不同NaCl添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中生物胺產(chǎn)生的影響

宋國(guó)順，張 炎，袁潤(rùn)澤，邱 婷，宋雪梅，梁 琪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)高食鹽攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良影響，例如：影響胃腸道正常功能，增加胃炎、胃潰瘍甚至癌變的發(fā)生幾率[1-3]。富含鈉的飲食也可能與腎臟疾病有關(guān)[4]。全民食鹽攝入量的減少將有助于改善公共健康。因此，低鹽食品的需求量將不斷增多。

除了Domiati干酪之外，所有類(lèi)型干酪都存在鹽的添加。根據(jù)干酪種類(lèi)不同，干酪中鹽含量差異較大。軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)干酪中鹽含量為0.5%～2.5%，藍(lán)紋型干酪中鹽含量為3%～5%[5]。鹽對(duì)干酪組成、風(fēng)味、微生物生長(zhǎng)、酶活性、凝塊收縮等多方面具有重要影響[6-8]。鹽添加量的改變勢(shì)必影響干酪pH值、水分活度、微生物自溶以及蛋白質(zhì)降解等[9]。一般而言，較高鹽濃度能夠降低食品中水分活度，抑制微生物包括產(chǎn)胺微生物的生長(zhǎng)繁殖。然而，鹽含量減少后，微生物菌群發(fā)生變化，發(fā)酵劑生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，非發(fā)酵劑的種類(lèi)和數(shù)量將改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解動(dòng)態(tài)變化，從而影響干酪中代謝產(chǎn)物如生物胺的變化。

生物胺是一類(lèi)具有生物活性的有機(jī)、堿性、含氮化合物，干酪中生物胺的合成需具有脫羧酶的微生物、適宜的環(huán)境條件以及相應(yīng)的氨基酸底物[10]。已在一些成熟期較長(zhǎng)的干酪，如切達(dá)干酪、豪達(dá)干酪、瑞士干酪中發(fā)現(xiàn)生物胺[11-13]。少量生物胺有利于人體生理調(diào)控，但過(guò)量生物胺的攝入會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[14]。馬德勝[15]研究發(fā)現(xiàn)鹽添加量為3%的干酪中生物胺的含量低于鹽添加量為2%和1%的干酪。Santos等[16]研究發(fā)現(xiàn)向乳球菌發(fā)酵的脫脂復(fù)原乳中添加5% NaCl能夠降低生物胺的形成。De A M?ller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與鹽水比為5.4%～6.3%的干酪相比，鹽水比為3.5%～3.7%的干酪中組胺含量更高。Manca等[18]發(fā)現(xiàn)未殺菌綿陽(yáng)乳干酪中生物胺與鹽含量間無(wú)相關(guān)性。由于原料乳、產(chǎn)胺微生物特性、產(chǎn)品工藝、實(shí)驗(yàn)條件等差異，細(xì)胞脫羧酶系統(tǒng)對(duì)環(huán)境因素的反應(yīng)出現(xiàn)較大變化，導(dǎo)致鹽含量對(duì)生物胺形成的影響也呈現(xiàn)差異。

牦牛乳具有較強(qiáng)季節(jié)性，牦牛乳硬質(zhì)干酪的制作能有效充分利用牦牛乳，提高其附加值，助力當(dāng)?shù)啬羺^(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[19]。然而牦牛乳硬質(zhì)干酪生產(chǎn)環(huán)節(jié)中鹽的添加不可或缺，因此，隨著食品工業(yè)對(duì)低鹽食品的關(guān)注，著力發(fā)展低鹽牦牛乳硬質(zhì)干酪，對(duì)于帶動(dòng)牦牛乳產(chǎn)業(yè)升級(jí)具有重要戰(zhàn)略意義。前期研究發(fā)現(xiàn)牦牛乳硬質(zhì)干酪中存在生物胺，但是鹽添加量的減少對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪質(zhì)量安全性的影響卻鮮有報(bào)道。生物胺的形成具有菌株特異性，不同微生物的產(chǎn)胺能力具有較大差異，不同學(xué)者已從干酪中分離出不同產(chǎn)胺微生物如Pseudomonasspp.、Enterococcus faecalis、Enterococcus durans和Debaryomyces hansei等[20]。干酪中微生物區(qū)系與原料乳來(lái)源、制作工藝等密切相關(guān)[21]。

