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    利用核磁共振研究脂肪氧合酶酶促氧化蛋黃磷脂

    2022-12-22 09:08:24俞舜杰趙子建楊曉瑩陳德慰
    食品科學(xué) 2022年22期
    關(guān)鍵詞:酰基亞油酸過氧化物

    俞舜杰,趙子建,萬 鵬,楊曉瑩,陳德慰

    (廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧 530004)

    磷脂是一種具有兩親性的極性脂質(zhì),由甘油主鏈和sn-3上的磷酸基團(tuán)組成。磷脂的動(dòng)物來源主要是蛋黃、牛奶、海洋類生物、腦組織等,常見磷脂有磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、鞘磷脂和其他復(fù)雜脂肪酸組成的甘油磷脂,而蛋黃磷脂主要由PC和PE組成[1-3]。31P核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)已被證明是一種定量不同產(chǎn)品中磷脂的良好方法,并廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[2]。31P NMR和1H NMR相比,對含磷化合物具有選擇性的重要優(yōu)勢,盡管31P NMR的靈敏度相對較低,但在低至5 μmol/100 g的含量下,仍可以很好地觀察到磷脂[3]。

    脂質(zhì)氧化,尤其是磷脂的氧化對食品風(fēng)味有著重要的影響[4]。磷脂中富含亞油酸等多不飽和脂肪酸,是重要的風(fēng)味前體物質(zhì),極易氧化生成氫過氧化物。這些氫過氧化物不穩(wěn)定,易降解成醛、酮等小分子物質(zhì),從而為不同食品提供風(fēng)味特征。目前已有許多關(guān)于磷脂應(yīng)用于提高食品風(fēng)味的研究,Chen Dewei等[5]通過蛋黃磷脂提高了雞肉香氣,Guo Dong等[6]通過蛋黃磷脂提高了真空油炸薯?xiàng)l的風(fēng)味,另外還有鳙魚頭磷脂[7]、豬肉磷脂[8]、牛奶磷脂[9]、雞油磷脂[10]等也被用來研究對食品風(fēng)味的影響。關(guān)于磷脂組成、磷脂抗氧化、磷脂促氧化以及磷脂對食品風(fēng)味的提升等已經(jīng)有了一定研究,但是對于磷脂氧化的機(jī)理還少有全面合理的解釋。

    脂肪酸可通過3種方式氧化:自氧化、光氧化以及酶促氧化。在氧化過程中,磷脂甘油鏈上的?;鶗l(fā)生變化[11],可以通過?;兓^察磷脂氧化的路徑和程度。?;赡馨l(fā)生變化的情況有3種:1)不飽和?;湑?dǎo)致分子內(nèi)或分子間甘油三酯分子不同?;溕咸荚娱g形成鍵,后一種情況下會導(dǎo)致聚合,可能減少多不飽和鏈的飽和度,以及可能產(chǎn)生二聚體、三聚體、低聚物或聚合物;2)?;溞纬珊豕倌軋F(tuán),如氫過氧基、羥基、酮基或環(huán)氧基;3)?;湐嗔研纬尚》肿樱瑥亩删哂薪?cái)圊;湹母视腿ァ?/p>

    脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)屬于氧化還原酶,能特異性地在順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)處通過分子加氧催化多不飽和脂肪酸,生成含有共軛雙鍵的氫過氧化物。LOX主要作用于亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸和其他高級脂肪酸,一般認(rèn)為亞油酸的加氧位置在C9和C13位上[12],生成的一級產(chǎn)物氫過氧化物穩(wěn)定性低,可繼續(xù)降解并氧化成醛、酮等二級氧化產(chǎn)物,還可進(jìn)一步氧化為環(huán)氧酸[13]。

