細(xì)胞衰老在卵巢癌治療方面研究進(jìn)展

沈宏，周子路，王彩霞，陶逸萍，郭燕君

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

1 細(xì)胞衰老機(jī)制

1961年，Hayflick 和 Moorehead 首次研究了細(xì)胞水平上增殖的永久停滯，他們表明原代人類細(xì)胞的壽命僅限于大約 60 個(gè)分裂。最近，已經(jīng)有關(guān)于選擇性消除衰老細(xì)胞和隨后的組織再生或緩解疾病癥狀的研究[1]。衰老目前被定義為響應(yīng)內(nèi)在或外在因素的細(xì)胞狀況，包括致癌基因激活、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、輻射和暴露于化療藥物。衰老的早期階段是響應(yīng)這些刺激中的一種或多種而開(kāi)始的。在這個(gè)階段，衰老細(xì)胞發(fā)生特征性的形態(tài)變化，變得扁平和擴(kuò)大。這一過(guò)程伴隨著核染色質(zhì)重塑和核纖層蛋白 B1 的丟失，線粒體中氧化代謝的誘導(dǎo)，以及衰老細(xì)胞抗凋亡途徑 (SCAP) 的激活，使細(xì)胞對(duì)死亡具有抵抗力。由于溶酶體活性的增加，還觀察到衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal），并誘導(dǎo)衰老相關(guān)的分泌表型（SASP）。自噬是在應(yīng)激刺激促進(jìn)生物體內(nèi)平衡后，細(xì)胞中的溶酶體降解受損大分子或細(xì)胞器的過(guò)程。它可能與細(xì)胞凋亡和衰老有關(guān)。

2 細(xì)胞衰老生物標(biāo)志物

衰老細(xì)胞具有多種形態(tài)和生化特征，可用于體外和/或體內(nèi)檢測(cè)。因?yàn)闆](méi)有單一的標(biāo)記以明確識(shí)別衰老細(xì)胞，所以通常使用標(biāo)記和分析技術(shù)的組合來(lái)提高檢測(cè)的特異性。衰老細(xì)胞通常大而扁平，這些形態(tài)特征可以使用光學(xué)顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù) (FC)來(lái)觀察。其他常用于檢測(cè)衰老細(xì)胞的技術(shù)包括免疫熒光 (IF)、免疫組織化學(xué) (IHC)、蛋白質(zhì)印跡 (WB)、報(bào)告基因檢測(cè)、染料摻入、酶染色、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、FISH（熒光原位雜交）和ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）。最合適的檢測(cè)方法將取決于研究的目標(biāo)和選擇的衰老模型。

第一組主要的衰老標(biāo)志物由與衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化相關(guān)的標(biāo)志物組成。除了前面提到的細(xì)胞大小和形狀的變化外，衰老通常伴隨著溶酶體活性的增加，這可以通過(guò)酶染色檢測(cè)到。一種特別值得注意的與衰老相關(guān)的溶酶體酶是衰老相關(guān)的 β-半乳糖苷酶（SA-β-半乳糖苷酶），其最適 pH 值為 6.0。長(zhǎng)期以來(lái)，SA-β-gal 是檢測(cè)衰老細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)，但最近的研究對(duì)其特異性提出了擔(dān)憂。例如，SA-βgal 在神經(jīng)元中具有活性并在發(fā)育中的胚胎中表達(dá)，但這些觀察結(jié)果均不被認(rèn)為與衰老有關(guān)。因此，雖然 SA-β-gal 活性與衰老和細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)，但它仍然被廣泛使用，因此不能認(rèn)為 SA-β-gal 活性足夠特異性以單獨(dú)識(shí)別衰老細(xì)胞。另一個(gè)經(jīng)常被利用的衰老標(biāo)志是 SA-α-巖藻糖苷酶活性，隨著衰老過(guò)程中溶酶體的活化而增加。重要的是，它的上調(diào)可能比 SA-β-gal 更具特異性。另外可用作衰老標(biāo)志物的是脂褐質(zhì)——一種黃褐色殘留物，由溶酶體中不完全降解或代謝的脂質(zhì)組成——它會(huì)在衰老組織中積累。它的存在可以使用光學(xué)顯微鏡、利用其自發(fā)熒光或蘇丹黑 B (SBB) 染色來(lái)檢測(cè)。最近還報(bào)道了一種新的生物素綴合的 SBB，用于靈敏的脂褐質(zhì)檢測(cè) (GL13)，可以使用特定的抗生物素抗體進(jìn)行可視化。另一類敏感的衰老指標(biāo)由 DDR 基因產(chǎn)物組成，其表達(dá)通常通過(guò)免疫熒光可視化。最常用的 DDR 蛋白是在 Ser-139 處磷酸化的γH2AX，它在雙鏈 DNA 斷裂位點(diǎn)積累并能夠檢測(cè)雙鏈斷裂 (DSB) 修復(fù)途徑蛋白。