本研究以鹽添加量的改變?yōu)榍腥朦c(diǎn)，探究不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中生物胺的變化規(guī)律，且從不同鹽含量的干酪中篩選產(chǎn)生物胺的菌株，為開(kāi)發(fā)牦牛乳低鹽干酪和調(diào)控牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺的形成提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳采自甘南藏族自治區(qū)卓尼縣木耳鄉(xiāng)大峪溝（海拔2 300 m）。

凝乳酶、發(fā)酵劑（由IDC 604嗜熱發(fā)酵劑與DOM 1嗜溫發(fā)酵劑等質(zhì)量1∶1混合組成） 北京多愛(ài)特生物科技有限公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品、丹磺酰氯、L-脯氨酸、1,7-二氨基庚烷 美國(guó)Sigma公司；色氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、溴甲酚紫 上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醚（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫鈉（分析純） 天津市百世化工有限公司。

M17肉湯培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；pH 5.5的產(chǎn)胺微生物初篩培養(yǎng)基[22]：含0.5%酵母膏、0.5%牛肉膏、0.5%胰化蛋白胨、0.25% NaCl、0.05%葡萄糖、0.1%吐溫80、0.02% MgSO47H2O、0.005% MnSO4·4H2O、0.04%硫酸鐵、0.2%檸檬酸三銨、0.01%碳酸鈣、0.005% VB6、0.2%磷酸氫二鉀、0.006%溴甲酚紫、2%瓊脂，在121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；723型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；WD-12氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；BX53全復(fù)型+DPP4熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；干酪槽為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪的制作和取樣

參考劉興龍等[23]方法制備干酪：牦牛乳→63 ℃巴氏殺菌30 min→冷卻至35 ℃→添加0.006 25 g/L發(fā)酵劑→添加0.3 g/L CaCl2→添加0.667 g/L凝乳酶→凝乳1 h→切割成1 cm3小塊→排乳清→攪拌加鹽（凝塊質(zhì)量的1.0%、1.3%、1.8%和2.3%）→45 ℃二次加熱15 min→堆釀2 h→壓榨成型→真空包裝→成熟。

將制作好的4種不同鹽分的新鮮牦牛乳硬質(zhì)干酪，真空包裝后置于4 ℃冰箱，分別成熟0、1、2、3、4、5、6個(gè)月。將不同成熟期的干酪于-80 ℃貯藏備用。

1.3.2 干酪中NaCl含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測(cè)定》[24]方法測(cè)定牦牛乳硬質(zhì)干酪中NaCl的含量。

1.3.3 干酪pH值的測(cè)定

參考宋雪梅等[25]的方法，稱(chēng)取5 g干酪，加入10 mL蒸餾水混合、勻漿后，用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.4 干酪中游離氨基酸總量的測(cè)定

參考Folkertsma等[26]的方法并適當(dāng)修改。稱(chēng)取1 g干酪，加入9 mL蒸餾水，充分研磨，40 ℃水浴1 h，于3 000 r/min離心30 min后取上清液用快速濾紙過(guò)濾。取30 μL過(guò)濾液，用蒸餾水稀釋至1 mL，加入2 mL鎘-茚三酮溶液，84 ℃反應(yīng)5 min。冷卻后在507 nm處測(cè)定吸光度。以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算干酪中游離氨基酸含量。

1.3.5 干酪中生物胺的測(cè)定

參考Innocente等[27]方法。稱(chēng)取10 g干酪，加入20 mL 0.1 mol/L鹽酸和100 μL 1 mg/mL 1,7-二氨基庚烷（內(nèi)標(biāo)）在50 mL離心管中，勻漿3 min?；旌衔镌? ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，用20 mL 0.1 mol/L鹽酸再次提取殘留物。合并兩次提取的上清液，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL。