    在食品科學(xué)領(lǐng)域,脂質(zhì)氧化常用的分析方法有過氧化值、酸價(jià)、碘值、對茴香胺值和2-硫代巴比妥酸值等的測定[14]。還有通過光譜法定量評估共軛二烯和三烯、使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]測定揮發(fā)性低分子脂質(zhì)氧化產(chǎn)物等技術(shù)。NMR技術(shù)因其高效精確及專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于測定物質(zhì)組成和監(jiān)測物質(zhì)化學(xué)變化。盡管1H NMR的δ窄,信號容易重疊,但是其靈敏度高,得到的信號較多,與傳統(tǒng)分析方法相比能得到更多有利的信息。另外,相比于傳統(tǒng)方法和色譜法,NMR技術(shù)對樣品純度要求不高,樣品幾乎不需要預(yù)處理且在室溫下進(jìn)行分析,并只需使用少量有機(jī)溶劑或試劑,而且分析樣品的時(shí)間通常較短。利用1H NMR對脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的進(jìn)一步研究確定了許多其他氧化產(chǎn)物,如共軛二烯體系的氫過氧化物、醛類和環(huán)氧化物[16],并有助于建立目前對脂質(zhì)氧化的基本認(rèn)識。1H NMR技術(shù)根據(jù)化合物特征官能團(tuán)質(zhì)子產(chǎn)生的光譜信號可對其進(jìn)行定性和定量分析。

    一直以來,研究熱氧化食用油等脂質(zhì)氧化規(guī)律的很多,但利用LOX催化探究磷脂氧化機(jī)理的研究還很罕見。蛋黃是磷脂的主要來源之一,本研究期望通過LOX催化氧化蛋黃磷脂,利用31P NMR測定蛋黃磷脂組成,通過1H NMR和兩種化學(xué)方法監(jiān)測蛋黃磷脂中主要酰基、一級和二級氧化化合物的變化,為酶促氧化磷脂生成醛類風(fēng)味化合物提供一定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    雞蛋購自當(dāng)?shù)夭耸袌觥?/p>

    大豆LOX 浙江聯(lián)碩生物有限公司;無水乙醇、氫氧化鉀 成都市科龍化工試劑廠;氘代氯仿(CDCl3)、磷酸三苯酯 上海麥克林生化科技有限公司;正己烷、乙醚、丙酮、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、硼砂、硼酸 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CR21N型高速冷凍離心機(jī) 天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;AVANCE III HD 500 NMR波譜儀 德國Bruker公司;HJ-6A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 江蘇金怡儀器科技有限公司;RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海精密儀器儀表有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品的制備

    實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6 組樣品:空白組:新鮮蛋黃磷脂;實(shí)驗(yàn)組1:水浴95 ℃氧化2 h的蛋黃磷脂;實(shí)驗(yàn)組2:pH 6條件下大豆LOX氧化3 h的蛋黃磷脂;實(shí)驗(yàn)組3:pH 9條件下大豆LOX氧化3 h的蛋黃磷脂;實(shí)驗(yàn)組4:實(shí)驗(yàn)組2酶促氧化蛋黃磷脂的熱氧化(95 ℃水浴2 h)樣品;實(shí)驗(yàn)組5:實(shí)驗(yàn)組3酶促氧化蛋黃磷脂的熱氧化(95 ℃水浴2 h)樣品。實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3的兩種pH值分別為磷脂C9與C13位的最適氧化條件。蛋黃磷脂的熱氧化用于使用1H NMR觀察蛋黃磷脂中二級氧化產(chǎn)物。

    1.3.1.1 蛋黃磷脂的制備

    參考Chen Dewei等[5]的方法,并做少量修改。取6個(gè)新鮮雞蛋去除蛋清,將蛋黃攪拌均勻后,利用3~6 倍體積的乙醇提取蛋黃磷脂。取出提取液至圓底燒瓶,向沉淀中繼續(xù)加乙醇并于4 000 r/min離心15 min,合并上清液與提取液。將溶液減壓蒸餾后,加入正己烷溶解,冰浴10 min,加入適量冷丙酮以沉淀磷脂。用丙酮不斷洗滌沉淀物,沖洗至沖洗液無色,取沉淀至培養(yǎng)皿。在室溫下,高真空6 h去除沉淀中少量殘留溶劑,得到蛋黃磷脂樣品,放入4 ℃冰箱保存。