屬于 p16/RB 和 p53/p21 衰老誘導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)也是常見(jiàn)的衰老標(biāo)志物。特別是，p16INK4a、pRB、磷酸化-pRB 或 p21、p53 和磷酸化-p53 的過(guò)表達(dá)可以通過(guò) WB、IHC 和/或 IF 來(lái)確定。這些途徑中鮮為人知的分子，如 DEC1 和 PPP1A，也已被確定為潛在的生物標(biāo)志物。DEC1 是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo) p53 依賴性過(guò)早衰老，而 PPP1A 是 PP1α 的催化亞基，在癌基因誘導(dǎo)衰老 (OIS) 期間在 p53 介導(dǎo)的途徑中具有活性。

與SASP相關(guān)的細(xì)胞因子分泌，其特點(diǎn)是促炎化合物的廣泛分泌。SASP 因子分泌到組織微環(huán)境中是在損傷或癌基因誘導(dǎo)的衰老過(guò)程中誘導(dǎo)的，并且可以通過(guò) WB、ELISA 或 SASP 特異性測(cè)定來(lái)檢測(cè)。在最近的出版物中已經(jīng)討論了幾種 SASP 相關(guān)化合物和結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，但僅基于這些標(biāo)記物確認(rèn)衰老是非常具有挑戰(zhàn)性的，并且獲得的結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)，因?yàn)檫@些物質(zhì)也在某些條件下由非衰老細(xì)胞分泌。衰老細(xì)胞分泌的常見(jiàn) SASP 因子包括信號(hào)分子，如白細(xì)胞介素（如 IL-6 和 IL-8）、膜陰影粘附分子和其他生長(zhǎng)因子。

3 細(xì)胞衰老在卵巢癌治療中的作用

在最近的研究中，已經(jīng)證實(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老以防止腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖可以成為一種重要的治療方法。正常細(xì)胞積累了癌基因應(yīng)激、氧化應(yīng)激和DNA損傷的變化，這些變化觸發(fā)了細(xì)胞異常增殖的初始階段。這種異常的增殖可以引起癌前病變；與這種異常情況相平行的是，卵巢癌細(xì)胞的內(nèi)在故障安全機(jī)制，如衰老和凋亡被激活。在卵巢癌的進(jìn)展過(guò)程中，損傷的積累推翻了這些保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致了卵巢癌的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，化療和放射治療等常規(guī)治療方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老；同時(shí)，針對(duì)卵巢癌的靶向生物治療的研究也取得了一定的進(jìn)展。化療、放射治療和生物治療導(dǎo)致的細(xì)胞衰老永久地阻止了生長(zhǎng)。在癌細(xì)胞中，化療誘導(dǎo)的衰老是一種重要的細(xì)胞命運(yùn)的替代[2]。該研究報(bào)告了在癌癥中不依賴凋亡的p53功能，并表明過(guò)度表達(dá)Bcl-2的小鼠淋巴瘤化療的機(jī)制是通過(guò)由p53和p16INK4a控制的衰老程序而不是通過(guò)凋亡[3]。 相反，有文獻(xiàn)報(bào)道，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）DNMT3a在阿霉素誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞衰老和凋亡之間切換中發(fā)揮重要作用，DNA損傷藥物阿霉素（Dox）誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，其濃度明顯低于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所需的濃度。在Dox低濃度下，腫瘤抑制因子p53被激活，被激活的p53增強(qiáng)p21的表達(dá)。在Dox高濃度下，Dox激活p53導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而不增強(qiáng)p21表達(dá)?？刂艱ox誘導(dǎo)衰老和細(xì)胞凋亡的差異效應(yīng)的潛在機(jī)制和因素尚不清楚。DNMT3a被Dox上調(diào)，特別是在誘導(dǎo)HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的濃度下，這個(gè)過(guò)程受到p53的調(diào)節(jié)。同時(shí)，p21的表達(dá)在誘導(dǎo)衰老的濃度下顯著上調(diào)，并且在使用誘導(dǎo)凋亡的Dox濃度進(jìn)行處理時(shí)保持較低水平。DNMT3a和p21對(duì)Dox的差異表達(dá)表明，DNMT3a可能是Dox誘導(dǎo)的衰老和細(xì)胞凋亡之間切換的關(guān)鍵因素。此外，當(dāng)DNMT3a沉默時(shí)，用誘導(dǎo)凋亡的Dox濃度處理HCT116細(xì)胞增加了發(fā)生衰老的細(xì)胞的百分比，伴隨著p21的上調(diào)。相反，誘導(dǎo)衰老的Dox濃度促進(jìn)了細(xì)胞凋亡率，p21表達(dá)受到抑制。令人驚訝的是，在Dox的兩個(gè)范圍內(nèi)都沒(méi)有檢測(cè)到p21啟動(dòng)子的DNA甲基化狀態(tài)的變化[4]。當(dāng)衰老細(xì)胞受到依賴于P53的凋亡刺激時(shí)，它們會(huì)因治療而發(fā)生壞死[5]。有趣的是，卵巢癌細(xì)胞衰老的激活與強(qiáng)烈的衰老相關(guān)分泌表型(SASP)有關(guān)，SASP可以吸引和激活免疫系統(tǒng)細(xì)胞來(lái)改變卵巢癌的微環(huán)境。關(guān)于免疫功能障礙，SASP的促炎性質(zhì)可以招募免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞可以殺死和清除衰老細(xì)胞或其他存活的癌細(xì)胞[6]?？偠灾?，可以探索化療、放射治療和生物治療誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老作為卵巢癌的替代或補(bǔ)充治療。

