長(zhǎng)梗秦艽酮、微小RNA-495-3p質(zhì)粒對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及順鉑敏感性的影響及協(xié)同作用

勞萬(wàn)生， 范麗霞， 李翠君

（佛山市第五人民醫(yī)院，廣東佛山 528211）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，簡(jiǎn)稱(chēng)腎癌），是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于腎實(shí)質(zhì)腎小管上皮[1]。目前，臨床治療早期腎癌以手術(shù)切除為主，晚期以內(nèi)科治療為主，雖然均對(duì)腎癌有一定的療效，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)極高，且一部分腎癌患者對(duì)化療不敏感[2-3]。因此，尋找臨床綜合有效的治療方法具有重要的研究意義。中藥因副作用小、不易耐藥等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到腫瘤醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[4]。長(zhǎng)梗秦艽（Gentiana wahoniiBurkill.）為龍膽科龍膽屬植物，其根可作為秦艽的代用品，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肝膽疾病等[5]。長(zhǎng)梗秦艽酮（waltonitone）是從長(zhǎng)梗秦艽中分離得到的一個(gè)新的烏蘇烷型五環(huán)三萜化合物[6]，具有顯著的體外抗腫瘤活性，對(duì)肝癌、宮頸癌、原位胰腺癌、人胰腺導(dǎo)管上皮癌等癌細(xì)胞增殖均有抑制作用，可有效調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡等過(guò)程[7-8]，但對(duì)腎癌的治療作用及機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miR）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在個(gè)體發(fā)育，細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等生理活動(dòng)中以及在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等病理過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，與腫瘤耐藥性關(guān)系密切[9-10]。miR-495-3p是一種多功能mRNA，研究表明，透明腎細(xì)胞癌組織中miR-495-3p表達(dá)顯著低于正常腎組織[11]。本研究旨在探究長(zhǎng)梗秦艽酮能否通過(guò)協(xié)同miR-495-3p，進(jìn)而調(diào)控腎癌細(xì)胞的生物學(xué)活性及順鉑敏感性，以期為腎癌臨床治療提供新的治療策略，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞

人腎癌caki-1細(xì)胞株，購(gòu)自于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，2~3 d傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)取3~5代細(xì)胞。

1.2動(dòng)物

4周齡雄性高度免疫缺陷NOD-SCID-IL-2Rγnull（NSG）小鼠40只，體質(zhì)量18~21 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。全部小鼠均飼養(yǎng)在無(wú)特殊病原（SPF）環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)佛山市第五人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3藥物及制備

長(zhǎng)梗秦艽酮（分子式：C30H48O2；分子量：440.7），其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供，純度95%以上。將長(zhǎng)梗秦艽酮溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為400 mmol/L的溶液備用，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)再稀釋成所需的濃度。

圖1 長(zhǎng)梗秦艽酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structural formula of waltonitone

1.4試劑與儀器

miR-495-3p質(zhì)粒（mimics）及其陰性對(duì)照質(zhì)粒（miR-negative control mimics，miR-NC）（中國(guó)百奧邁科生物技術(shù)有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑、Transwell小室（中國(guó)賽默飛世爾科技公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）標(biāo)記液、碘化丙 啶（PI）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn) 染 試 劑、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒（中國(guó)上海雅吉生物科技有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（中國(guó)東仁化學(xué)科技有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Tomy kogyo有限公司）；PCR儀（中國(guó)上海賽默生物科技發(fā)展有限公司）。

1.5體外研究

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d換液，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，3×105個(gè)/孔，待細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%時(shí)進(jìn)行miR-495-3p質(zhì)?；騧iR-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具體步驟按LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)是否轉(zhuǎn)染成功。

1.5.2 細(xì)胞分組

將培養(yǎng)后的細(xì)胞分為空白組，長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組，miR-NC組，miR-495-3p組?？瞻捉M：將腎癌caki-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組：將腎癌caki-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，分別對(duì)應(yīng)加入10、50、250 μmol/L長(zhǎng)梗秦艽酮共同培養(yǎng)；miRNC組：腎癌caki-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒；miR-495-3p組：作為轉(zhuǎn)染組，腎癌caki-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-495-3p質(zhì)粒。

1.5.3 CCK-8法檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)caki-1細(xì)胞活力和半數(shù)抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）

將各組caki-1細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL。分別向培養(yǎng)基中加入7個(gè)不同濃度梯度（0、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的順鉑。在24、48、72 h時(shí)分別加入CCK-8溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞的IC50值。取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.5.4 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)caki-1細(xì)胞凋亡