將1 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、0.5 mL飽和碳酸氫鈉和1 mL 50 mg/mL丹磺酰氯混合后渦旋1 min，在40 ℃遮光水浴中反應(yīng)1 h。加入200 μL 100 mg/mLL-脯氨酸停止衍生反應(yīng)，用1 mL乙醚提取2次，4 ℃、3 000 r/min離心10 min。將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，用氮?dú)獯抵粮稍?。殘留物溶解? mL乙腈中，經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。

高效液相色譜分析參考Moret等[28]方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。色譜條件：Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫：0～10 min，35% A、65% B；10～21 min，20% A、80% B；21～30 min，0% A、100% B；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3.6 干酪中產(chǎn)胺微生物的篩選

參考谷靜思[22]方法并略作修改。無(wú)菌條件下稱(chēng)取5 g干酪于50 mL滅菌離心管中，加入滅菌后的0.85%生理鹽水45 mL，均質(zhì)后，逐級(jí)稀釋至合適的濃度梯度。取1 mL稀釋液倒入培養(yǎng)皿中，然后在培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL產(chǎn)胺微生物檢測(cè)培養(yǎng)基，立即搖動(dòng)使培養(yǎng)基和稀釋液均勻分布。在37 ℃培養(yǎng)7 d后計(jì)數(shù)，紫色為陽(yáng)性（產(chǎn)生物胺菌），黃色為陰性（不產(chǎn)生物胺菌）。將陽(yáng)性菌用M17培養(yǎng)基純化后進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察鑒別菌株形態(tài)特征。每一濃度稀釋液的培養(yǎng)基做一個(gè)對(duì)照培養(yǎng)皿，用滅菌生理鹽水代替稀釋液，以檢查其無(wú)菌性和空氣污染情況。

1.3.7 干酪中產(chǎn)胺微生物的測(cè)序鑒定

參考谷靜思[22]的方法使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)行測(cè)序鑒定。25 μL PCR體系：2.5 μL 10×Buffer（含20 mmol/L Mg2+）、2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs、正、反向引物各1.5 μL、0.25 μL 5 U/μL ExTaqDNA聚合酶、2 μL DNA模板、16.75 μL無(wú)菌去離子水。細(xì)菌的引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司測(cè)序。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將所得序列與已知序列進(jìn)行對(duì)比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中理化性質(zhì)的變化

由圖1A可知，相同成熟時(shí)間下，鹽添加量為1.8%和2.3%的干酪中鹽含量顯著高于鹽添加量為1.0%和1.3%的干酪（P＜0.05），這與Rulikowska等[9]研究結(jié)果一致。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，不同鹽添加量干酪中鹽含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；且在成熟4個(gè)月之后，4種不同鹽添加量干酪中鹽含量均差異顯著（P＜0.05）。由于不同鹽含量牦牛乳硬質(zhì)干酪的制作工藝相同，因此，這表明后續(xù)各成熟時(shí)間下干酪的理化性質(zhì)以及生化反應(yīng)的變化均與不同鹽添加量有關(guān)。由圖1B可知，干酪pH值在0～1個(gè)月成熟過(guò)程中降低，在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中逐漸升高。這是因?yàn)槌墒斐跗?，干酪中乳酸菌將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸引起pH值降低；隨著成熟進(jìn)程的持續(xù)推進(jìn)，干酪中非發(fā)酵劑乳酸菌進(jìn)一步將乳酸分解為醋酸鹽和CO2[29]，且干酪蛋白質(zhì)也逐漸降解釋放出堿性物質(zhì)[30]，導(dǎo)致干酪pH值升高。此外，鹽添加量為1.8%和2.3%的干酪pH值顯著高于鹽添加量為1.0%和1.3%的干酪（P＜0.05），M?ller等[31]也發(fā)現(xiàn)切達(dá)干酪中鹽添加量減少導(dǎo)致其干酪pH值降低。

