源溫度135 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣體流速600 L/h；掃描范圍m/z50～1 000。

表2 超高效液相色譜-質(zhì)譜法梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry

1.3.6.3 發(fā)酵產(chǎn)物HMG的定量檢測

橙皮苷、HMG及橙皮素標準原液的配制：準確稱取橙皮苷2.5 mg、HMG 2 mg及橙皮素2 mg，分別用色譜級甲醇定容至10 mL，超聲輔助溶解，即配成2.5 mg/mL的橙皮苷、2 mg/mL的HMG及2 mg/mL的橙皮素溶液，置于4 ℃的冰箱中貯藏備用。

橙皮苷、HMG及橙皮素標準曲線的制作[17]：用一定量的色譜級甲醇將橙皮苷、HMG及橙皮素標準原液進行稀釋并混勻，分別配制5、10、20、60、80 μg/mL的橙皮苷標準溶液，1、5、10、25、100 μg/mL的HMG標準溶液，1、2、5、30、40 μg/mL的橙皮素標準溶液，將配好的所有樣品溶液過0.22 μm濾膜后進行檢測，且每種標準品的每個質(zhì)量濃度均做3個平行，進樣量為20 μL，用高效液相色譜法進行測定并記錄峰面積，以各物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標分別繪制橙皮苷、HMG及橙皮素標準曲線，即橙皮苷的標準曲線為y＝55 560x-69 549，R2＝0.999 6；HMG的標準曲線為y＝55 575x-40 577，R2＝0.999 8；橙皮素的標準曲線為y＝79 183x+248.88，R2＝0.999 9。橙皮苷、HMG及橙皮素分別在5～80、1～100 μg/mL及1～40 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，可以用于這3種物質(zhì)的定量檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Origin和Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析，實驗結(jié)果取3次平行測定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

雪腐鐮刀菌是一種減毒、弱毒或低致病性的小型絲狀真菌，在綜合PDA培養(yǎng)基上菌落明顯，菌絲白色，密集低平，向平板邊緣蔓延生長，培養(yǎng)基背面淡黃色（圖1a）；不產(chǎn)生小分生孢子，大分生孢子小，棒狀，平直或略彎（圖1b）。

醬油曲霉在綜合PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d之后，質(zhì)地絲絨狀，較薄，中央有氣生菌絲，具輻射狀溝紋，顏色為暗草綠色或黃綠色，培養(yǎng)基背面無色（圖1c）；分生孢子頭幼時為球形，后成輻射形，分生孢子梗大多生自基質(zhì)，壁近于光滑或有時在近頂囊處現(xiàn)粗糙，頂囊近球形（圖1d）。

圖1 菌株的形態(tài)特征（×400）Fig. 1 Morphological characteristics of F. nivale and A. sojae (× 400)

2.2 發(fā)酵液pH值的變化

圖2 發(fā)酵液pH值的變化Fig. 2 Changes in pH of the fermentation broth

由圖2可知，無論是單一菌株還是混合菌株發(fā)酵，在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液均表現(xiàn)出pH值不斷下降的趨勢，而且混合菌株發(fā)酵pH值下降程度較單菌株更為明顯。橙皮苷轉(zhuǎn)化為HMG是通過微生物產(chǎn)生的酶實現(xiàn)，而pH值又對酶解反應(yīng)過程尤為重要[18-19]，只有當發(fā)酵液pH值始終處在該酶的最適pH值范圍內(nèi)，酶分子活性中心必需基團的解離程度才會處于較高水平，從而使得反應(yīng)速率變快，達到目標產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率較高的最終目的。所以，通過探究發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的變化以及各個階段的酶活力變化，對于后期嚴格控制發(fā)酵環(huán)境、指導(dǎo)HMG的生成具有重要意義[20-21]。

2.3 酶活力測定結(jié)果

圖3 各菌株產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶的活力Fig. 3 Change in α-L-rhamnosidase activity during fermentation

由圖3可見，三者的酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。通過單因素方差分析可知，雪腐鐮刀菌與醬油曲霉差異并不顯著，而雪腐鐮刀菌與混合菌、醬油曲霉與混合菌分別呈顯著差異（P＜0.05）。雪腐鐮刀菌和醬油曲霉發(fā)酵12 h無酶活力，隨后酶活力逐步上升；而混合菌持續(xù)發(fā)酵36 h后仍檢測不出酶活力，可能與菌株自身的適應(yīng)期、繁殖以及彼此之間的競爭等密切相關(guān)[22-23]。雪腐鐮刀菌和醬油曲霉發(fā)酵60 h達到了酶活力最高點，但混合菌發(fā)酵60 h后，酶活力仍在不斷攀升，84 h獲得最大酶活力（104.81 U/mL）。因此，就酶活力而言，混合菌的產(chǎn)酶能力完全高于雪腐鐮刀菌和醬油曲霉[24-25]，前者也極有可能在發(fā)酵84 h積累較多的HMG。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定與分析

2.4.1 HMG出峰時間的確定

圖4 HMG標準樣品（a）和橙皮苷、HMG及橙皮素的混合標準樣品（b）色譜圖Fig. 4 Chromatograms of HMG standard (a) and mixed standard of hesperidin, HMG and hespcretin (b)