將caki-1細(xì)胞用2.5 g/L胰酶消化，制備成密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，換用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好后將細(xì)胞收集到離心管中，加入400 μL Binding Buffer緩沖液，細(xì)胞重懸，再加入5 μL Annexin V-FITC標(biāo)記液和5 μL PI，在避光的室溫中孵育15 min，然后冰浴5 min，最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定caki-1細(xì)胞侵襲能力

在Transwell上下室之間鋪墊聚碳酸酯的微孔濾膜，濾膜上包被人工基底膜膠。用不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，制成細(xì)胞懸液。Transwell上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL，置于37℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞并刮除濾膜上室面的細(xì)胞，用PBS小心沖洗小室上下面，以40 g/L多聚甲醛溶液固定侵襲或粘附到下室面的細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗小室，干燥后于200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)小室下室面的細(xì)胞。

1.5.6 qRT-PCR法檢測(cè)caki-1細(xì)胞中miR-495-3p和XIAP mRNA表達(dá)

取各組caki-1細(xì)胞，裂解細(xì)胞后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在PCR儀上檢測(cè)miR-495-3p（內(nèi)參為U6）和XIAP（內(nèi)參為GAPDH）的表達(dá)情況。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，64℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。最后用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)結(jié)果。miR-495-3p上游引物序列為5’-GGGGAAACAAACATGGTGCAC-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，擴(kuò)增片段為200 bp；U6上游引物序列為5’-CTCG CTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3’，擴(kuò)增片段為94 bp；XIAP上游引物序列為5’-CATCCATGGCAGATTAT GAAGCA-3’，下游引物序列為5’-CTTCACTGGG CTTCCAATCAGTTAG-3’，擴(kuò)增片段為202 bp；GAPDH上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTG AGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACG CCAGTGGA-3’，擴(kuò)增片段為132 bp。

1.5.7 雙熒光素酶報(bào)告基因靶基因熒光檢測(cè)

利用生物信息學(xué)軟件（Target Scan 7.1），預(yù)測(cè)miR-495-3p調(diào)控XIAP基因結(jié)合序列，設(shè)計(jì)合成XIAP 3’-UTR序列及突變后XIAP 3’-UTR序列。將合成的2種目的基因片段分別克隆到pmir GLO熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建XIAP 3’-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體（pmir-GLO-wt-XIAP）及其突變型載體（pmir GLO-mut-XIAP）。

使用LipofectamineTM3000分別將這2種重組載體質(zhì)粒與miR-495-3p質(zhì)粒或miR-NC質(zhì)粒（miR-495-3p陰性對(duì)照）共同轉(zhuǎn)染至caki-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。轉(zhuǎn)染分組如表1。

表1 共轉(zhuǎn)染分組Table 1 Co-transfection groupings

1.6體內(nèi)研究

1.6.1 分組、造模與給藥

構(gòu)建NSG小鼠腎癌移植瘤模型方法：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腎癌caki-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，無(wú)菌條件下接種于NSG小鼠前肢腋部皮下。在接種前1 d，對(duì)NSG小鼠進(jìn)行250 cGy輻射。接種前通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種時(shí)確保細(xì)胞懸液物無(wú)外滲，以確保每只小鼠成瘤。接種后隔天觀察小鼠，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤體積，40只小鼠約10 d均成瘤，待腫瘤增長(zhǎng)到1 000~2 000 mm3時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將40只NSG小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為4組，即陰性組、轉(zhuǎn)染組、藥物組、聯(lián)合組，每組10只。藥物組：小鼠前肢腋部皮下注射腎癌caki-1細(xì)胞1×106個(gè)/mL，灌胃30 mg/kg長(zhǎng)梗秦艽酮[12]；陰性組：小鼠前肢腋部皮下注射轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒的腎癌caki-1細(xì)胞1×106個(gè)/mL，灌胃等體積生理鹽水；轉(zhuǎn)染組：小鼠前肢腋部皮下轉(zhuǎn)染miR-495-3p質(zhì)粒的腎癌caki-1細(xì)胞1×106個(gè)/mL，灌胃等體積生理鹽水；聯(lián)合組：小鼠前肢腋部皮下注射轉(zhuǎn)染miR-495-3p質(zhì)粒的腎癌caki-1細(xì)胞1×106個(gè)/mL，灌胃30 mg/kg長(zhǎng)梗秦艽酮。共干預(yù)7 d。

1.6.2 腫瘤質(zhì)量和體積的測(cè)量

治療結(jié)束后，取出瘤體，稱(chēng)質(zhì)量。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的最大長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積。

