射干總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

王倩，康鈺溥，楊利博，王乃澤，趙敏，武玉翠*

（1.河北工程大學園林與生態(tài)工程學院，河北 邯鄲 056038；2.河北交通職業(yè)技術學院，河北 石家莊 050035）

射干〔Belamcanda chinensis（L.）DC.〕為鳶尾科屬多年生草本植物，味苦，性寒，具有清熱解毒、利咽消痰、散血消腫的功效[1～3]。射干含有豐富的異黃酮類化合物和三萜類化合物，在臨床醫(yī)藥上應用逾顯廣泛，多用于喉痹咽痛、上呼吸道感染等疾病的治療[4，5]。研究顯示，從射干根莖中分離得到的黃酮類成分含量較高且穩(wěn)定，具有較強的抗氧化作用[6，7]。以往對射干的研究多集中在根莖部黃酮類成分，而對其地上部黃酮含量及抗氧化活性的研究較少。為了探究射干地上部的藥用價值，采用超聲輔助正交試驗優(yōu)化提取工藝，對射干各部位的總黃酮含量進行比較，并對其抗氧化性進行評價，旨為射干的高效利用提供一定的理論依據(jù)和技術參考[8～10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物試材為人工栽培的射干，2020年9月中旬采自邯鄲市涉縣，帶回實驗室后，將其須根、主根、花梗、葉、花、莖分開，分別置于烘箱內(nèi)55℃烘干至恒重，晾涼后粉碎并過60目篩，粉末裝密封袋中，備用。

主要儀器有LDO-101-1系列電熱恒溫鼓風干燥箱（上海龍躍儀器設備有限公司）、YB-1000A型多功能藥物粉碎機（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）、奧豪斯Adventurer AX系列萬分之一電子天平（美國）、KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）、Thermo ST8 ST8R熱電高速冷凍離心機（美國）和普析TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

主要藥劑有蘆丁標準品（質(zhì)量分數(shù)＞99%）、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2，2′-聯(lián)氨-雙二胺鹽（ABTS）、奎諾二甲基丙烯酸酯（水溶性維生素E，Trolox）、無水乙醇、甲醇、NaNO2、AlCl3、NaOH、甲醇和丙酮，均為分析純，除蘆丁標準品、DPPH、ABTS和Trolox購于美國Sigma公司外，其他藥劑均為國產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品10.0 mg，用60%乙醇溶液配制成濃度為1.0 mg/mL的標準蘆丁母液；而后用去離子水將其依次稀釋成濃度為0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.01 mg/mL的系列梯度溶液。取稀釋后各梯度溶液500 μL于10 mL離心管中，依次加入60%乙醇溶液4 mL、5%的NaNO2溶液100 μL，充分混勻后室溫靜置6 min；再加入10%的AlCl3溶液，混勻后室溫靜置6 min，使其逐漸變色；最后加入4%的NaOH溶液300 μL，搖勻，室溫下顯色反應10 min。以60%乙醇溶液為空白校正，采用紫外可見分光光度法于波長510 nm處測定吸光度。以吸光度（Y）對蘆丁濃度（mg/mL，X）進行線性回歸，得到蘆丁濃度—吸光度標準曲線方程。

1.2.2 射干總黃酮的提取方法 稱取射干樣品粉末100.0 mg，加入提取溶劑2 mL，在一定的料液比、提取溫度和超聲功率條件下進行提取，然后5 000 r/min離心3 min，將上清液移至另一離心管；殘渣復提1次。將2次上清液合并為樣品提取液，按照1.2.1方法測定吸光度。依據(jù)線性回歸方程，計算樣品的總黃酮含量。

