鉀鹽替代和附屬發(fā)酵劑對(duì)切達(dá)干酪品質(zhì)的影響

余鵬飛，馬春麗，韓秀娥，王家栩，賈麗麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

在干酪制作中，NaCl起著至關(guān)重要的作用，如改善口感和質(zhì)地、促進(jìn)凝乳的脫水和抑制腐敗微生物的生長[1]。然而，過量食用NaCl會(huì)促進(jìn)健康損害，如血壓升高和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。由于KCl具有與NaCl相似的化學(xué)性質(zhì)[3-5]，因此利用KCl鹽代替NaCl降低干酪中的鈉含量已進(jìn)行廣泛研究[6-7]。

與發(fā)酵劑乳酸菌相比，在干酪中添加附屬發(fā)酵劑具有改善干酪品質(zhì)和促進(jìn)其成熟的作用，比如增加干酪的蛋白水解以及降低苦味肽改善口感[8-10]。在益生方面，發(fā)現(xiàn)以瑞士乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑可以明顯提高干酪的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制性[11]，這些都表明附屬發(fā)酵劑可以把干酪當(dāng)作優(yōu)良載體，提升干酪相關(guān)的品質(zhì)和賦予其健康功能。副干酪乳桿菌在食物中的益生功能被廣泛的研究，能夠降低血壓和提高ACE抑制率[12]，但作為附屬發(fā)酵劑對(duì)干酪成熟過程特性變化研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)室保藏的在脫脂乳中表現(xiàn)較高的ACE抑制率的Lactobacillus paracaseiM3作為附屬發(fā)酵劑，正常鹽干酪為空白組，以在正常鹽添加附屬發(fā)酵劑、部分鉀鹽替代鈉鹽和在部分鉀鹽替代鈉鹽添加附屬發(fā)酵劑為實(shí)驗(yàn)組，研究部分鉀鹽替代鈉鹽和添加附屬發(fā)酵劑L. paracaseiM3對(duì)切達(dá)干酪品質(zhì)和ACE抑制活性的影響，為開發(fā)具有降壓功能的干酪提供相關(guān)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳（新鮮無抗乳） 哈爾濱市香坊農(nóng)場(chǎng)；副干酪乳桿菌（L. pacasei）M3 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；商業(yè)發(fā)酵劑R-704（由Lactococcus lactissubsp.lactis和Lactococcus lactissubsp.cremoris組成）、凝乳酶Stamix 1150 北京科漢森公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE 美國Sigma公司；MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；茚三酮 上海山浦化工有限公司；甘氨酸 上海慧世生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；SYQDSX-280B 手提式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；ULTRA-TURRAX T8均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；SA402B電子舌 日本Insent司；Pilot10-15M制備型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HYCV-30小型干酪槽 黑龍江赫益乳液科技有限公司；XF-3A型水分活度儀 廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable-Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養(yǎng)

將L. paracaseiM3凍存菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，連續(xù)傳代活化后，再按體積分?jǐn)?shù)4%接種量接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的脫脂乳培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，待其凝乳，備用。

1.3.2 切達(dá)干酪的制作

參照Hannon等[13]的干酪制作方法。干酪實(shí)驗(yàn)分組為：A組，加入100% NaCl；B組，加入50% NaCl-50% KCl；C組，加入100% NaCl和0.5%L. paracaseiM3（V/V）；D組，加入50% NaCl-50% KCl和0.5%L. paracaseiM3（V/V），每組干酪添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%鹽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%商品發(fā)酵劑R-704。干酪放于4 ℃成熟6個(gè)月。

1.3.3 干酪理化性質(zhì)的測(cè)定

取成熟6個(gè)月的切達(dá)干酪測(cè)定其組成成分。水分含量測(cè)定：采用直接干燥法參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用凱氏定氮法，參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪含量測(cè)定：采用索氏抽提法，參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》；水分活度測(cè)定：參考GB 5009.238—2016《食品水分活度的測(cè)定》；灰分含量測(cè)定：參考GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》。pH值測(cè)定：將干酪與去離子水按1∶9（m/m）的比例混合并均質(zhì)，用pH值計(jì)測(cè)定。

