PBK/TOPK表達與老年急性髓系白血病患者治療反應(yīng)和生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析

吳文萍， 徐林娟， 王佳亨， 張娜娜

（衢州市人民醫(yī)院血液科，浙江 衢州 324000）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種惡性血液系統(tǒng)克隆性腫瘤，具有高度異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)為骨髓原始細胞異常累積和正常血細胞生成障礙[1]，是成人急性白血病中最常見的類型，發(fā)病率隨年齡的增長逐漸增高，我國老年AML患者（≥60歲）發(fā)病年齡約為67歲[2]。吸煙、病毒感染、長時間輻射暴露等均可能誘發(fā)AML[3]。目前，老年AML患者的臨床治療主要包括“3+7”基礎(chǔ)化療方案、低強度治療和支持治療，但由于老年AML患者臟器功能差、合并癥多、不良遺傳核型等多種不良預(yù)后因素，其5年存活率僅為5%～10%[4-5]。

PBK/TOPK是由激酶亞結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)合域組成的絲-蘇氨酸激酶，在有絲分裂期間活化和磷酸化，屬MAP-KK分子家族成員[6-7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PBK/TOPK在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、黑色素瘤中高表達，在除睪丸生殖細胞和胎兒組織外的正常組織中無法檢出，與惡性腫瘤細胞的增殖和擴散有關(guān)[8]。然而，關(guān)于PBK/TOPK表達與老年AML患者治療反應(yīng)和生存預(yù)后的關(guān)系鮮有報道。本研究以老年AML患者為研究對象，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測PBK/TOPK在老年AML患者骨髓單個核細胞中的表達水平，評估其與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年7月—2017年3月于衢州市人民醫(yī)院住院治療的老年AML患者80例（AML組），其中男48例、女32例，年齡（69.8±6.5）歲，均依據(jù)世界衛(wèi)生組織分型診斷標準[9]確診。排除標準：（1）年齡<60周歲；（2）患急性早幼粒細胞白血病、繼發(fā)性或治療相關(guān)急性髓系白血??；（3）AML復發(fā)；（4）接受過化療或其他治療；（5）合并精神疾病、嚴重肝臟疾病、腎臟疾病或自身免疫系統(tǒng)疾??；（6）美國東部腫瘤協(xié)作組（the Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）體能狀態(tài)評分（performance status，PS）>4分。

另選取同期衢州市人民醫(yī)院行骨髓穿刺活檢的≥60歲非惡性血液疾病患者32例作為對照組，其中男19例、女13例，年齡（67.91±5.89）歲。本研究經(jīng)衢州市人民醫(yī)院倫理審查委員會批準（倫理審批號：20160225），所有患者及其家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基本信息收集 收集AML患者年齡、性別、外周血血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、血小板（platelet，PLT）計數(shù)、法美英（French-America-British，F(xiàn)AB）分型、染色體核型、基因突變類型、骨髓原始細胞比例、外周血原始細胞比例等臨床資料。

1.2.2 樣本采集 采集所有患者入院后治療前骨髓樣本和外周血各2～3 mL。骨髓樣本采用肝素抗凝，在15 mL離心管中加入人淋巴細胞分離液后加入樣本，447×g離心20 min，分離骨髓單個核細胞，-80 ℃冷凍保存。外周血樣本離心后分離血清，冷凍保存。

1.2.3 主要儀器與試劑 Trizol試劑盒（日本TaKaRa公司），ReverTraAce qPCR RT Kit和SYBR Gene Realtime PCR Master Mix（日本Toyobo公司），CFX96型熒光定量PCR儀（美國Bio-RAD公司），DanoDrop 1000超微量蛋白核酸分析儀（美國ThermoFisher Scientific公司），引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計并合成，人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司。血液檢測均由衢州市人民醫(yī)院血液病研究部完成。

1.2.4 PBK/TOPK表達的檢測 將凍存的單個核細胞37 ℃水浴復蘇，按Trizol試劑盒說明書要求提取骨髓單個核細胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR。PBK/TOPK正向引物序列為5'-GAGAGTGGCTTTCACAATGGA-3'，反向引物序列為5'-GGCCGGGATATTTATAGTTGGA-3'；β-actin正向引物序列為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物序列為5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。反應(yīng)條件：90 ℃5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃5 min。采用2-ΔΔCt法計算PBK/TOPK mRNA相對表達量。根據(jù)PBK/TOPK相對表達量的中位數(shù)將AML患者分為PBK/TOPK高表達組和低表達組。