    1.3.1.2 蛋黃磷脂的酶促氧化

    參考蔡琨[17]的方法,并做少量修改。稱量1 g蛋黃磷脂(溶解度約0.5%)置于燒杯中,加入200 mL pH 6 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(或200 mL pH 9 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液)。取大豆LOX在2 mL離心管中用蒸餾水溶解,振蕩至完全溶解。將酶液加入燒杯,在37 ℃下磁力攪拌3 h后停止反應(yīng)。用乙醚萃取氫過氧化物,并用水洗滌乙醚提取物,去除可能殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。利用高真空去除樣品中的殘留乙醚[18]。通過延長反應(yīng)時(shí)間達(dá)到與文獻(xiàn)相似的氧化效果。

    1.3.1.3 蛋黃磷脂的熱氧化

    參考Xu Na等[19]的方法,并適當(dāng)修改。取0.2 g蛋黃磷脂,加2 mL氯仿,氮吹蒸發(fā)溶劑,并減壓蒸發(fā)殘余氯仿后得到一層磷脂膜。放入具塞試管中,95 ℃水浴加熱2 h,迅速冰浴冷卻后保存。

    1.3.231P NMR分析

    參考Bettjeman[20]和Ahmmed[21]等的脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)法。將內(nèi)標(biāo)物磷酸三苯酯溶于CDCl3,渦旋1 min,質(zhì)量濃度為25 mg/mL。取0.1 g蛋黃磷脂樣品轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,溶劑為0.4 mL CDCl3和0.4 mL甲醇-K4EDTA混合物。溶液振蕩均勻后轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中。使用帶有5 mm低溫探針的600 MHz的NMR波譜儀進(jìn)行分析:單脈沖模式;實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃;掃描次數(shù)192次,弛豫時(shí)間3.5 s。

    采用絕對定量法:由內(nèi)標(biāo)化合物特征峰面積與樣品中某一特征峰面積的比值按下式計(jì)算樣品質(zhì)量濃度[22]:

    式中:cx為待測物質(zhì)量濃度/(mg/L);cstd為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/(mg/L);Mx為待測物分子質(zhì)量;Mstd為內(nèi)標(biāo)分子質(zhì)量;Ax為待測物峰面積;Astd為內(nèi)標(biāo)物峰面積;nx為待測物定量峰包含的磷原子數(shù);nstd為內(nèi)標(biāo)物定量峰包含的磷原子數(shù)。

    1.3.31H NMR分析

    參考文獻(xiàn)[23-24]的方法。取0.1 g蛋黃磷脂樣品轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中。溶劑為600 μL CDCl3。將溶液在振蕩儀上搖勻,轉(zhuǎn)移到5 mm核磁管中。使用帶有5 mm低溫探針的500 MHz的NMR波譜儀進(jìn)行分析:內(nèi)部溫度295 K;單脈沖模式;掃描次數(shù)64次;弛豫時(shí)間1 s,采集時(shí)間3.744 s。

    利用1H NMR計(jì)算油脂脂肪酸組成及含量的方法已被大量報(bào)道[23,25-26],總結(jié)整理得出計(jì)算公式。

    主要脂肪?;南鄬ξ镔|(zhì)的量按式(2)計(jì)算:

    式中:xi待測脂肪酸的相對物質(zhì)的量/%;Ii為待測脂肪酸的積分換算值;IFA為總脂肪酸的積分換算值。

    脂肪酸的積分換算如式(3)~(10)所示,Ax表示相應(yīng)信號的積分值,δ分配見表1。

    選擇甘油主鏈的—CH2OCOR,按下式計(jì)算總脂肪酸的積分換算值:

