酶底物法檢測(cè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廢水中糞大腸菌群的適用性分析

林 健

(福州市臺(tái)江環(huán)境監(jiān)測(cè)站，福建 福州 350004)

0 引言

糞大腸菌群是指具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，它不是按細(xì)菌分類(lèi)學(xué)命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語(yǔ)，指的不是某一種或某一屬細(xì)菌，而是一類(lèi)生長(zhǎng)于人和溫血?jiǎng)游锬c道中的一組細(xì)菌，能夠適應(yīng)較高的培養(yǎng)溫度，是總大腸菌群中的一部分，主要來(lái)自糞便[1]。北美國(guó)家的研究文獻(xiàn)著重強(qiáng)調(diào)其糞性來(lái)源，多使用“糞大腸菌群”的叫法，而歐洲國(guó)家則強(qiáng)調(diào)其對(duì)溫度的耐受性方面特點(diǎn)，能夠適應(yīng)較高的培養(yǎng)溫度，稱(chēng)其為“耐熱大腸菌群”。我國(guó)對(duì)它的定義隨著標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法的不同而變化，《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)對(duì)糞大腸菌群的定義為“在44.5℃溫度下能生長(zhǎng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的大腸菌群”；酶底物檢測(cè)法則利用其方法原理，將糞大腸菌群定義為“44.5℃培養(yǎng)24小時(shí)，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌”。

醫(yī)療污水指醫(yī)療機(jī)構(gòu)門(mén)診、病房、手術(shù)室、各類(lèi)檢測(cè)室、病理解剖室、放射室、洗衣房、太平間等處排出的診療、生活及糞便污水，當(dāng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)其他廢水同上述污水混合排出時(shí)一律視為醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水[2]。不同于其他污水，醫(yī)療廢水成分復(fù)雜，含有大量細(xì)菌、病毒等微生物，具有一定的傳染性和細(xì)胞毒性。在實(shí)際工作中，對(duì)水體所有可能的致病微生物進(jìn)行檢測(cè)不太現(xiàn)實(shí)，一般會(huì)選擇檢測(cè)某一類(lèi)具有代表性的微生物作為指示菌，以反映水體被污染的程度。而醫(yī)療廢水中的糞大腸菌群可以作為一種特征指示菌，因該病菌可能導(dǎo)致腸道病毒的傳播，如傷寒、霍亂和傳染性肝炎等，是醫(yī)療機(jī)構(gòu)污染物排放情況的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于水體衛(wèi)生質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

目前國(guó)內(nèi)外有多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片法、酶底物法等多種方法檢測(cè)水中的糞大腸菌群，這些方法各有優(yōu)劣勢(shì)，適用范圍也有所區(qū)別。其中多管發(fā)酵法和酶底物法在結(jié)果表示上均使用一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)MPN法，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是利用細(xì)菌在水體中是隨機(jī)分布的特性，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)概率理論，通過(guò)查表估算一定體積水樣中目標(biāo)微生物的濃度。這兩種方法檢測(cè)原理不同，多管發(fā)酵法從活性細(xì)菌的生化反應(yīng)進(jìn)行判斷，而酶底物法根據(jù)酶原反應(yīng)進(jìn)行判斷。由于在《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定 酶底物法》(HJ 1001—2018)中的適用范圍未明確酶底物法可用于檢測(cè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廢水，環(huán)境檢測(cè)機(jī)構(gòu)在開(kāi)展此類(lèi)檢測(cè)工作中，普遍采用《醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 18466—2005)中的附錄A多管發(fā)酵法或者與附錄A方法原理相同的可適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)廢水監(jiān)測(cè)的《水質(zhì) 糞大腸菌群的測(cè)定 多管發(fā)酵法》(HJ 347.2—2018)[3]。但是多管發(fā)酵法檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，需要確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。相對(duì)而言，酶底物法可使用成品培養(yǎng)基，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、結(jié)果可靠，可以很大程度省去前期培養(yǎng)基準(zhǔn)備和玻璃儀器清洗的人力和時(shí)間，實(shí)驗(yàn)廢物易集中滅菌處理，被世界各國(guó)和各組織機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用于水質(zhì)檢測(cè)[4]。

本文應(yīng)用多管發(fā)酵法和酶底物法同時(shí)檢測(cè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廢水中糞大腸菌群，通過(guò)分析所得的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，開(kāi)展技術(shù)等效性驗(yàn)證，討論酶底物法的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

比對(duì)試驗(yàn)中用到的培養(yǎng)基、試劑、儀器設(shè)備和方法等分別按照《水質(zhì) 糞大腸菌群的測(cè)定 多管發(fā)酵法》(HJ 347.2—2018)15管法和《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定 酶底物法》(HJ 1001—2018)準(zhǔn)備和測(cè)定。

1.1 主要材料與設(shè)備

儀器和設(shè)備參數(shù)見(jiàn)表1、表2。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器情況