圖1 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中NaCl含量（A）和pH值（B）的影響Fig. 1 Effects of different salt content on NaCl content (A) and pH (B)during the maturation of yak milk hard cheese

2.2 不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中游離氨基酸總量的變化

圖2 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中游離氨基酸總量的影響Fig. 2 Effects of different salt content on the total amount of free amino acids during the maturation of yak hard cheese

由圖2可知，不同鹽添加量的干酪在0～6個(gè)月成熟過(guò)程中游離氨基酸總量均顯著增加（P＜0.05）。除未成熟干酪外，相同成熟時(shí)間干酪中游離氨基酸總量隨著鹽添加量的減少也隨之降低，且鹽添加量為1.8%和2.3%的干酪中游離氨基酸總量顯著高于鹽添加量為1.0%和1.3%的干酪（P＜0.05）。McCarthy等[32]研究發(fā)現(xiàn)，全脂切達(dá)干酪中鹽含量由1.9%減少至0.9%時(shí)，干酪中游離氨基酸總量也出現(xiàn)了降低。

2.3 干酪成熟過(guò)程中生物胺含量的變化

2.3.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品丹磺酰氯衍生物色譜圖Fig. 3 Chromatogram of dansyl chloride derivatives of biogenic amine standard

由圖3可知，生物胺衍生物分離效果好，峰形對(duì)稱(chēng)無(wú)拖尾，無(wú)雜質(zhì)干擾，整個(gè)檢測(cè)在22 min內(nèi)完成。以生物胺標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的濃度之比作為自變量，其峰面積之比作為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，結(jié)果如表1所示，各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)決定系數(shù)（R2）均大于0.99。

表1 生物胺的出峰時(shí)間、回歸方程和R2Table 1 Peak times, regression equations and R2 of biogenic amines

2.3.2 干酪成熟過(guò)程中色胺含量的變化

圖4 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中色胺的影響Fig. 4 Effects of different salt content on tryptamine content during the ripening of yak milk hard cheese

由圖4可知，鹽添加量分別為1.0%、1.3%、1.8%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中均檢測(cè)到色胺，鹽添加量為2.3%的干酪中未檢測(cè)到。鹽添加量為1.0%干酪，色胺在0～2個(gè)月成熟過(guò)程中先下降后上升變化緩慢，成熟2個(gè)月后，色胺含量整體呈增加趨勢(shì)并在成熟5個(gè)月達(dá)到最大。鹽添加量為1.3%干酪，色胺在0～6個(gè)月成熟過(guò)程中整體呈增加趨勢(shì)。鹽添加量1.8%的干酪，色胺在0～5個(gè)月成熟過(guò)程中呈現(xiàn)緩慢變化，成熟到6個(gè)月時(shí)，色胺含量顯著增加到最大（P＜0.05）。以上情況表明不同鹽添加量干酪中色胺含量最高形成階段主要在成熟后期。在2～6個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.3%和1.8%干酪中色胺含量差異不顯著（P＞0.05）。在5～6個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.0%和1.3%干酪中色胺含量差異不顯著（P＞0.05）。不同成熟時(shí)間鹽添加量為1.0%、1.3%和1.8%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中色胺含量為0.47～7.5 mg/kg。由于酪蛋白中色氨酸含量較低，導(dǎo)致干酪中前體氨基酸含量也低[33]，從而導(dǎo)致不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪中色胺含量最低。

2.3.3 干酪成熟過(guò)程中β-苯乙胺含量的變化

圖5 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中β-苯乙胺的影響Fig. 5 Effects of different salt content on β-phenethylamine content during the maturation of yak milk hard cheese

由圖5可知，在0個(gè)月時(shí)，鹽添加量分別為1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中β-苯乙胺含量相差甚微（P＞0.05）。在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.0%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中β-苯乙胺含量較低，但其含量整體高于色胺含量。在0～1個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.3%、1.8%和2.3%的干酪中β-苯乙胺增加；成熟到2個(gè)月時(shí)，鹽添加量為1.3%的干酪中β-苯乙胺含量最高，但與鹽添加量為2.3%的干酪相比差異不顯著（P＞0.05）。

