清燥救肺湯含藥血清對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞惡性行為的影響

張美英， 侯煒， 高坤

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100053）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是指源于支氣管黏膜上皮或者肺泡上皮的惡性腫瘤，是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型。隨著中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)在治療肺癌方面取得了顯著的成果。肺癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“肺痿”的范疇，燥熱傷肺是肺癌的重要病機(jī)[1]。清燥救肺湯具有清燥潤(rùn)肺、益氣養(yǎng)陰的功效，既往臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，清燥救肺湯對(duì)肺癌有顯著的療效[2-5]，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍不明確，因此，本研究以NSCLC細(xì)胞株H1299為研究對(duì)象，進(jìn)一步觀察清燥救肺湯抗肺癌機(jī)制，以期為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞株H1299，購(gòu)自北京科瑞思搏生物科技有限公司。24只SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量180~200 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2014-0041]完成。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2016-052-KY）。按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器干擾素γ（IFN-γ）抗體、白細(xì)胞介素4（IL-4）抗體、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）抗體、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抗體，購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自上海善然生物科技公司；Transwell小室，購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥公司。蛋白電泳儀，購(gòu)自北京科普爾科技公司；PCR儀，購(gòu)自蘇州雅睿生物公司；高速離心機(jī)，購(gòu)自武漢益普生物科技公司。

1.3藥物及制備清燥救肺湯組成：桑葉（霜）9 g，炙甘草3 g，麥冬10 g，枇杷葉9 g，生石膏12 g，黨參12 g，阿膠9 g，苦杏仁9 g。所有中藥材購(gòu)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院中藥局。常規(guī)煎煮后，濃縮生藥含量1 g/mL，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4含藥血清制備適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，將24只大鼠隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組12只，含藥血清組大鼠給予清燥救肺湯5.5 g/kg灌胃，空白血清組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，干預(yù)2周[3]。末次灌胃后經(jīng)大鼠尾部采血，離心，保留血清，56℃水浴滅活，除菌過(guò)濾后，-20℃密封冷藏備用。

1.5含藥血清干預(yù)及分組取第3代NSCLC細(xì)胞株H1299，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換新鮮的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)1 d后，棄上清。實(shí)驗(yàn)分為空白血清組及清燥救肺湯低、中、高濃度含藥血清組（簡(jiǎn)稱(chēng)清燥救肺湯低、中、高濃度組）。空白血清組：NSCLC細(xì)胞+10%空白血清培養(yǎng)；清燥救肺湯低濃度組：NSCLC細(xì)胞+2.5%清燥救肺湯含藥血清+7.5%空白血清；清燥救肺湯中濃度組：NSCLC細(xì)胞+5%清燥救肺湯含藥血清+5%空白血清；清燥救肺湯高濃度組：NSCLC細(xì)胞+10%清燥救肺湯含藥血清。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察NSCLC細(xì)胞增殖能力 給藥24 h后，取各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)7 d，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=形成的細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.2 Transwell細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室包被基底膜（細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)所需）。制備細(xì)胞懸液5×104個(gè)/mL，接種到Transwell小室中，繼續(xù)培養(yǎng)12~24 h。4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6.3 PCR法檢測(cè)NSCLC細(xì)胞Th1細(xì)胞表型因子IFN-γ及Th2細(xì)胞表型因子IL-4及IGF-1R/STAT3通路相關(guān)蛋白IGF-1R、STAT3的基因水平PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，58℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)NSCLC細(xì)胞IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達(dá) 將H1299細(xì)胞裂解離心取上清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。IFN-γ（1∶1 000）、IL-4（1∶1 000）、IGF-1R（1∶1 500）、STAT3（1∶1 000）等一抗稀釋液4℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）稀釋液37℃反應(yīng)1 h。電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，曝光，凝膠成像系統(tǒng)（JY-Clear）分析目標(biāo)條帶的光密度值，結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組NSCLC細(xì)胞克隆率比較空白血清組及清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞克隆率分別為（92.15±6.15）%、（83.11±4.16）%、（71.36±4.37）%、（52.31±5.02）%。4組組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=71.430，P＜0.05）。與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞克隆率減?。≒＜0.05），呈濃度依賴(lài)性。各組細(xì)胞克隆情況見(jiàn)圖1。

圖1 各組NSCLC細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results of NSCLC cell plate clone formation assay