1.3.4 干酪活菌數(shù)的測(cè)定

對(duì)干酪成熟期第0、1、2、3、4、5、6個(gè)月進(jìn)行微生物的檢測(cè)，具體方法如下：取1 g干酪樣品無菌條件下研磨并和9 mL 2%的檸檬酸鈉混合均質(zhì)，并用滅菌的0.1%的蛋白胨進(jìn)行梯度稀釋，吸取0.1 mL涂布于固體營養(yǎng)瓊脂，（35±1）℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)[14]；再吸取0.1 mL涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行乳酸菌的計(jì)數(shù)。

1.3.5 pH 4.6可溶性氮含量的測(cè)定

根據(jù)Fenelon等[15]的方式并作適當(dāng)修改，對(duì)干酪成熟期每個(gè)月進(jìn)行取樣分析。稱取5 g干酪研磨并加入20 mL pH 4.6的乙酸鈉溶液進(jìn)行均質(zhì)，40 ℃水浴1 h，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至消化瓶，自動(dòng)凱氏定氮測(cè)定，用所占干酪總氮量的百分比表示。

1.3.6 干酪水溶性提取物的制備

取成熟期每個(gè)月干酪20 g加入適當(dāng)?shù)娜ルx子水，并在40 ℃水浴鍋加熱0.5 h，使用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)3～4 min，除去上層脂肪，離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），上清液進(jìn)行過濾，所得濾液進(jìn)行冷凍干燥后貯存于-20 ℃冰箱。

1.3.7 干酪總游離氨基酸的測(cè)定

對(duì)干酪成熟期每個(gè)月取樣1次進(jìn)行測(cè)定。采取鎘-茚三酮法[16]測(cè)定，將上述1 mL干酪水溶性提取物的上清液用100 mL容量瓶定容，取0.40 mL稀釋液、1.60 mL蒸餾水、1.00 mL茚三酮顯色劑，振蕩搖勻，保持15 min的沸水浴，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，于570 nm波長處測(cè)定吸光度。利用甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白水解能力。

1.3.8 干酪ACE抑制活性測(cè)定

根據(jù)舒國偉[17]的方法并稍加修改，將凍干樣品配制成20 mg/mL，用0.05 mmol/L硼酸鹽緩沖液配制成5 mmol/L HHL和0.1 U/mL酶活的ACE，冷藏備用。具體方法如下：取200 μL HHL、100 μL樣品溶液分別裝入5 mL離心管混合振蕩，在37 ℃水浴3 min，再加入20 μL ACE酶液，再水浴30 min，添加200 mL 1mol/L鹽酸終止反應(yīng)，最后加入1.7 mL乙酸乙酯，離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），吸取上層的乙酸乙酯層1 mL。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再加入3 mL去離子水，振蕩10 s，使用紫外分光光度計(jì)在波長228 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算：

式中：Aa為包含干酪樣品的吸光度；Ab為未加入干酪樣品的吸光度；Ac為酶失活的吸光度。

1.3.9 干酪質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

對(duì)干酪成熟期每個(gè)月取樣1次進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)屈倩[18]的方法并稍加修飾。用TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)儀測(cè)干酪各成熟期質(zhì)構(gòu)，具體如下：將干酪樣品切成（2.00±0.10）cm的立方體，并在室溫下放置40 min，測(cè)試前探頭下降速率2 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)試后探頭回程速率2 mm/s，下壓距離10 mm，兩次下壓間隔時(shí)間5 s，觸發(fā)壓5 g，探頭型號(hào)P/0.5，每組干酪平行測(cè)定3次。

1.3.10 干酪電子舌的測(cè)定

根據(jù)Lipkowitz等[19]的方法并稍加修飾，取成熟第6個(gè)月的干酪進(jìn)行電子舌測(cè)定。取5 g干酪加入100 mL去離子均質(zhì)3～4 min，除去脂肪，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，取上清液并用0.45 μm的濾膜過濾，置于專屬燒杯，待測(cè)。