在3～6個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.3%、1.8%和2.3%干酪中β-苯乙胺含量整體呈現(xiàn)快速增加趨勢(shì)；特別是鹽添加量為2.3%干酪，β-苯乙胺含量顯著高于鹽添加量為1.0%、1.3%、1.8%干酪（P＜0.05）；鹽添加量為1.0%干酪中β-苯乙胺含量最低。鹽添加量分別為1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中β-苯乙胺分別在成熟5個(gè)月或6個(gè)月達(dá)到最大。這說(shuō)明不同鹽添加量干酪中β-苯乙胺的積累階段主要在成熟后期，且隨著鹽含量降低，干酪中β-苯乙胺含量呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。

2.3.4 干酪成熟過(guò)程中腐胺含量的變化

圖6 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中腐胺的影響Fig. 6 The effects of different salt content on putrescine content during the maturation of yak milk hard cheese

腐胺主要是通過(guò)革蘭氏陰性菌、Enterococcus等乳酸菌形成，經(jīng)胍基丁胺或者鳥(niǎo)氨酸等代謝途經(jīng)，形成過(guò)程復(fù)雜。由圖6可知，在0～6個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.0%和1.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中未檢測(cè)到腐胺。鹽添加量為1.8%和2.3%的干酪在0個(gè)月時(shí)也未檢測(cè)到腐胺。Bover-Cid等[34]發(fā)現(xiàn)更酸的環(huán)境抑制Lactobacillus curvatus產(chǎn)腐胺。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽添加量從2.3%減少到1.0%時(shí)，牦牛乳硬質(zhì)干酪pH值降低（圖1B），因此較低的pH值對(duì)干酪中腐胺形成具有抑制作用。在1～3個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.8%和2.3%的干酪中腐胺呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在4～6個(gè)月成熟過(guò)程中，兩種鹽添加量干酪中腐胺呈現(xiàn)先減少后增加趨勢(shì)。除了成熟4個(gè)月的干酪外，其余成熟階段鹽添加量為2.3%的干酪中腐胺含量顯著高于鹽添加量為1.8%干酪（P＞0.05）。一般而言，鹽對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制程度強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌。本實(shí)驗(yàn)中牦牛乳硬質(zhì)干酪經(jīng)真空包裝避免了成熟過(guò)程中受到污染，因此干酪中腐胺的形成與革蘭氏陽(yáng)性菌相關(guān)程度較高。

2.3.5 干酪成熟過(guò)程中酪胺含量的變化

圖7 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中酪胺的影響Fig. 7 Effects of different salt content on tyramine content during the maturation of yak milk hard cheese

除不同鹽添加量的新鮮牦牛乳硬質(zhì)干酪中未檢測(cè)到酪胺外，鹽添加量分別為1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中均存在酪胺。由圖7可知，在前2個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.0%干酪中酪胺含量增加不顯著（P＞0.05），鹽添加量為1.3%、1.8%和2.3%干酪中顯著增加（P＜0.05）；從成熟第3個(gè)月開(kāi)始，其含量整體呈現(xiàn)明顯快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。但是成熟4個(gè)月時(shí)，鹽添加量1.3%、1.8%和2.3%的干酪中酪胺含量差異不顯著（P＞0.05）；成熟6個(gè)月鹽添加量為1.3%的干酪中酪胺含量最高，為49.81 mg/kg，顯著高于鹽添加量為2.3%的干酪（P＜0.05）。在2～6個(gè)月成熟過(guò)程中，鹽添加量為1.0%的干酪中酪胺含量最低。結(jié)果表明，不同鹽添加量干酪中酪胺積累主要在成熟后期，鹽添加量為1.3%的干酪中酪胺含量較高。酪胺普遍存在于干酪，是毒性最強(qiáng)的生物胺之一，經(jīng)酪氨酸脫羧酶作用于酪氨酸形成。過(guò)量攝入酪胺會(huì)導(dǎo)致機(jī)體血壓升高、嚴(yán)重頭痛、高血壓以及心力衰竭[35]，對(duì)人體健康有影響的酪胺含量為100～800 mg/kg[36]。不同鹽添加量干酪中酪胺含量遠(yuǎn)低于此標(biāo)準(zhǔn)。因此，鹽添加量的調(diào)整未影響牦牛乳硬質(zhì)干酪酪胺的安全劑量。