2.2各組NSCLC細(xì)胞侵襲能力比較空白血清組，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（148±17）、（111±15）、（84±13）、（62±10）個(gè)。4組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.080，P＜0.05）。與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞侵襲數(shù)量減少（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖2。

圖2 各組NSCLC細(xì)胞Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×400）Figure 2 Results of Transwell invasion assay of NSCLC cells（×400）

2.3各組NSCLC細(xì)胞遷移能力比較空白血清組，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞遷移數(shù)量分別為（108.01±11.34）、（85.73±5.14）、（67.33±6.44）、（44.52±6.79）個(gè)。4組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.050，P＜0.05）。與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖3。

圖3 各組NSCLC細(xì)胞Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×400）Figure 3 Results of Transwell migration assay of NSCLC cells（×400）

2.4各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3的mRNA表達(dá)比較與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ mRNA表達(dá)水平升高，IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)表2。

表2 各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表達(dá)比較Table 2 Comparison of mRNA expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells of among various groups （±s，n=6）

表2 各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表達(dá)比較Table 2 Comparison of mRNA expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells of among various groups （±s，n=6）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較；②P＜0.05，與清燥救肺湯低濃度組比較；③P＜0.05，與清燥救肺湯中濃度組比較

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2.5各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達(dá)比較與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ蛋白表達(dá)水平升高，IGF-1R、STAT3、IL-4蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)表3、圖4。

圖4 各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3的Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot electrophoretogram of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells

表3 各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of protein expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R and STAT3 in NSCLC cells among various groups （±s，n=6）

表3 各組NSCLC細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of protein expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R and STAT3 in NSCLC cells among various groups （±s，n=6）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較；②P＜0.05，與清燥救肺湯低濃度組比較；③P＜0.05，與清燥救肺湯中濃度組比較

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3 討論

腫瘤的發(fā)生是由于多種因素作用導(dǎo)致的，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，而肺癌在所有腫瘤類(lèi)型中，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的概率最高[6]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)清燥救肺湯干預(yù)后，NSCLC細(xì)胞克隆、侵襲及遷移能力降低，提示清燥救肺湯可抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫密切相關(guān)，機(jī)體的抗腫瘤免疫功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞免疫。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫中至關(guān)重要。Th1細(xì)胞表型因子IFN-γ參與細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，具有重要的抗腫瘤作用，可誘導(dǎo)NK細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤活性；Th2細(xì)胞表型因子IL-4參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，通過(guò)抑制IFN-γ的產(chǎn)生，防止NK細(xì)胞活化，抑制細(xì)胞免疫的抗腫瘤效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7-9]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)清燥救肺湯干預(yù)后，NSCLC細(xì)胞IFN-γ表達(dá)升高、IL-4表達(dá)降低，提示清燥救肺湯可上調(diào)NSCLC細(xì)胞IFN-γ表達(dá)并抑制IL-4表達(dá)，促進(jìn)Th細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化，發(fā)揮抗腫瘤作用。

IGF-1R/STAT3通路參與多種腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展。IGF-1R是一種廣泛表達(dá)于多種類(lèi)型細(xì)胞表面的酪氨酸激酶跨膜蛋白，主要介導(dǎo)IGF-1和IGF-2的生物學(xué)作用，參與機(jī)體物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)還能刺激腫瘤細(xì)胞增殖[10]。已有研究證實(shí)，IGF-1R信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、各種途徑的轉(zhuǎn)移[11-12]。STAT3是IGF-1R/STAT3通路的成員，屬于STAT家族成員。有研究[13]表明，STAT3的激活可以促進(jìn)肺癌發(fā)生和腫瘤血管形成，與肺癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。在相關(guān)細(xì)胞的作用下，炎癥因子通過(guò)激活STAT3的表達(dá)使其磷酸化后，可特異性地結(jié)合在相關(guān)因子的基因啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化[14-15]。本研究結(jié)果顯示，給予清燥救肺湯干預(yù)后，NSCLC細(xì)胞STAT3、IGF-1R表達(dá)隨著濃度的增加而降低，提示清燥救肺湯可抑制NSCLC細(xì)胞IGF-1R/STAT3通路的活化，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，清燥救肺湯可能通過(guò)促進(jìn)IFN-γ表達(dá)，抑制IL-4表達(dá)，介導(dǎo)T細(xì)胞分化以調(diào)節(jié)免疫功能，同時(shí)抑制IGF-1R/STAT3通路活化，從而抑制NSCLC細(xì)胞的惡性行為。