由圖4a可知，HMG標準樣品的出峰時間為19.668 min。橙皮苷經(jīng)微生物發(fā)酵之后可能產(chǎn)生HMG及橙皮素物質(zhì)，為了便于區(qū)分發(fā)酵液中可能同時存在的這3種物質(zhì)，進行了橙皮苷、HMG及橙皮素混合標準品的檢測，得到三者的出峰時間分別為19.229、19.655 min和23.485 min（圖4b）。結(jié)合圖4a、b看，HMG的出峰時間可能會發(fā)生微小偏移，而它與橙皮苷出峰時間又較為接近，因此，后續(xù)實驗要特別注意發(fā)酵液中HMG的產(chǎn)生情況，必要時可以對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。

2.4.2 發(fā)酵液中HMG的生成情況

圖5為雪腐鐮刀菌、醬油曲霉、混合菌在發(fā)酵過程中同一時間點（84 h）取樣進行高效液相色譜檢測的結(jié)果。結(jié)果表明，3種發(fā)酵液中均含有HMG，雖然出峰時間略有不同，但始終維持在19.6 min左右，并且通過內(nèi)標法進一步證實了HMG的存在。從峰高看，混合菌發(fā)酵液中HMG含量明顯高于單菌，證實了上述對混合菌在發(fā)酵84 h可能積累較多HMG的推論。所以，就雪腐鐮刀菌和醬油曲霉轉(zhuǎn)化橙皮苷生成HMG效果而言，混合菌發(fā)酵84 h較為理想[26]。

圖5 菌種發(fā)酵液的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of HMG in fermentation broths

2.4.3 產(chǎn)物HMG的鑒定結(jié)果

圖6 HMG標準樣品（a）及菌種發(fā)酵液（b）的超高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig. 6 UPLC-MS chromatograms of HMG standard (a) and mixedstrain fermentation broth (b)

已知HMG的相對分子質(zhì)量為464[27-28]，檢測得出其保留時間為4.93 min（圖6a）。在負離子作用下，一級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z463.12的碎片離子峰，說明HMG丟失一個H，形成了[M-H]-的碎片離子峰，而二級質(zhì)譜圖中孤立且強度較大m/z301.07的碎片離子峰，是HMG被打碎之后形成的新的碎片離子峰。圖6b是混合菌某一時間點發(fā)酵液的檢測結(jié)果，對比圖6a看，其保留時間發(fā)生較小偏移，為4.95 min。根據(jù)相對分子質(zhì)量和保留時間這兩個條件尋找相對應(yīng)的物質(zhì)，該物質(zhì)經(jīng)分子擬合之后證實確為HMG。雪腐鐮刀菌和醬油曲霉單獨發(fā)酵的液相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果也得到了同樣的結(jié)論?？傊?，通過高效液相色譜的初步檢測和超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)構(gòu)驗證，證實了雪腐鐮刀菌、醬油曲霉以及混合菌轉(zhuǎn)化橙皮苷一定時間之后均可得到HMG[29-32]。

2.4.4 產(chǎn)物HMG質(zhì)量濃度變化

圖7 菌種發(fā)酵液中HMG質(zhì)量濃度的變化Fig. 7 Changes in HMG concentration of fermentation broths at different time points

圖7為雪腐鐮刀菌、醬油曲霉及混合菌某次發(fā)酵過程中HMG質(zhì)量濃度變化情況。通過單因素方差分析可知，雪腐鐮刀菌與醬油曲霉差異并不顯著，而雪腐鐮刀菌與混合菌、醬油曲霉與混合菌分別呈顯著差異（P＜0.05），該顯著性分析與酶活力的分析結(jié)果保持一致?；旌暇l(fā)酵84 h獲得最大酶活力（104.81 U/mL）的同時，產(chǎn)生了最大質(zhì)量濃度（63.52 μg/mL）HMG，若此時對其發(fā)酵液進行分離純化，1 L發(fā)酵液可得63.52 mg HMG（不考慮損失），其他任一組合均無法達到該效果。HMG質(zhì)量濃度可直觀地表達發(fā)酵效果，是衡量發(fā)酵質(zhì)量的關(guān)鍵因素和重要指標。

3 結(jié) 論

雪腐鐮刀菌、醬油曲霉及混合菌均在酸性條件（pH 4～6）下完成搖瓶發(fā)酵，pH值對微生物的生長及發(fā)酵產(chǎn)酶至關(guān)重要，適宜pH值可以提高發(fā)酵效果。微生物轉(zhuǎn)化橙皮苷生成HMG是通過其產(chǎn)生的α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷完成，酶活力越高的時間點，該處積累的發(fā)酵產(chǎn)物可能就越多，混合菌發(fā)酵84 h達到最大酶活力（104.81 U/mL）的同時，也產(chǎn)生了最大質(zhì)量濃度（63.52 μg/mL）的HMG，此時它的酶活力明顯優(yōu)于雪腐鐮刀菌（24.73 U/mL）和醬油曲霉（26.17 U/mL），這表明多種微生物之間存在協(xié)同作用，混菌發(fā)酵可以彌補菌種之間的代謝差異性，相輔相成能起到單一菌株起不到的作用。發(fā)酵產(chǎn)物-HMG經(jīng)高效液相色譜初步檢測和超高效液相色譜-質(zhì)譜結(jié)構(gòu)驗證證明確實存在，并成為衡量發(fā)酵效果的關(guān)鍵因素和重要指標。