1.2.5 治療與評估 依據(jù)患者身體狀況和疾病發(fā)生情況，對其進行誘導治療。包括柔紅霉素-阿糖胞苷（daunorubicin-cytarabine，DA）、去甲氧柔紅霉素-阿糖胞苷（demethoxydaunor-cytarabine,IA)、阿克拉霉素-阿糖胞苷（aclacinomycincytarabine，AA）、高三尖杉酯堿-阿糖胞苷（homoharringtonine-cytarabine，HA）、米托蒽醌-阿糖胞苷（mitoxantrone-cytarabine，MA）、阿糖胞苷和阿克拉霉素聯(lián)合細胞集落刺激因子（cytosine arabinoside and aclamycin combined with colony stimulating factor，CAG）等傳統(tǒng)化療方案及地西他濱聯(lián)合減量化療方案。按照《血液病診斷及療效標準》[10]判斷是否完全緩解（complete remission，CR）：（1）患者未出現(xiàn)由白血病細胞浸潤引起的相關(guān)臨床癥狀，生活無明顯異常；（2）患者外周血中未檢測到異常血細胞，Hb≥100 g/L（男）或≥90 g/L（女），中性粒細胞絕對值≥1.0×109/L，PLT計數(shù)≥100×109/L；（3）Ⅰ型或Ⅱ型骨髓原始粒細胞≤5%。

1.2.6 隨訪 采用電話訪問、門診復查、病歷查詢等方式對AML患者進行定期隨訪，隨訪截止時間為2020年2月15日。統(tǒng)計所有患者無進展生存期（event free survival，EFS）和總生存期（overall survival，OS），EFS為自首次CR至復發(fā)、死亡或隨訪截止日期的時長，OS為自確診至死亡或隨訪截止日期的時長。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。通過Shaopiro-Wilk法對計量資料進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。當樣本例數(shù)較少（<40）或理論頻數(shù)較?。═<5）時，采用Fisher精確性檢驗。采用Spearman等級檢驗進行相關(guān)性分析采用Kaplan-Meier生存曲線分析不同PBK/TOPK表達水平老年AML患者EFS和OS。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者一般臨床資料分析

AML患者初診時外周血WBC計數(shù)為11.16（2.75，50.21）×109/L，Hb為（74.69±20.31）g/L，PLT計數(shù)為37.50（19.00，68.00）×109/L，骨髓原始細胞比例為58.24%±23.85%，外周血原始細胞比例為34.00%（7.75%，74.00%）。

FAB分型結(jié)果顯示，80例老年AML患者中，M2型所占比例最高（35.00%）；細胞遺傳學檢測結(jié)果顯示，老年AML患者伴重現(xiàn)性染色體異常41例（51.25%），正常核型39例（48.75%）。19例（23.75%）患者基因檢測正常，61例（76.25%）患者檢出基因異常，51.25%的AML患者預(yù)后不良。見表1。

表1 80例老年AML患者一般臨床資料

2.2 2個組骨髓單個核細胞中PBK/TOPK的表達

AML組骨髓樣本中均檢測到PBK/TOPK表達，相對表達量為3.47±0.74；對照組PBK/TOPK相對表達量為1.43±0.45。AML組PBK/TOPK表達水平顯著高于對照組（P<0.05）。見圖1。

圖1 AML組和對照組骨髓單個核細胞PBK/TOPK的表達

2.3 PBK/TOPK表達與老年AML患者臨床特征的關(guān)系

有49例AML患者PBK/TOPK高表達，31例低表達。PBK/TOPK相對表達量與患者Hb、PLT計數(shù)、染色體核型和基因突變類型有關(guān)（P<0.05），與患者年齡、性別、FAB分型、PS評分、WBC計數(shù)、骨髓原始細胞比例、外周血原始細胞比例及骨髓增生程度無關(guān)（P>0.05）。見表2。

表2 PBK/TOPK表達與老年AML患者臨床特征的關(guān)系 例

2.4 PBK/TOPK表達與老年AML患者治療反應(yīng)的相關(guān)性

PBK/TOPK表達與老年AML患者CR率呈負相關(guān)（r=-0.743，P<0.05）。PBK/TOPK高表達與低表達AML患者CR率見表3。

表3 不同PBK/TOPK表達水平老年AML患者CR率 例（%）

2.5 PBK/TOPK表達與老年AML患者生存期的關(guān)系

80例AML患者隨訪時間為3.0～36.0個月，中位隨訪時間為20.0個月，隨訪完成率為100%。隨訪結(jié)果顯示，PBK/TOPK高表達患者1年復發(fā)11例，死亡9例；31例PBK/TOPK低表達患者1年復發(fā)8例，死亡5例。2個組之間1年復發(fā)率和1年生存率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。PBK/TOPK高表達患者3年復發(fā)42例（85.7%），死亡30例（61.2%）；PBK/TOPK低表達患者3年復發(fā)21例，死亡11例。2個組之間3年復發(fā)率和3年生存率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