1.3.11 干酪感官評(píng)價(jià)

干酪成熟6個(gè)月的樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。根據(jù)Amalshori等[20]的方法并略加修飾，選擇10 名專業(yè)成員（5 位男生和5 位女生）進(jìn)行干酪感官評(píng)價(jià)，采取10 分評(píng)價(jià)表代表接受程度。主要針對(duì)色澤、苦味、質(zhì)地、裂縫、咸味五方面進(jìn)行打分，根據(jù)整體接受程度分為4個(gè)等級(jí)，1～3 分為差，4～5 分為一般，6～8 分為好，9～10 分為較好。每個(gè)成員品嘗干酪樣品都需要事先漱口，隨機(jī)將干酪樣品分配給成員進(jìn)行獨(dú)立打分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品重復(fù)3次平行，用SPSS 22.0進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著，用GraphPad 2018軟件進(jìn)行作圖，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）進(jìn)行電子舌分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪主要成分分析

表1 切達(dá)干酪組成成分分析Table 1 Analysis of chemical composition in Cheddar cheese

鉀鹽替代50%鈉鹽和L. paracaseiM3的添加對(duì)干酪的水分、脂肪、蛋白質(zhì)、水分活度均無顯著影響（P＞0.05）（表1），主要是KCl與NaCl在物理化學(xué)性質(zhì)方面有著較為相似的結(jié)構(gòu)[21]。部分鉀鹽替代的干酪B、D在灰分低于沒有添加鉀鹽的干酪A、C，一般而言，灰分含量主要受干酪中的鹽和礦物質(zhì)比例的影響[22]，說明KCl比起NaCl更容易使得干酪鹽和礦物質(zhì)比例下降，導(dǎo)致灰分降低。

2.2 干酪pH值分析

圖1 切達(dá)干酪成熟期pH值的變化Fig. 1 Change in pH of Cheddar cheese during ripening

由圖1可知，各成熟期的干酪樣品pH值整體上呈現(xiàn)出先下降后上升的規(guī)律，主要原因是成熟前期干酪中存在著殘留乳糖，附屬發(fā)酵劑和主發(fā)酵劑分解乳糖繼續(xù)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使pH值下降，隨著成熟時(shí)間延長，乳糖被消耗殆盡，以及蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生肽和氨基酸等物質(zhì)使干酪pH值上升[23]。在相同成熟期，由于附屬發(fā)酵劑代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)，干酪C、D的pH值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)鉀離子提供的環(huán)境有利于微生物發(fā)酵[24]，使干酪B的pH值低于對(duì)照組干酪A，即鉀鹽替代和附屬發(fā)酵劑L. paracaseiM3的添加使干酪pH值降低。

2.3 干酪微生物分析

圖2 切達(dá)干酪成熟期細(xì)菌總數(shù)（A）和乳酸菌數(shù)（B）的變化Fig. 2 Changes in total bacterial count (A) and Lactobacillus count (B)in Cheddar cheese during ripening

細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)是衡量乳制品質(zhì)量安全的一個(gè)重要指標(biāo)[25]。如圖2所示，總細(xì)菌數(shù)和乳酸菌數(shù)都隨成熟時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，且乳酸菌的數(shù)量低于總細(xì)菌，可能是由于隨著成熟期的進(jìn)行，干酪的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，碳源減少，微生物生存受限，在Pappa等[26]研究Kashkaval干酪中也得到的相似的結(jié)論。成熟6個(gè)月時(shí)干酪的細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌數(shù)，干酪B高于對(duì)照組A，干酪D組顯著高于干酪C，說明鉀鹽的環(huán)境更有利于微生物的生長，Karimi等[27]研究的鉀鹽部分替代鈉鹽在Feta干酪也有類似的結(jié)果。在成熟期6個(gè)月時(shí)添加L. paracaseiM3的干酪C、D的乳酸菌數(shù)分別為7.90和8.26（lg（CFU/g）），顯著高于干酪A和B（P＜0.05），說明添加附屬發(fā)酵劑L. paracaseiM3使干酪乳酸菌數(shù)量增加，可能進(jìn)而影響干酪蛋白質(zhì)的水解和ACE抑制活性。