1.2.3 單因素條件的篩選（單因素試驗） 在其他因素固定的條件下，變化某個因素水平，以總黃酮含量為考察指標，對單因素的適宜條件進行篩選。每處理均3次重復。

1.2.3.1 提取溶劑的確定。精密稱取射干粉末100.0 mg置于10 mL離心管中；加入提取溶劑2 mL，試驗提取溶劑種類設甲醇-丙酮（體積比為7∶3）、60%乙醇、70%乙醇和70%甲醇4個處理；在溫度40℃、超聲功率60 W條件下提取0.5 h。

1.2.3.2 乙醇濃度的確定。精密稱取射干粉末100.0 mg置于10 mL離心管中；加入不同濃度的乙醇2 mL，試驗乙醇濃度設60%、70%、80%和90%計4個處理；在溫度40℃、超聲功率60 W條件下提取0.5 h。

1.2.3.3 料液比的確定。精密稱取射干粉末100.0 mg置于10 mL離心管中；加入不同數(shù)量的70%乙醇，試驗加入量設1.0 mL〔料液比（m∶V）1∶10〕、1.5 mL（料液比1∶15）、2.0 mL（料液比1∶20）、2.5 mL（料液比1∶25）和3.0 mL（料液比1∶30）5個處理；在溫度40℃、超聲功率60 W條件下提取0.5 h。

1.2.3.4 提取溫度的確定。精密稱取射干粉末100.0 mg置于10 mL離心管中，加入70%乙醇2 mL；在不同溫度下超聲功率60 W提取0.5 h，試驗提取溫度設40、50、60、70和80℃計5個處理。

1.2.3.5 超聲功率的確定。精密稱取射干粉末100.0 mg置于10 mL離心管中，加入70%乙醇2 mL；在溫度70℃下采用不同的超聲功率提取0.5 h，試驗超聲功率設60、70、80、90和100 W計5個處理。

1.2.4 提取條件的優(yōu)化（正交試驗） 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正交試驗設計的因素與水平。按照正交表進行試驗設計，以總黃酮含量作為考察指標，對射干總黃酮的提取條件進行優(yōu)化。

1.2.5 射干總黃酮抗氧化活性試驗 采用優(yōu)化后的提取條件，對射干不同部位的總黃酮進行提??；然后，進行射干不同部位總黃酮的抗氧化活性試驗。

1.2.5.1 對DPPH自由基的清除效果。參考李潔等[11]方法，精確稱取DPPH 1.0 mg，用甲醇將其充分溶解并定容至100 mL的容量瓶中，得到濃度為0.001%的DPPH反應溶液，避光保存，備用。以提取液中所含材料的質(zhì)量濃度為單位，分別將樣品提取液稀釋成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的溶液；分別取各濃度梯度的樣品溶液200 μL，加入DPPH反應溶液1.2 mL，搖勻后室溫避光靜置30 min，在波長517 nm處測得反應液的吸光度（A樣品），同時將甲醇反應液的吸光度作為空白（A空白），取3次重復的平均值。根據(jù)公式，計算出各部位不同濃度下樣品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率=（1-A樣品/A空白）×100%

以樣品濃度為自變量、DPPH清除率為因變量做圖并進行線性擬合，計算出不同濃度下樣品自由基清除能力的IC50。

1.2.5.2 對ABTS+自由基的清除效果。參考荊常亮[12]方法，精密稱取ABTS 384.076 mg，用蒸餾水定容至100 mL的容量瓶中，配制成濃度為7 mmol/L的ABTS溶液。稱取K2S2O866.284 mg，用蒸餾水定容至100 mL的容量瓶中，配制成濃度為2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液。將上述2種溶液各取10 mL混合均勻，室溫避光條件下放置12～16 h，得到ABTS+工作液母液。用適量的無水乙醇將其稀釋至波長734 nm處吸光值為0.7±0.02的溶液，制成ABTS+工作液。以Trolox為標準品，用無水乙醇稀釋成濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21和0.24 mg/mL的標準品溶液。分別取上述各濃度標準品溶液0.1 mL，加入ABTS+工作液4 mL，室溫下避光反應6 min，在波長734 nm處測定吸光度（A樣品），同時將蒸餾水反應液作為空白（A空白）。根據(jù)公式，計算ABTS+自由基清除率：