2.3.6 干酪成熟過(guò)程中尸胺含量的變化

圖8 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中尸胺的影響Fig. 8 Effects of different salt content on cadaverine content during the maturation of yak milk hard cheese

由圖8可知，鹽添加量為1.0%的牦牛乳硬質(zhì)干酪，在0～4個(gè)月成熟過(guò)程中，其尸胺含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），到第5個(gè)月時(shí)，含量達(dá)到最高且差異顯著（P＞0.05）。鹽添加量為1.3%的干酪在0～2個(gè)月成熟過(guò)程中其尸胺含量并無(wú)顯著差異（P＞0.05），到第3個(gè)月時(shí)含量最高且差異顯著（P＜0.05），在4～6個(gè)月成熟過(guò)程中無(wú)顯著差異（P＞0.05）。鹽添加量為1.8%干酪，在0～1個(gè)月成熟過(guò)程中尸胺呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì)，與鹽添加量為1.0%、1.3%干酪中尸胺含量相比差異不顯著（P＞0.05）；從第2個(gè)月起，鹽添加量為1.8%干酪中尸胺較快增加，到第4個(gè)月時(shí)，含量達(dá)到最高。鹽添加量為2.3%的干酪中尸胺在0～3個(gè)月成熟過(guò)程中呈現(xiàn)較快增加趨勢(shì)，在4～6個(gè)月時(shí)，增加趨勢(shì)變緩。在3～6個(gè)月成熟階段，鹽添加量為2.3%的干酪中尸胺顯著高于鹽添加量為1.0%、1.3%和1.8%的干酪（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，不同鹽添加量的干酪中尸胺的積累主要在成熟后期；當(dāng)鹽添加量低于1.3%時(shí)，鹽含量對(duì)干酪中尸胺含量影響較小，當(dāng)鹽添加量在1.8%～2.3%時(shí)，隨著鹽含量的增加，干酪中尸胺含量整體增加。

2.3.7 干酪成熟過(guò)程中總生物胺含量的變化

圖9 不同鹽添加量對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過(guò)程中總生物胺的影響Fig. 9 Effect of different salt content on the total amount of biogenic amines during the maturation of yak milk hard cheese

牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺主要包含色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺。由圖9可知，鹽添加量分別為1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的干酪在1～6個(gè)月成熟過(guò)程中，生物胺總量整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。成熟到6個(gè)月時(shí)，2.3% NaCl添加量的干酪中生物胺總量是添加量為1.0%干酪的5.66 倍，是添加量為1.3%干酪的2.65 倍，是鹽添加量為1.8%干酪的1.31 倍。總體來(lái)看，鹽添加量為2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中總生物胺含量最高（除未成熟和成熟4個(gè)月外），其次為鹽添加量為1.8%、1.3%的干酪，鹽添加量為1.0%的干酪中總生物胺含量最低。

干酪中生物胺主要通過(guò)微生物所含的脫羧酶作用于游離氨基酸形成。而鹽通過(guò)影響微生物生長(zhǎng)狀態(tài)、酶活性、干酪pH值等進(jìn)而對(duì)生物胺形成產(chǎn)生影響。生物胺是微生物適應(yīng)酸性環(huán)境過(guò)程所產(chǎn)生的物質(zhì)。然而，Pircher等[37]發(fā)現(xiàn)Enterobacteriaceae在低酸環(huán)境產(chǎn)尸胺的含量減少。Marcobal等[38]發(fā)現(xiàn)快速酸化可通過(guò)減少污染的革蘭氏陰性微生物的生長(zhǎng)而減少生物胺的產(chǎn)生。游離氨基酸是生物胺形成的前體物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)鹽添加量的減少導(dǎo)致牦牛乳硬質(zhì)干酪中游離氨基酸含量減少和pH值降低（圖1）。因此，低鹽牦牛乳硬質(zhì)干酪的較低pH值和較低游離氨基酸有助于減少其生物胺形成。