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備情況

1.2 水樣來(lái)源

為確保水樣具有代表性，本次醫(yī)療機(jī)構(gòu)廢水選取自轄區(qū)內(nèi)兩家床位數(shù)1000張以上的大型三甲醫(yī)院、兩家床位數(shù)約150張的二乙醫(yī)院，以及兩家床位數(shù)約30張的專(zhuān)科醫(yī)院。因疫情期間，醫(yī)療機(jī)構(gòu)均加大消毒力度，總排放口出水的糞大腸菌群數(shù)普遍偏低，為保證數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)意義，水樣應(yīng)有足夠的陽(yáng)性檢出率，部分水樣為消毒工序前后以適當(dāng)比例混合的廢水，共采集廢水樣36份。

1.3 實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析

1.3.1 試驗(yàn)一

方法的技術(shù)等效性主要是通過(guò)兩種方法檢測(cè)同一樣品，分析檢測(cè)結(jié)果的精密度和正確度是否存在顯著性差異[5]。因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其中1份醫(yī)療廢水樣采用多管發(fā)酵法15管法和酶底物法分別在重復(fù)性條件下進(jìn)行6次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 多管發(fā)酵法與酶底物法重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

表4 F檢驗(yàn)結(jié)果

采用t檢驗(yàn)法比較這兩組數(shù)據(jù)平均值的一致性，由表5得到t統(tǒng)計(jì)值

表5 t檢驗(yàn)結(jié)果

1.3.2 試驗(yàn)二

對(duì)36份醫(yī)療機(jī)構(gòu)廢水分別嚴(yán)格按照多管發(fā)酵法15管法和酶底物法開(kāi)展試驗(yàn)分析，檢測(cè)水中的糞大腸菌群，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1，線性回歸情況見(jiàn)圖2。由圖2可得，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.984，表明多管發(fā)酵法結(jié)果和酶底物法結(jié)果呈顯著的正向影響關(guān)系，兩組數(shù)據(jù)有較好的趨勢(shì)性。

圖1 多管發(fā)酵法與酶底物法檢測(cè)結(jié)果

圖2 多管發(fā)酵法與酶底物法線性回歸分析

運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)工具對(duì)多管發(fā)酵法與酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群的結(jié)果分別進(jìn)行線性回歸分析和配對(duì)t檢驗(yàn)分析，由表6可知，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)β值為0.984，非標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)B達(dá)到0.986，回歸系數(shù)t檢驗(yàn)為31.915，將多管發(fā)酵法作為自變量，意味著多管發(fā)酵法可以解釋酶底物法的96.8%變化原因。表7配對(duì)t結(jié)果表明，多管發(fā)酵法與酶底物法檢測(cè)結(jié)果的P值為0.103，大于0.05，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異[6]，可以認(rèn)為兩種方法在檢測(cè)醫(yī)療廢水中的糞大腸菌群技術(shù)上是等效的。

表6 多管發(fā)酵法與酶底物法檢測(cè)結(jié)果的線性回歸分析

表7 多管發(fā)酵法與酶底物法的配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果

2 討論

為減少試驗(yàn)誤差，需做好以下質(zhì)量控制工作:①本試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)象糞大腸菌群是微生物活體，其增長(zhǎng)繁殖是以幾何級(jí)數(shù)量遞增的，因此多管發(fā)酵法與酶底物法的比對(duì)試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)開(kāi)展；②在制作試管培養(yǎng)基過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)小導(dǎo)管中有氣泡的問(wèn)題，影響結(jié)果判讀，可使用透氣性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。高溫蒸汽滅菌鍋應(yīng)自然冷卻至內(nèi)外壓力和溫度平衡時(shí)再打開(kāi)鍋蓋；③水樣分析前，應(yīng)調(diào)節(jié)樣品的pH值，并確認(rèn)培養(yǎng)基和無(wú)菌水的pH值，避免多管發(fā)酵法試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的情況；④多管發(fā)酵法復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物后30min內(nèi)放進(jìn)提前預(yù)熱的恒溫培養(yǎng)箱，否則非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)繁殖可能導(dǎo)致假陽(yáng)性，影響試驗(yàn)結(jié)果；⑤微生物在環(huán)境水體中的分布是不均勻的，在分樣前應(yīng)確保水樣混合均勻，使用渦旋振蕩器可以達(dá)到混勻效果，同時(shí)避免手搖混勻?qū)е碌臉悠坊颦h(huán)境污染；⑥溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖影響很大，在培養(yǎng)過(guò)程中可使用在線溫度監(jiān)控設(shè)備監(jiān)控培養(yǎng)箱的運(yùn)行狀況，確保溫度波動(dòng)在合理的區(qū)間范圍。

3 結(jié)論

通過(guò)以上兩組試驗(yàn)證明，多管發(fā)酵法和酶底物法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，兩種檢測(cè)方法是等效的，酶底物法可以用于醫(yī)療廢水中的糞大腸菌群的檢測(cè)。由于酶底物法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)、假陽(yáng)性率低，能夠用于大批量水質(zhì)檢測(cè)工作，快速評(píng)價(jià)各類(lèi)水體受污染的狀況，同時(shí)減少環(huán)境污染和人員感染的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)預(yù)報(bào)、預(yù)防和控制流行疾病傳播具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。