ABTS+自由基清除率=（1-A樣品/A空白）×100%

以Trolox濃度（X）為橫坐標、ABTS+自由基清除率（Y）為縱坐標，得到線性回歸方程。將待測樣品提取液稀釋4倍，測得ABTS+自由基清除率；然后帶入方程，計算得出相對于Trolox含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線方程

以吸光度（Y）對蘆丁濃度（X）進行線性回歸，得到二者的關系方程為y=1.029 5X-0.001 8，r2=0.999 9。說明蘆丁濃度在0.01～0.5 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好。

2.2 單因素條件的篩選（單因素試驗）

2.2.1 提取溶劑的篩選 不同溶劑提取的射干總黃酮含量差異較大，其中70%乙醇處理的總黃酮含量最高，且與其他溶劑處理差異均達到了顯著水平（圖1）。表明最佳的提取溶劑為70%乙醇。

圖1 提取溶劑種類對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of extraction solvents on total flavonoids content

2.2.2 乙醇濃度的篩選 隨著乙醇濃度的增大，射干總黃酮含量呈先增加后降低的變化，其中80%濃度處理的總黃酮含量最高，70%濃度處理次之，二者差異不顯著，但均與其他2個濃度處理差異達到了顯著水平（圖2）。表明適宜的乙醇濃度為70%～80%，其中70%較為經(jīng)濟。因此，選擇乙醇濃度70%進行下一步的正交試驗。

圖2 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on total flavonoids content

2.2.3 料液比的篩選 隨著乙醇用量的增大，射干總黃酮含量呈先增加后降低的變化，但不同用量處理的指標值差異均不顯著，其中2 mL用量處理的總黃酮含量最高（圖3）。表明適宜的料液比為1∶（10～30），綜合來看料液比為1∶20效果最好。因此，選擇料液比為1∶20進行下一步的正交試驗。

圖3 料液比對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on total flavonoids content

2.2.4 提取溫度的篩選 隨著提取溫度的升高，射干總黃酮含量呈先增加后降低的變化，其中70℃處理的總黃酮含量最高，且與其他溫度處理差異均達到了顯著水平（圖4）。表明最佳的提取溫度為70℃。因此，選擇提取溫度70℃進行下一步的正交試驗。

圖4 提取溫度對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids content

2.2.5 超聲功率的篩選 隨著提取功率的增大，射干總黃酮含量呈逐漸增加趨勢，其中90 W與100 W功率處理的總黃酮含量差異不顯著，但二者均與其他3個功率處理差異達到了顯著水平（圖5）。表明適宜的超聲功率為90～100 W，考慮到操作的安全性，認為90 W效果較好。因此，選擇超聲功率90 W進行下一步的正交試驗。

圖5 超聲功率對總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on total flavonoids content

2.3 提取條件的優(yōu)化（正交試驗）

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲功率4個因素作為考察對象，按照L9（34）正交表進行正交試驗設計（表1）。結(jié)果（表2）顯示，4個因素的R（極差）順序為B＞D＞C＞A，表明料液比對射干總黃酮含量影響最大，其次是超聲功率和提取溫度，乙醇濃度對射干總黃酮含量影響最??；9個試驗組合的總黃酮含量為6.90～9.54 mg/g，組合間差異較大，其中A1B2C2D2組合的指標值最高，表明射干總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度60%、料液比1∶20、提取溫度70℃、超聲功率80 W。

表1 正交試驗設計的因素及其水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experimental design