    選擇不飽和ω-3酰基的—CH3,按下式計(jì)算總ω-3脂肪酸的積分換算值:

    選擇二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)?;摹狾CO—CH2—CH2—,按下式計(jì)算DHA的積分換算值:

    選擇二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid,ARA)?;摹狾CO—CH2—CH2—,按下式計(jì)算EPA和ARA的積分換算值:

    選擇不飽和ω-3酰基的—CH3,按下式計(jì)算亞麻酸的積分換算值:

    選擇雙不飽和ω-6?;模紿C—CH2—CH=,按下式計(jì)算亞油酸的積分換算值:

    選擇除DHA外脂肪酸烯丙基的—CH2—CH=CH—,按下式計(jì)算油酸的積分換算值:

    選擇飽和、單不飽和ω-9和/或ω-7、不飽和ω-6?;摹狢H3,按下式計(jì)算飽和脂肪酸的積分換算值:

    氫過氧化物、醛類的濃度比按下式計(jì)算:

    式中:bi為待測物質(zhì)的濃度比/(mmol/mol磷脂);Ii為待測物質(zhì)的積分換算值;103為換算系數(shù);IFA為總脂肪酸的積分換算值。相應(yīng)氧化產(chǎn)物的δ分配見表1。

    表1 蛋黃磷脂主要酰基與氧化產(chǎn)物在CDCl3中1H NMR信號的δ分配和多重峰種類Table 1 Chemical shift distribution and multiple peak types of 1H NMR signals of main acyl groups and oxidation products of egg yolk phospholipids in CDCl3

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05,差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛋黃磷脂氧化前后成分分析

    表2 酶促氧化前后蛋黃磷脂成分含量Table 2 Change in purity of egg yolk phospholipids before and after enzymatic oxidation

    從表2可以看出,蛋黃磷脂中PC最多,PE其次。其中,新鮮蛋黃磷脂中含有(80.02±0.76)%的PC和(14.37±0.54)%的PE,這與文獻(xiàn)[27]中蛋黃磷脂PC(78%)和PE(18%)的含量一致。不同來源蛋黃磷脂中PC含量會有波動(dòng),高PC含量的蛋黃卵磷脂大于90%,甚至大于95%,而低PC含量的蛋黃卵磷脂為68%~80%[28]。

    圖1 空白組(a)和實(shí)驗(yàn)組2(b)蛋黃磷脂成分的31P NMR譜圖Fig. 1 31P NMR spectra of egg yolk phospholipids in blank group (a) and experimental group II (b)

    對比圖1a和b可以發(fā)現(xiàn),氧化后,蛋黃磷脂的成分發(fā)生了變化。由表2可知,酶促氧化后測得的蛋黃磷脂組分中,PC和PE含量均發(fā)生下降,這是因?yàn)檠趸瘯r(shí),磷脂上的大量不飽和脂肪?;碾p鍵容易被自由基攻擊。另外,酶促氧化后,蛋黃磷脂產(chǎn)生了LPE的峰(圖1),LPC含量增加(表2),說明酶解反應(yīng)增加了溶血性磷脂的含量。LPC來源于磷脂酶A2作用下PC的裂解:磷脂酶A2能夠特異性水解甘油磷脂sn-2位的脂酰鍵,從而產(chǎn)生溶血性磷脂[29-30]。磷脂酶存在于動(dòng)物和植物體內(nèi),推測其可能有兩個(gè)來源:來自于實(shí)原材料雞蛋本身或來源于LOX。

    2.2 蛋黃磷脂氧化前后主要酰基變化分析

    圖2 空白組和實(shí)驗(yàn)組2蛋黃磷脂的1H NMR譜圖(δ 0.5~5.5)Fig. 2 1H NMR spectra of egg yolk phospholipids in blank group and experimental group II (δ 0.5-5.5)