PBK/TOPK高表達患者的中位EFS[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）（5.9～12.2）]為9個月，明顯低于PBK/TOPK低表達患者[14.0（8.8～18.6）個月]（P<0.01）。PBK/TOPK低表達患者中位OS（95%CI）為21.0（16.2～26.4）個月，明顯長于PBK/TOPK高表達患者[15.0（15.1～20.9）個月]（P<0.01）。見圖2。

圖2 PBK/TOPK表達與老年AML患者OS、EFS的關(guān)系

3 討論

AML是常見的成人白血病，美國國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，新發(fā)AML病例中，≥65歲患者占57.4%[11]，老年人造血系統(tǒng)以粒系造血為主，且基礎(chǔ)疾病多，臟器功能代償能力差，更容易出現(xiàn)不良細胞遺傳學改變、骨髓增生異常綜合征等不良預(yù)后因素，影響誘導化療的療效。因此，本研究針對老年AML患者PBK/TOPK表達與治療反應(yīng)、生存預(yù)后的關(guān)系進行初步分析。

本研究結(jié)果顯示，80例老年AML患者中，M2型（35.00%）發(fā)病率最高，以下依次為M4型（26.25%）、M5型（23.75%）、M0型（6.25%）、M1型（3.75%）、M6型（2.50%）和不確定型（2.50%）。細胞遺傳學和分子生物學標志物檢測對AML診斷、治療和預(yù)后十分重要，老年AML患者較少發(fā)生t（8；21）等預(yù)后良好的染色體改變，而-5/del（5q）、-7/del（7q）或復雜核型等預(yù)后不良核型則較為常見。本研究中，染色體核型異常檢出率為51.25%，與國內(nèi)外報道的AML患者異常核型檢出率（46.70%～57.78%）一致[12-13]。有研究結(jié)果表明，具有NPM1突變的AML患者預(yù)后較好，而存在FLT3-ITD突變的AML患者則預(yù)后較差[14]。SCHNEIDER等[15]的研究結(jié)果顯示，≥60歲AML患者NPMl和FLT3-ITD突變率分別為37.31%和20.68%。而在本研究中，NPMl和FLT3-ITD突變率分別為8.75%、27.50%，提示NPMl和FLT3-ITD突變可能與AML患者地域和種族差異有關(guān)。

PBK/TOPK在特定增殖的正常細胞和高度增殖的腫瘤細胞中表達，與細胞增殖分化和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PBK/TOPK與白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LIU等[16]和ALACHKAR等[17]均發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK在AML患者中高表達，SIMONS等[18]發(fā)現(xiàn)其在成人Burkitts淋巴瘤中高表達，與本研究AML組PBK/TOPK表達水平顯著高于對照組的研究結(jié)果一致，提示PBK/TOPK在AML中發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果顯示，PBK/TOPK低表達的AML患者無FLT3-ITD突變率更低，且染色體核型正常者所占比例更高。原因可能是PBK/TOPK可通過與cdk1/cyclin B結(jié)合形成復合物，影響細胞有絲分裂紡錘體的形成，而cdk1/cyclin B主要通過在T9位點的磷酸化來結(jié)合PBK/TOPK，上調(diào)cyclin B表達，加速細胞G2/M期進程，從而加快腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤的發(fā)生。而PBK/TOPK表達在不同Hb和PLT計數(shù)人群中的差異性表達可能與AML的進展有關(guān)。PBK/TOPK在AML患者預(yù)后方面的相關(guān)研究較少，一項針對兒童惡性淋巴瘤的研究結(jié)果表明，PBK/TOPK陽性表達患兒中位生存時間和5年生存率均顯著低于PBK/TOPK陰性表達患兒[19]。本研究結(jié)果顯示，PBK/TOPK高表達的老年AML患者預(yù)后情況較低表達患者差，PBK/TOPK低表達患者CR率高于PBK/TOPK高表達患者，說明PBK/TOPK低表達患者標準化治療效果更佳。本研究結(jié)果顯示，治療1年后不同PBK/TOPK表達患者復發(fā)率和生存率差異均無統(tǒng)計學意義（P<0.05），但PBK/TOPK高表達患者3年生存率均較低表達患者低。原因可能是PBK/TOPK高表達可調(diào)節(jié)多個靶基因，促進AML細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，導致患者生存期縮短[20-21]。

綜上所述，PBK/TOPK在老年AML患者中表達增加，并且其高表達與患者臨床特征相關(guān)，可在一定程度上預(yù)測老年AML患者的生存預(yù)后情況。但本研究樣本量較小，患者多來自衢州市相鄰地區(qū)，關(guān)于PBK/TOPK在老年AML患者預(yù)后中的作用還需要進一步的研究數(shù)據(jù)來驗證。