1.7統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組caki-1細(xì)胞順鉑敏感性比較

圖2-A結(jié)果顯示：各組0、1、2、4、8、16、32 μmol/L順鉑處理的caki-1細(xì)胞活力呈逐漸遞減趨勢(shì)。順鉑為32 μmol/L濃度時(shí)，長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組的細(xì)胞活力均低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與miR-NC組比較，miR-495-3p組的細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組與miR-495-3p組的細(xì)胞活力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮、miR-495-3p質(zhì)粒均可抑制順鉑處理的腎癌細(xì)胞增殖，且高濃度長(zhǎng)梗秦艽酮的抑制效果與miR-495-3p質(zhì)粒相當(dāng)。

圖2-B結(jié)果顯示：長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組caki-1細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值均低于空白組，且呈逐漸遞減趨勢(shì)，高劑量組對(duì)順鉑的IC50值最低（P＜0.05）；與miR-NC組比較，miR-495-3p組caki-1細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值明顯降低（P＜0.05）；miR-NC組與空白組，及長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組與miR-495-3p組caki-1細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮和過(guò)表達(dá)miR-495-3p均能增強(qiáng)腎癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

圖2 各組不同濃度順鉑處理的caki-1細(xì)胞活力及IC50值比較Figure 2 Comparison of the viability of caki-1 cells treated with different concentrations of cisplatin and IC50 value among various groups

2.2各組caki-1細(xì)胞凋亡能力比較

圖3、圖4結(jié)果顯示：與空白組比較，長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05），呈逐漸遞增趨勢(shì)；miR-495-3p組細(xì)胞凋亡率較miR-NC組明顯增加（P＜0.05）；miR-NC組細(xì)胞凋亡率與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組細(xì)胞凋亡率與miR-495-3p組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮和過(guò)表達(dá)miR-495-3p均能促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)caki-1細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 3 Flow cytometry results for caki-1 cell apoptosis

圖4 各組caki-1細(xì)胞凋亡率比較Figure 4 Comparison of apoptosis rates of caki-1 cells among various groups

2.3各組caki-1細(xì)胞侵襲能力比較

空白組、長(zhǎng)梗秦艽酮低劑量組、長(zhǎng)梗秦艽酮中劑量組、長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組、miR-NC組及miR-495-3p組的細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為（125.30±9.52）、（85.11±6.21）、（74.20±4.30）、（50.24±3.66）、（120.41±10.20）及（49.66±4.03）個(gè)。與空白組比較，長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組caki-1細(xì)胞侵襲能力均顯著降低，呈逐漸遞減趨勢(shì)（P＜0.05）；與miR-NC組比較，miR-495-3p組caki-1細(xì)胞侵襲能力明顯降低（P＜0.05）；miR-NC組caki-1細(xì)胞侵襲能力與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組caki-1細(xì)胞侵襲能力與miR-495-3p組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮和過(guò)表達(dá)miR-495-3p能抑制腎癌細(xì)胞侵襲。Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各組Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Figure 5 Comparison of the results of transwell chamber invasion assay among various groups（×400）

2.4各組caki-1細(xì)胞中miR-495-3p、XIAP mRNA表達(dá)比較

圖6-A結(jié)果顯示：空白組與miR-NC組caki-1細(xì)胞miR-495-3p呈低表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-495-3p組caki-1細(xì)胞中miR-495-3p呈過(guò)表達(dá)，與空白組和miR-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與空白組比較，長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組細(xì)胞中miR-495-3p表達(dá)水平均明顯升高，呈遞增趨勢(shì)（P＜0.05）；長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組細(xì)胞中miR-495-3p表達(dá)水平與miR-495-3p組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮能增強(qiáng)caki-1細(xì)胞miR-495-3p表達(dá)。

圖6 各組caki-1細(xì)胞中miR-495-3p、XIAP mRNA表達(dá)比較Figure 6 Comparison of expressions of miR-495-3p and XIAP mRNA among various groups of caki-1 cells

圖6-B結(jié)果顯示：與空白組比較，長(zhǎng)梗秦艽酮低、中、高劑量組caki-1細(xì)胞中XIAP mRNA表達(dá)水平顯著降低，呈逐漸遞減趨勢(shì)（P＜0.05）；與miR-NC組 比 較，miR-495-3p組caki-1細(xì) 胞 中XIAP mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；miRNC組與空白組，及長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組與miR-495-3p組caki-1細(xì)胞中XIAP mRNA表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮和過(guò)表達(dá)miR-495-3p均能抑制腎癌細(xì)胞中XIAP mRNA表達(dá)。

2.5雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告

表2結(jié)果顯示，XIAP的活性可通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-495-3p來(lái)降低（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了XIAP是miR-495-3p的靶基因。

表2 雙熒光素酶報(bào)告Table 2 Dual-luciferase report （±s）

表2 雙熒光素酶報(bào)告Table 2 Dual-luciferase report （±s）

注：①P＜0.05，與miR-NC組比較

?