2.4 干酪中產(chǎn)胺微生物的篩選與鑒定

氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下生成胺和二氧化碳，pH值升高，含溴甲酚紫指示劑的培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樽仙?。與對(duì)照組相比，含有牦牛乳硬質(zhì)干酪樣品的培養(yǎng)基中存在紫色菌落，初步判斷存在陽(yáng)性菌株即產(chǎn)生物胺菌。將產(chǎn)生物胺的菌落多次培養(yǎng)劃線(xiàn)純化后，挑取單菌落觀(guān)察其菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌落在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)較好，24 h培養(yǎng)后形成圓形菌落，灰白色，濕潤(rùn)隆起，有光澤。革蘭氏染色顯示為陽(yáng)性球菌。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定該株產(chǎn)胺菌為E. durans。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽添加量分別為1.0%、1.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺主要為色胺、β-苯乙胺、尸胺和酪胺；鹽添加量為1.8%的干酪中主要為色胺、β-苯乙胺、尸胺、腐胺和酪胺；鹽添加量為2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺主要為β-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺。前人研究表明干酪中主要生物胺為酪胺、組胺、腐胺、尸胺和β-苯乙胺[39]，不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪中均不同程度地檢測(cè)到大多數(shù)生物胺。鹽添加量1.0%和1.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪在成熟前2個(gè)月尸胺含量占總生物胺含量的比例最高，從成熟第3個(gè)月起，酪胺含量的占比最高，而鹽添加量1.8%和2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪中腐胺含量比例較高，其次為尸胺含量。不同鹽添加量干酪中生物胺積累階段主要集中在成熟后期，這與之前發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致[24]。以上說(shuō)明鹽添加量的改變不影響干酪生物胺的形成，但鹽添加量的改變影響了干酪中生物胺的種類(lèi)和積累程度。

目前，乳制品中關(guān)于生物胺的含量并未做強(qiáng)行性限量規(guī)定，但與大多數(shù)食物中毒相關(guān)的生物胺主要為組胺和酪胺。成熟0～6個(gè)月，不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪中酪胺含量為3.13～49.81 mg/kg，遠(yuǎn)低于Ten Brink等[36]報(bào)告的酪胺最大耐受限度為100～800 mg/kg。不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪中均未檢測(cè)到組胺，且生物胺總量最高為304.18 mg/kg。尸胺和腐胺一般認(rèn)為沒(méi)有毒性，但是它們可能會(huì)加強(qiáng)組胺和酪胺毒性。學(xué)者建議干酪中生物胺總量不應(yīng)超過(guò)900 mg/kg[40]，因此，從生物胺角度來(lái)講，鹽添加量的改變對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪質(zhì)量安全的影響有限。

干酪中鹽對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖的影響因菌株差異而不同。一般認(rèn)為較高的鹽濃度能夠抑制細(xì)菌中某些菌株的生長(zhǎng)或者脫羧酶活性[41]。然而，Buňková等[42]發(fā)現(xiàn)5 株乳酸乳球菌在含鹽量2%的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的酪氨酸高于含鹽量1%的培養(yǎng)基，同時(shí)發(fā)現(xiàn)E. duransCCDM 53在較高的含鹽量2%培養(yǎng)基上產(chǎn)生的酪胺含量高于含鹽量1%培養(yǎng)基[43]。Bubelová等[44]發(fā)現(xiàn)在鹽添加量為1%～3%且pH 5～7時(shí)，能夠刺激Serratia marcescensCCM 303產(chǎn)生大量的腐胺和尸胺。此外，有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽含量達(dá)到3%～6%時(shí)能抑制E. faecalis、Enterobacter等脫羧酶活性導(dǎo)致生物胺形成減少[45-46]。本實(shí)驗(yàn)所研究的不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪中鹽含量在0.6%～1.7%之間，在這個(gè)鹽含量較低的范圍內(nèi)，鹽含量的增多促進(jìn)生物胺增多。這是因?yàn)镹a+參與維持細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)態(tài)，在氨基酸脫羧途徑中發(fā)揮重要作用，而且這些離子能夠與從細(xì)胞中移除的氫離子進(jìn)行交換，在鈉/質(zhì)子反轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中也很重要[47]。另外，研究表明，鹽含量相同時(shí)，較弱酸性環(huán)境也可促進(jìn)生物胺形成[45]。鹽添加量為1.8%和2.3%的牦牛乳硬質(zhì)干酪pH值較高（圖1B），這強(qiáng)化了干酪中大多數(shù)生物胺的積累。因此，當(dāng)鹽添加量低于2.3%時(shí)，干酪中較低的游離氨酸含量和較低的pH值導(dǎo)致低鹽牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺含量減少。