    由圖2可以看出,與空白組相比,實(shí)驗(yàn)組2脂肪酸?;姆鍍H有略微變動(dòng),無明顯的改變。由表3可知,對比空白組,在水浴加熱氧化或酶促氧化后,蛋黃磷脂的不飽和脂肪酸相對物質(zhì)的量均下降,而飽和脂肪酸的相對物質(zhì)的量均上升。這是因?yàn)椴伙柡碗p鍵極不穩(wěn)定,加熱會使碳碳雙鍵發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成氫過氧化物,而LOX催化氧氣插入含有一個(gè)(1Z,4Z)-戊二烯部分的脂肪酸使其過氧化,最終斷裂生成小分子的醇、醛、酮或環(huán)氧化物。

    表3 6 組蛋黃磷脂樣品中各種脂肪酸的相對物質(zhì)的量Table 3 Molar percentages of fatty acids in six egg yolk phospholipid samples

    由表3可知,與空白組相比,5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的亞油酸相對物質(zhì)的量都有明顯下降,說明在氧化條件下,蛋黃磷脂中的亞油酸均發(fā)生了劇烈的氧化降解反應(yīng),并生成氫過氧化物。pH 6酶促氧化蛋黃磷脂(實(shí)驗(yàn)組2)含有的亞油酸相對物質(zhì)的量為(14.21±0.81)%,小于僅水浴加熱蛋黃磷脂(實(shí)驗(yàn)組1)的亞油酸相對物質(zhì)的量,這是由于LOX特異性催化亞油酸的雙鍵,并且亞油酸是在磷脂中占比最高的多不飽和脂肪酸。pH 6和pH 9酶促氧化后水浴加熱蛋黃磷脂(實(shí)驗(yàn)組4和5)含有的油酸相對物質(zhì)的量均小于僅酶促氧化的樣品(實(shí)驗(yàn)組2和3),說明氧化后單不飽和脂肪酸相對物質(zhì)的量呈先上升后下降的趨勢。這與單不飽和脂肪酸的峰的計(jì)算方式有關(guān)。在氧化初期,大量多不飽和脂肪酸的每個(gè)雙鍵存在氧化順序,含有單個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物大量生成,由于多不飽和脂肪酸相比單不飽和脂肪酸更易被氧化,油酸的降解速率小于多不飽和脂肪酸降解后生成含有單個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物的速率。

    2.3 蛋黃磷脂氧化生成的一級氧化產(chǎn)物分析

    先前的研究[31]表明LOX的氧化特異性隨反應(yīng)體系pH值的變化而變化:pH值在7.5以下時(shí),LOX顯示9-LOX活性,而在較高pH值下,13-LOX活性占優(yōu)勢;但是在極酸和極堿條件下,幾乎檢測不到LOX的活性。因此pH 6.0~9.0是LOX的最適pH值范圍,pH 6時(shí),酶催化產(chǎn)生9-氫過氧化物,而pH 9條件下會形成13-氫過氧化物。

    圖3 蛋黃磷脂氧化生成一級氧化產(chǎn)物氫過氧化物的含量Fig. 3 Contents of hydroperoxide, the first oxidation product of egg yolk phospholipids

    從圖3可以看出,蛋黃磷脂樣品氧化生成的氫過氧化物含量從多到少依次是實(shí)驗(yàn)組2>實(shí)驗(yàn)組1>實(shí)驗(yàn)組4>實(shí)驗(yàn)組5>實(shí)驗(yàn)組3>空白組。LOX可以特異性催化氧化含有(1Z,4Z)-戊二烯系統(tǒng)的多不飽和脂肪酸。盡管氫過氧化物是不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物,在沒有加熱等繼續(xù)劇烈氧化的條件下,反應(yīng)體系中也會盡可能地富集氫過氧化物,這也是pH 6酶促氧化磷脂(實(shí)驗(yàn)組2)生成氫過氧化物最多的原因之一。