2.6各組小鼠腫瘤質(zhì)量和體積比較

圖7結(jié)果顯示：與陰性組比較，轉(zhuǎn)染組、藥物組和聯(lián)合組的腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均顯著減小（P＜0.05）；聯(lián)合組的腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均小于轉(zhuǎn)染組和藥物組（P＜0.05）；藥物組腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積與轉(zhuǎn)染組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明長(zhǎng)梗秦艽酮、過(guò)表達(dá)miR-495-3p均可抑制小鼠腎癌，且聯(lián)合抑制效果優(yōu)于單獨(dú)使用長(zhǎng)梗秦艽酮或過(guò)表達(dá)miR-495-3p。

圖7 各組腎癌小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積比較Figure 7 Comparison of tumour mass and tumour volume among various groups of kidney cancer mice

3 討論

腎細(xì)胞癌（RCC）是腎臟中常見(jiàn)的一種腫瘤，以對(duì)放療、化療不敏感為臨床主要特點(diǎn)[13]。順鉑（DDP）作為一線化療藥物被廣泛應(yīng)用于治療各種實(shí)體腫瘤，但順鉑破壞DNA交聯(lián)，誘導(dǎo)核苷酸切除、修復(fù)和同源重組，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[14]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)梗秦艽酮組和miR-495-3p組caki-1細(xì)胞的活性和對(duì)順鉑的IC50值較空白組明顯降低，表明長(zhǎng)梗秦艽酮、過(guò)表達(dá)miR-495-3p均能抑制腎癌細(xì)胞活性，增加腎癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，進(jìn)而降低腎癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。

本研究通過(guò)對(duì)腎癌caki-1細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)梗秦艽酮干預(yù)及轉(zhuǎn)染miR-495-3p后發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p在腎癌caki-1細(xì)胞中呈低表達(dá)，在長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組caki-1細(xì)胞中的表達(dá)與在miR-495-3p組中的表達(dá)沒(méi)有明顯差異，且miR-495-3p表達(dá)隨著長(zhǎng)梗秦艽酮?jiǎng)┝康脑黾佣?，表明長(zhǎng)梗秦艽酮能增強(qiáng)腎癌細(xì)胞中miR-495-3p的表達(dá)。

細(xì)胞的侵襲能力是決定腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的潛在指標(biāo)[15]。細(xì)胞凋亡是腫瘤研究的熱點(diǎn)，臨床上常見(jiàn)的化療藥物包括中藥的抗腫瘤機(jī)制多可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到控制腫瘤惡性生長(zhǎng)的目的[16]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)梗秦艽酮高劑量組和miR-495-3p組caki-1細(xì)胞的侵襲能力較空白組明顯降低，凋亡能力較空白組明顯升高，表明長(zhǎng)梗秦艽酮和過(guò)表達(dá)miR-495-3p均可抑制腎癌細(xì)胞侵襲，促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了長(zhǎng)梗秦艽酮和miR-495-3p的抗腫瘤作用。

X染色體連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）是凋亡抑制蛋白家族中的一員，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，在多數(shù)腫瘤中過(guò)度表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分期、預(yù)后等[17-18]。本研究通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-495-3p能降低XIAP野生型質(zhì)粒熒光素酶的活性，表明XIAP是miR-495-3p的靶基因，提示miR-495-3p對(duì)腎癌細(xì)胞生物活性的調(diào)控是通過(guò)抑制XIAP來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察長(zhǎng)梗秦艽酮、miR-495-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)荷caki-1細(xì)胞NSG小鼠腎癌移植瘤模型腫瘤質(zhì)量和體積的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組、藥物組和聯(lián)合組腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均較陰性組顯著減小，聯(lián)合組腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均小于轉(zhuǎn)染組和藥物組，表明miR-495-3p質(zhì)粒可減小腎癌小鼠體內(nèi)腫瘤的質(zhì)量和體積，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，長(zhǎng)梗秦艽酮聯(lián)合miR-495-3p質(zhì)粒的治療效果更為顯著。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-495-3p對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，同時(shí)可有效促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡。長(zhǎng)梗秦艽酮、miR-495-3p可靶向抑制XIAP降低腎癌細(xì)胞生物活性，促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，抑制腎癌細(xì)胞侵襲，增加腎癌細(xì)胞的順鉑敏感性，且有一定的協(xié)同作用。也進(jìn)一步提示miR-495-3p可能作為潛在的生物靶點(diǎn)用于腎癌患者的臨床治療，長(zhǎng)梗秦艽酮可作為腎癌患者化療輔助藥物。