2.4 干酪pH 4.6可溶性氮分析

由圖3可知，各組干酪的pH 4.6可溶性氮的含量隨成熟時(shí)間呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.05），并在成熟6個(gè)月時(shí)分別達(dá)到20.16%、21.03%、22.46%、23.84%，主要原因是由于殘留在干酪中的凝乳酶以及發(fā)酵劑有較強(qiáng)的蛋白水解能力，有助于發(fā)生初級(jí)水解[28]，添加L. paracaseiM3的干酪C、D明顯高于對(duì)照組A，說明L. paracaseiM3促進(jìn)蛋白水解產(chǎn)生中小分子肽[29]，鉀鹽替代的干酪B蛋白水解程度高于空白組A，說明鉀鹽提供了更有利于微生物的水解環(huán)境[30]。

圖3 切達(dá)干酪成熟期pH 4.6可溶性氮含量的變化Fig. 3 Change in pH 4.6-SN content in Cheddar cheese during ripening

2.5 干酪總游離氨基酸分析

表2 干酪成熟期總游離氨基酸含量Table 2 Total free amino acid content in Cheddar cheese during ripening

甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.008x-0.005 9（R2=0.995 3），干酪中的微生物尤其是乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶將初級(jí)水解得到的小肽再次進(jìn)行次級(jí)水解得到游離氨基酸[31]。由表2可知，成熟時(shí)間對(duì)干酪的總游離氨基酸含量有顯著影響（P＜0.05），呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在相同成熟期，添加L. paracaseiM3的干酪C、D顯著高于對(duì)照組干酪（P＜0.05），且第6個(gè)月都超過了20 mg/mL，分別比對(duì)照組提高了32.7%和43.3%，說明附屬發(fā)酵劑的添加是有利于深層次的蛋白水解。鉀鹽替代對(duì)干酪總游離氨基酸含量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.6 切達(dá)干酪ACE抑制活性分析

圖4 切達(dá)干酪成熟期ACE抑制率的變化Fig. 4 Change in ACE inhibitory activity of Cheddar cheese during ripening

由圖4可知，各組干酪在成熟期ACE抑制率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)（P＜0.05），隨著蛋白水解深度進(jìn)行，酶分解酪蛋白產(chǎn)生生物活性肽，其中包括ACE抑制肽，使其抑制率上升，郝欣悅等[32]將瑞士乳桿菌添作為益生菌加到切達(dá)干酪也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。其中添加部分鉀鹽的干酪C高于對(duì)照組，主要原因是鉀離子環(huán)境增加了乳酸菌的蛋白酶活力[33]，從而有利于生物活性肽的生成。干酪B、C、D在成熟6個(gè)月之后ACE抑制率達(dá)到了65.2%、74.3%和78.7%，比空白組分別高出19.6%、36.2%和44.4%，說明L. paracaseiM3具有促進(jìn)ACE抑制肽的產(chǎn)生，同時(shí)L. paracaseiM3在部分鉀鹽環(huán)境中酶活力更強(qiáng)。因此，在切達(dá)干酪配方中部分鉀鹽替代和附屬發(fā)酵劑有助于具有益生功能的生物活性肽的產(chǎn)生。從功能角度考慮，部分鉀鹽替代和附屬發(fā)酵劑在切達(dá)干酪配方中存在積極影響。

2.7 干酪質(zhì)構(gòu)分析

表3 干酪成熟6個(gè)月的質(zhì)構(gòu)分析Table 3 Texture analysis of Cheddar cheese after six months of ripening