3.1 細(xì)胞衰老與卵巢癌化療

卵巢癌最常用的治療方法是手術(shù)輔助化療，但這些方法很難顯著延長(zhǎng)5年生存率(約20%)[7]。尤其是卵巢癌的化療耐藥性和較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，嚴(yán)重降低了卵巢癌患者的遠(yuǎn)期療效和生存率。卵巢癌化療主要是通過(guò)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡來(lái)治療的。但是，腫瘤細(xì)胞普遍存在凋亡障礙，卵巢癌治療的一大難題是腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗。隨著研究的深入，研究證實(shí)化療藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老。衰老的細(xì)胞處于永久性生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，修復(fù)DNA損傷后，仍然經(jīng)歷細(xì)胞周期停滯?；熆梢哉T導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和衰老，但細(xì)胞周期停滯不是衰老的同義詞。一種類型的靜止是簡(jiǎn)單的靜止，一種可逆的停止。細(xì)胞停滯是因?yàn)槿狈ιL(zhǎng)因子，而添加生長(zhǎng)因子會(huì)導(dǎo)致增殖。另一種類型的靜止是鎖定靜止，一種不可逆轉(zhuǎn)的停頓。分化的細(xì)胞被踩剎車(chē)，過(guò)度的刺激導(dǎo)致衰老。許多研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的化療藥物可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞衰老，并進(jìn)一步證明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是逆轉(zhuǎn)耐藥性的可行策略。誘導(dǎo)衰老的化療，一方面可以減少化療的劑量；研究表明，低劑量的化療藥物可誘導(dǎo)A2780卵巢癌細(xì)胞衰老，導(dǎo)致細(xì)胞周期延長(zhǎng)，主要停滯在細(xì)胞周期的G1期[8]。此外，根據(jù)Schmitt’s小鼠化療研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老變化，而細(xì)胞衰老的機(jī)制直接影響化療效果，衰老細(xì)胞的表達(dá)量與預(yù)后密切相關(guān)。目前認(rèn)為化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯與DNA損傷直接相關(guān)。如果小劑量化療藥物引進(jìn)無(wú)法修復(fù)的DNA損傷，卵巢癌細(xì)胞往往會(huì)發(fā)生衰老，而不是細(xì)胞凋亡。因此，衰老在體內(nèi)對(duì)化療的反應(yīng)中起著重要作用。

3.2 細(xì)胞衰老與卵巢癌放射治療

在卵巢癌中，放射治療在卵巢癌治療中的應(yīng)用較少，手術(shù)和化療仍然是腫瘤基本的治療方法。卵巢癌腫瘤對(duì)放射敏感；放射治療目前并不是卵巢癌的主要治療方法，放射治療只作為腫瘤手術(shù)后的輔助治療，卵巢癌晚期及復(fù)發(fā)病變的姑息治療方法。迄今為止，許多研究證實(shí)放射治療對(duì)卵巢癌具有治療效果。