    實(shí)驗(yàn)組1盡管氧化也足夠強(qiáng)烈,但是由于沒有特異性催化的條件,生成的氫過氧化物極不穩(wěn)定,容易進(jìn)一步氧化降解。而實(shí)驗(yàn)組4是蛋黃磷脂樣品在pH 6的環(huán)境中并在酶促氧化的基礎(chǔ)上繼續(xù)加熱氧化,由于磷脂已經(jīng)被氧化且生成了較多氫過氧化物,氫過氧化物降解的速度大于產(chǎn)生的速度,因此氫過氧化物被進(jìn)一步消耗。實(shí)驗(yàn)組3產(chǎn)生的氫過氧化物極少,說明LOX在pH 9的條件下氫過氧化物的累積量不足以被1H NMR大量監(jiān)測到。這是因?yàn)閜H 9 是LOX的最適pH值[32],在此條件下使得蛋黃磷脂較快地產(chǎn)生氫過氧化物后又被快速降解了。Therond等[33]通過LOX處理獲得相應(yīng)的氫過氧化物,而在磷脂濃度較低的情況下,發(fā)生了氫過氧化物的降解,可能與LOX反應(yīng)時(shí)間過長有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在監(jiān)測pH 6和pH 9條件下的兩種磷脂氧化反應(yīng)條件中使用了相同的時(shí)間(3 h),希望在pH 6條件下磷脂氧化得更加充分,從而產(chǎn)生更多的C9位氫過氧化物。實(shí)驗(yàn)組5在已經(jīng)被酶促氧化后,得到的氫過氧化物含量少于實(shí)驗(yàn)組1,可能是因?yàn)檩^長的酶促反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致pH 9條件下的氫過氧化物生成后再降解。實(shí)驗(yàn)組5比實(shí)驗(yàn)組3生成氫過氧化物多的原因是受到水浴加熱的影響而發(fā)生了熱氧化(自動(dòng)氧化)而并非來自于酶促氧化。由此可見,LOX可以在pH 6的條件下,特異性地催化蛋黃磷脂在C9位生成氫過氧化物。

    圖4 蛋黃磷脂氧化前后的1H NMR譜圖Fig. 4 1H NMR spectra of egg yolk phospholipids before and after oxidation

    由圖4所示,空白組的蛋黃磷脂在δ7.7~8.9之間幾乎沒有信號,而實(shí)驗(yàn)組4的磷脂在此區(qū)間內(nèi)有一個(gè)寬信號峰(信號L)。圖4d中還發(fā)現(xiàn)δ7.7~8.5處有許多小的單峰,有報(bào)道稱這可能是連接氫過氧化物的—OOH或—OH[34],它的形成可能與加熱過程中接觸氧氣量不足有關(guān)[35]。而在δ5.5~6.5區(qū)間內(nèi)的信號峰表明,在磷脂未氧化時(shí)就產(chǎn)生了一些與—OOH或—OH相連的共軛二烯體系的信號。

    2.4 蛋黃磷脂氧化生成的二級氧化產(chǎn)物分析

    蛋黃磷脂被氧化后生成的一級產(chǎn)物不穩(wěn)定,很容易進(jìn)一步被氧化為多種類型的小分子化合物。有一些二級氧化產(chǎn)物具有不與其他物質(zhì)重疊的1H NMR光譜信號,可以用于定性和定量分析。由于磷脂中亞油酸C9位的特定氧化路徑可以用最終產(chǎn)物小分子醛類佐證,因此本研究主要對醛類物質(zhì)進(jìn)行分析。

    由表1可知,從蛋黃磷脂1H NMR光譜中的δ9.2~10.6區(qū)域可以檢測出4種化合物。δ9.63處的雙重峰(信號M)為(Z,E)-2,4-二烯醛;δ9.75處(信號N)為正構(gòu)烷醛[36];2個(gè)暫未定義的信號,一個(gè)在δ9.41處,另一個(gè)在δ10.53處(此峰猜測可能是羧酸類化合物)。Guillén等[37]在植物油的δ9~10區(qū)域內(nèi)也檢測出δ9.41這個(gè)信號,暫時(shí)把它認(rèn)定為單醛。