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 射干不同部位總黃酮的抗氧化活性

2.4.1 射干不同部位的總黃酮含量 射干須根、主根、花梗、葉、花、莖的總黃酮含量分別為9.81、9.38、6.03、12.30、11.12和1.37 mg/g，指標值順序為葉＞花＞須根＞主根＞花梗＞莖，其中葉的總黃酮含量顯著＞其他部位（圖6），約為莖總黃酮含量的8.98倍。表明射干不同部位的總黃酮含量差異較大，其中葉的總黃酮含量明顯高于其他部位。

圖6 射干不同部位的總黃酮含量Fig.6 Contents of total flavonoids in differentparts of B.chinensis

2.4.2 射干不同部位總黃酮對自由基的清除效果

2.4.2.1 對DPPH自由基的清除效果。隨著提取物黃酮濃度的增大，DPPH自由基清除率普遍呈逐漸增大趨勢；但相同濃度下，射干不同部位提取物對DPPH自由基的清除效果存在一定差異（圖7）。黃酮濃度為0.2～0.8 mg/mL時，所有部位提取物的DPPH自由基清除率均快速升高，其中黃酮濃度為0.8 mg/mL時須根、主根、花梗、葉、花、莖提取物的DPPH自由基清除率分別為65%、32%、69%、57%、70%和11%；增大黃酮濃度，除須根的DPPH自由基清除率變化甚微外，其他部位提取物的DPPH自由基清除率均繼續(xù)升高，其中黃酮濃度為1.4 mg/mL時須根、主根、花梗、葉、花、莖提取物的DPPH自由基清除率分別為65%、60%、92%、90%、96%和17%，其中花的DPPH自由基清除率約為莖的5.65倍。在試驗濃度范圍內(nèi)，射干須根、主根、花梗、葉、花、莖提取物對DPPH自由基清除的IC50分別為0.59、1.17、0.48、0.65、0.50和6.68 mg/mL?；üＬ崛∥锏腎C50最低，說明花梗對DPPH自由基的清除能力最好。

圖7 射干不同部位提取物的DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging rate of extracts from different parts of B.chinensis

2.4.2.2 對ABTS+自由基的清除效果。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、ABTS+自由基清除率（Y）為縱坐標，得到Trolox濃度對ABTS+自由基清除率的回歸方程為Y=377.96X＋8.429 4，r2=0.999。說 明Trolox濃 度 與ABTS+自由基清除率之間線性關系良好，且所得數(shù)據(jù)較為可靠。

射干不同部位提取物的ABTS+自由基清除率順序為須根＞葉＞花＞主根＞花梗＞莖，除莖外，其他各部位提取物均對ABTS+自由基表現(xiàn)出較高的清除能力（圖8）。其中，須根提取物的清除率為97.98%，與葉提取物的清除率（96.90%）差異不顯著，但二者均與其他部位提取物的清除率差異達到了顯著水平，說明射干須根和葉的提取物對ABTS+自由基具有很好的清除作用；花提取物的ABTS+自由基清除率居第3位，達到92.75%，為莖清除率的7.17倍。

圖8 射干不同部位提取物的ABTS+自由基清除率Fig.8 ABTS+free radical scavenging rate of extracts from different parts of B.chinensis

待測樣品溶液稀釋4倍后，射干不同部位ABTS+自由基清除能力相對于Trolox含量具有顯著差異，指標值順序分別為須根（9.5 mg/g）＞葉（9.04 mg/g）＞花（8.95 mg/g）＞主根（8.42 mg/g）＞花梗（5.66 mg/g）＞莖（0.73 mg/g）（圖9）。說明提取物對ABTS+自由基的清除率越高，相對于Trolox含量也越高。

圖9 射干不同部位ABTS+自由基清除能力相對于Trolox的含量Fig.9 ABTS+free radical scavenging rate of extracts from different parts of B.chinensis

2.4.3 射干總黃酮含量與其抗氧化活性的相關分析 射干不同部位的DPPH自由基清除率與其總黃酮含量的線性回歸方程為Y=5.504 1X+21.978，R2=0.565 1（p＞0.05）（圖10），表明二者相關不顯著；ABTS+自由基清除率與其總黃酮含量的線性回歸方程為Y=5.2246X+13.765，R2=0.937 6（p＜0.01）（圖11），表明二者相關性較好。