在上皮性卵巢癌中，放射治療可以用來(lái)緩解晚期卵巢癌引起的疼痛、出血或壓迫癥狀[9]。Yahara等人選擇了27名完全緩解后有限復(fù)發(fā)的患者，評(píng)估了確定性放射治療對(duì)上皮性卵巢癌復(fù)發(fā)的療效和毒性。他們發(fā)現(xiàn)，放療對(duì)復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌的局部控制率較好，且無(wú)嚴(yán)重毒副作用[9]。Wei也證實(shí)放療聯(lián)合化療對(duì)鉑耐藥復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌有良好療效[10]。Albuquerque等報(bào)道，長(zhǎng)期隨訪證實(shí)了介入野放射治療對(duì)局部復(fù)發(fā)卵巢癌的益處[11]。在卵巢透明細(xì)胞癌中，放療可以提高早期(ⅠC期和Ⅱ期)患者5年的無(wú)瘤生存率20%(相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)為0.5)[12]。Macrie等人評(píng)估了盆腔放療在卵巢透明細(xì)胞癌中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，這種疾病的患者在手術(shù)和化療后表現(xiàn)出盆腔復(fù)發(fā)的傾向，而且盆腔放射治療可以有效地殺菌微觀腫瘤細(xì)胞，并提示盆腔放射治療可能使卵巢透明細(xì)胞癌患者受益[13]。

眾所周知，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性是放射治療成功的關(guān)鍵。一些數(shù)據(jù)表明，大規(guī)模輻射(X射線)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，并進(jìn)一步改變腫瘤細(xì)胞對(duì)X射線的敏感性。Penha等人報(bào)道，不同劑量和時(shí)間的輻射暴露對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響不同[14]。由于衰老在抗癌策略中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，誘導(dǎo)衰老的放射治療已廣泛應(yīng)用于甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌等[15]。雖然誘導(dǎo)衰老放射治療發(fā)展迅速，但這一療法在卵巢癌治療上尚未廣泛應(yīng)用，希望這一新療法能為卵巢癌的治療提供一種有用的工具。

3.3 細(xì)胞衰老與卵巢癌生物治療

與傳統(tǒng)的化療和放射治療不同，生物治療可以顯著延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，而不會(huì)出現(xiàn)很大的不良反應(yīng)。因此，恢復(fù)衰老途徑、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是一個(gè)很有前景的治療新靶點(diǎn)。有一些研究不僅在卵巢癌細(xì)胞系中提供了衰老特征的證據(jù)，而且在標(biāo)本中也提供了證據(jù)。在Konecny等人的研究中，他們發(fā)現(xiàn)p16在原發(fā)臨床卵巢癌標(biāo)本中的過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致衰老[16]。Mikuaapietrasik等人[17]表明，SA-A-Gal在誘導(dǎo)衰老的卵巢癌轉(zhuǎn)移標(biāo)本中的表達(dá)顯著增加。

在基因治療方面，Bitler等人首次證明Wnt5a的激活通過(guò)促進(jìn)組蛋白細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子/早幼粒細(xì)胞白血病衰老途徑來(lái)誘導(dǎo)人上皮性卵巢癌細(xì)胞衰老。Wnt5a的不同表達(dá)與上皮性卵巢癌患者的不同腫瘤分期和總生存期有關(guān)。這些數(shù)據(jù)與Wnt5a信號(hào)促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞衰老是一種潛在的卵巢癌治療新策略的觀點(diǎn)是一致的[18]。Pan等研究發(fā)現(xiàn)Daxx缺失可以以p53/p21依賴的方式加速小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的衰老，并誘導(dǎo)DNA損傷相關(guān)蛋白(p-H2AX和p-Chk2)和細(xì)胞周期相關(guān)基因(p21和p27)的高表達(dá)。這些結(jié)果提示DAXX可能在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起作用，并可能成為抗癌的靶點(diǎn)[19]。Aird等人發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌細(xì)胞株和標(biāo)本中核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照，并且RRM2的表達(dá)下調(diào)通過(guò)細(xì)胞衰老機(jī)制抑制了人上皮性卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)表明，抑制RRM2誘導(dǎo)衰老是上皮性卵巢癌患者的一種新的治療策略[20]。