產(chǎn)胺微生物的存在是生物胺生物合成的必要條件，而且生物胺的形成在大多數(shù)情況下與菌株相關(guān)[48]。本實(shí)驗(yàn)從牦牛乳硬質(zhì)干酪中篩選出一株產(chǎn)胺菌為E. durans。Enterococcus普遍存在于原料乳和乳制品中，大量干酪凝塊和成熟干酪中也被報(bào)道存在[49]。Ladero等[50]研究發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌并不能完全將Enterococcus殺滅。Enterococcus在pH 3.8～4.5的酸性希臘干酪或者成熟的酸凝干酪中的生長(zhǎng)受到抑制[51]，而在堿性環(huán)境中能夠生長(zhǎng)，在乳制品中產(chǎn)生大量生物胺[52]。Galgano等[53]從Semicotto Caprino干酪中篩選的Enterococcus具有較強(qiáng)的產(chǎn)酪胺和苯乙胺的能力。Li Jing等[54]從西藏傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離的5種E. durans存在寬泛的脫羧酶能力，大多數(shù)能夠產(chǎn)酪胺、腐胺等。Ladero等[55]發(fā)現(xiàn)Enterococcus產(chǎn)腐胺和酪胺是物種特性。食品中發(fā)現(xiàn)的Enterococcus種類(lèi)主要有E. faecalis、Enterococcus faecium、E. durans和Enterococcus casseliflavus[56]。本實(shí)驗(yàn)在牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出的為E. durans。Enterococcus對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺的形成起重要作用，但是生物胺的形成非常復(fù)雜，既依賴(lài)于微生物種類(lèi)，也與微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、蛋白質(zhì)降解以及脫羧酶活性等相關(guān)，后續(xù)需進(jìn)一步加大對(duì)產(chǎn)胺微生物的識(shí)別、Enterococcus生長(zhǎng)和產(chǎn)胺特性的分析，為進(jìn)一步控制干酪中生物胺形成提供一定理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

不同鹽添加量牦牛乳硬質(zhì)干酪中生物胺主要為色胺、β-苯乙胺、尸胺、酪胺和腐胺，未檢測(cè)到組胺，生物胺積累階段主要集中在成熟后期。不同鹽添加量干酪中色胺含量最低，且在成熟后期含量差異較小。當(dāng)鹽添加量從2.3%減少到1.0%時(shí)，干酪中β-苯乙胺含量減少。鹽添加量分別為1.0%和1.3%時(shí)，干酪中尸胺含量較低，且未檢測(cè)出腐胺。當(dāng)鹽添加量在1.8%～2.3%時(shí)，隨著鹽含量的增加，干酪中尸胺和腐胺含量整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。不同鹽添加量的干酪成熟過(guò)程中，酪胺含量范圍為3.13～49.81 mg/kg，且生物胺總量最高為304.18 mg/kg。經(jīng)顯色培養(yǎng)基篩選，分子生物學(xué)鑒定出一株產(chǎn)胺微生物為E. durans。該研究為開(kāi)發(fā)低鹽牦牛乳硬質(zhì)干酪提供了一定理論支持。