圖10 射干不同部位的DPPH自由基清除率與其總黃酮含量的相關性Fig.10 Correlation between DPPH free radical scavenging rate and total flavonoids content in different parts of B.chinensis

圖11 射干不同部位的ABTS+自由基清除率與其總黃酮含量的相關性Fig.11 Correlation between ABTS+free radical scavenging rate and total flavonoids content in different parts of B.chinensis

3 結(jié)論與討論

采用超聲輔助提取射干總黃酮，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法對射干總黃酮的提取條件進行優(yōu)化，得到最佳提取條件為乙醇濃度60%、料液比1∶20、提取溫度70℃、超聲波功率80 W；然后，采用優(yōu)化后的提取條件，對射干不同部位的總黃酮含量進行測定，結(jié)果顯示，射干各部位的總黃酮含量為1.37～12.30 mg/g，部位間差異較大，其中葉的總黃酮含量最高、莖的總黃酮含量最低，最高含量是最低含量的8.98倍。與單因素試驗結(jié)果稍有不同，本研究采用正交試驗將最佳提取參數(shù)組合起來，使得射干總黃酮提取更加完全。馮傳衛(wèi)等[13]采用正交優(yōu)化法確定了射干總異黃酮的最佳提取條件，認為正交優(yōu)化法較單因素試驗提取效果好，且乙醇濃度、乙醇用量和提取時間對射干總異黃酮提取率的影響顯著。目前，常見的總黃酮提取方法有傳統(tǒng)水浴提取法和超聲波提取法，其中，超聲波提取法利用超聲波的振動等作用，使組織的細胞破裂，加速細胞中成分的溶解，與水浴法相比極大地節(jié)約了時間，且提高了有效成分的提取率[14-16]。李森林[17]在研究射干異黃酮類化合物的分離中采用超聲輔助提取法，避免了物質(zhì)在高溫條件下失活，此工藝耗時短，是一種簡單易行的提取方法。另外，本研究中利用DPPH和ABTS+自由基清除率指標，進一步對射干不同部位提取物的抗氧化性進行了比較，結(jié)果顯示，射干不同部位提取物對2個自由基的抑制能力存在著一定差異。其中，花梗提取物對DPPH自由基的清除能力最強，IC50為0.48 mg/mL，但花?？傸S酮含量（6.03 mg/g）與其他部位（須根9.81 mg/g，主根9.38 mg/g，葉12.30 mg/g，花11.12 mg/g）相比較低；須根和葉提取物對ABTS+自由基的清除作用較好，清除率分別達到97.98%和96.90%，其總黃酮含量分別達到9.81和12.30 mg/g。射干總黃酮含量與其抗氧化活性的相關性分析結(jié)果顯示，射干總黃酮含量與其DPPH自由基的清除能力相關不顯著，但與ABTS+自由基的清除能力呈極顯著正相關。張玲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，藥桑提取物總黃酮含量與DPPH清除率呈顯著正相關，與ABTS+清除率呈不顯著正相關。牛東玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞葉萃取的總黃酮含量在一定質(zhì)量濃度下對DPPH自由基具有較高的清除率，DPPH自由基清除率與總黃酮含量呈極顯著正相關。楊利軍[20]研究結(jié)果顯示，多種中藥提取液DPPH抗氧化抑制率與總黃酮含量的相關系數(shù)為0.608 8，二者存在一定的相關性，但線性關系不顯著。李紅梅[21]發(fā)現(xiàn)，苦蕎茶總黃酮含量與清除DPPH自由基的能力呈極顯著負相關，與其總抗氧化能力呈極顯著正相關。以上研究為射干的綜合開發(fā)利用提供了一定的參考。