    圖5 蛋黃磷脂氧化生成的二級氧化產(chǎn)物2,4-二烯醛和正構(gòu)烷醛的含量Fig. 5 Amounts of 2,4-diene aldehyde and n-alkanolaldehyde produced by the oxidation of egg yolk phospholipid samples

    由圖5可知,在酶促氧化的樣品中,無論在pH 6還是pH 9條件下的磷脂(實(shí)驗(yàn)組2或3),均未檢測到醛類物質(zhì)。由于LOX特異性催化氧化含有(1Z,4Z)-戊二烯系統(tǒng)的多不飽和脂肪酸的區(qū)域[38],在適當(dāng)酶活性、反應(yīng)時(shí)間不足的情況下,脂質(zhì)會盡可能地富集一級氧化產(chǎn)物。因此盡管氫過氧化物是中間產(chǎn)物且不穩(wěn)定,但極少會被繼續(xù)降解成小分子醛類。

    通過酶促氧化后繼續(xù)熱氧化,可以將富集的氫過氧化物繼續(xù)分解成二級氧化產(chǎn)物。在實(shí)驗(yàn)組4中,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了較多的(Z,E)-2,4-二烯醛信號(圖4c)。而在實(shí)驗(yàn)組5中并沒有發(fā)現(xiàn)(Z,E)-2,4-二烯醛,只發(fā)現(xiàn)了正構(gòu)烷醛,這是因?yàn)樵趐H 9時(shí),蛋黃磷脂只產(chǎn)生13-氫過氧化物[39]。在課題組之前的研究中[5,40]氧化蛋黃磷脂時(shí)產(chǎn)生的2,4-二烯醛類主要是(Z,E)-2,4-癸二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛,產(chǎn)生的正構(gòu)烷醛主要是己醛。2,4-癸二烯醛具有典型的油炸雞肉味,是油炸食品的特征風(fēng)味物質(zhì),并且其氣味檢測閾值較低,因此添加到油炸類、肉類等食品中,對風(fēng)味有重大的貢獻(xiàn)。由此可以推測,在pH 6條件下,LOX催化蛋黃磷脂大量生成的(Z,E)-2,4-二烯醛類為(Z,E)-2,4-癸二烯醛;而在pH 9條件下生成的正構(gòu)烷醛為己醛。

    3 結(jié) 論

    將通過乙醇/正己烷/丙酮提取的蛋黃磷脂分別進(jìn)行95 ℃水浴加熱和LOX酶促氧化以及混合氧化。通過31P NMR對酶促氧化前后蛋黃磷脂的成分進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)氧化后磷脂的PC和PE含量均發(fā)生了下降,同時(shí)酶解反應(yīng)增加了溶血性磷脂的含量。通過1H NMR對6 組磷脂樣品進(jìn)行監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)所有的氧化樣品中總不飽和脂肪酸相對物質(zhì)的量均下降,而飽和脂肪酸的相對物質(zhì)的量均上升,其中在pH 6酶促條件下,亞油酸的降解速率最快。LOX在pH 6條件下特異性氧化蛋黃磷脂能生成更多的氫過氧化物,在加熱后進(jìn)一步生成更多期望的風(fēng)味化合物(Z,E)-2,4-二烯醛,說明在LOX的作用下,蛋黃磷脂中亞油酸在C9位氧化更充分;而LOX在更有活性的pH 9條件下,由于酶促時(shí)間較長,蛋黃磷脂較快合成氫過氧化物后又發(fā)生降解,并且其主要在C13位發(fā)生氧化,因此在加熱后生成了更多的正構(gòu)烷醛。這些特性表明,LOX在適當(dāng)條件下可以控制蛋黃磷脂氧化的路徑進(jìn)而生成期望的風(fēng)味化合物,為食品風(fēng)味物質(zhì)前體的促進(jìn)生成提供了思路。

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