由表3可知，膠黏性大小看其絕對(duì)值，負(fù)號(hào)代表受力方向向下，各組干酪隨成熟期的進(jìn)行，硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且硬度、咀嚼性下降幅度較大，而膠黏性卻呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。干酪B、C、D的硬度分別是（997.65±14.08）、（1 013.04±25.27）、（942.53±19.93）g顯著低于對(duì)照組A（P＜0.05），說明KCl提供的環(huán)境和L. paracaseiM3的加入促進(jìn)微生物發(fā)生蛋白水解產(chǎn)生小分子物質(zhì)以及肽鍵斷裂的程度更高，使酪蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到更高程度的破壞并發(fā)生坍塌[34]，導(dǎo)致硬度降低，而彈性、內(nèi)聚性、黏性、咀嚼性也因此發(fā)生相應(yīng)的變化。總的來說，KCl和L. ParacaseiM3很好的加速了干酪的成熟。

2.8 切達(dá)干酪電子舌分析

圖5 切達(dá)干酪第6個(gè)月電子舌分析Fig. 5 Electronic tongue analysis of Cheddar cheese ripened for six months

如圖5所示，3個(gè)點(diǎn)代表樣品3個(gè)重復(fù)。PC1貢獻(xiàn)率為68.6%，PC2貢獻(xiàn)率為20.1%，PC1占據(jù)了主要的貢獻(xiàn)率，累計(jì)貢獻(xiàn)率超過80%，說明很好地代表樣品之間的整體信息，距離風(fēng)味指標(biāo)越近，說明樣品在這指標(biāo)強(qiáng)度就越高[35]。PC1與苦味、豐富度、酸味呈正相關(guān)，PC2與咸味呈正相關(guān)。從PC1看出，干酪D的鮮味、酸味、豐富度、苦味高于其他組，說明鉀鹽替代和附屬發(fā)酵劑混合使用明顯影響著干酪的風(fēng)味（P＜0.05）。

2.9 切達(dá)干酪感官評(píng)價(jià)分析

表4 切達(dá)干酪第6個(gè)月的感官評(píng)價(jià)分析Table 4 Sensory evaluation of Cheddar cheese ripened for six months

由表4可知，4 組切達(dá)干酪的色澤，質(zhì)地以及裂縫沒有明顯的差別，說明部分鉀鹽替代以及附屬發(fā)酵劑的添加對(duì)干酪外觀幾乎沒有影響（P＞0.05）；干酪B、C、D的苦味值顯著大于對(duì)照組，說明KCl具有明顯的金屬苦味以及附屬發(fā)酵劑L. ParacaseiM3具有水解蛋白產(chǎn)生苦味肽的功能，干酪B、D咸味值顯著低于干酪A、C（P＜0.05），主要原因是KCl不僅提供咸味，還提供其他味道，而NaCl提供的味道比較單一咸味[36]，Li Feng等[37]研究部分KCl取代NaCl在臘肉中的咸味評(píng)價(jià)也得到相似結(jié)果。附屬發(fā)酵劑對(duì)干酪咸味幾乎沒有影響。

3 結(jié) 論

部分鹽替代和附屬發(fā)酵劑L. paracaseiM3單獨(dú)或者混合使用，對(duì)切達(dá)干酪主成分幾乎沒有影響，其中，附屬發(fā)酵劑的添加使干酪pH值下降，而微生物、pH 4.6可溶性氮、總游離氨基酸、ACE抑制率顯著增加，但是會(huì)使硬度有明顯下降，同時(shí)產(chǎn)生苦味肽，而部分鉀鹽替代，增加了微生物的存活，提高ACE抑制率但也降低硬度和伴隨金屬苦味的生成?？偟膩碚f，部分鉀鹽替代和附屬發(fā)酵劑影響干酪蛋白水解和有助于具有抗高血壓潛力的ACE抑制肽的產(chǎn)生。在后續(xù)的研究中，可以考慮添加風(fēng)味增強(qiáng)劑來彌補(bǔ)附屬發(fā)酵劑和鉀鹽帶來的苦味和其他味道的缺陷。