EDU緩解稻麥臭氧脅迫的作用與機制研究進展

劉園園，蘇熠，王琪

（南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇 南京 210044）

臭氧（O3）是溫暖晴朗天氣下氮氧化物和揮發(fā)性有機化合物經(jīng)光化學氧化反應產(chǎn)生的一種氧化性氣體，其地表背景濃度為20～40 μg/L[1]。O3濃度超過正常的本底濃度后，就會成為空氣污染物[2]，不僅對植物產(chǎn)生傷害，還影響人體健康。

在過去的30年里，人們對O3的研究越來越多。O3是全球范圍內能嚴重傷害植物的空氣污染物之一，工業(yè)革命以來的人為活動致使近年來O3濃度一直呈迅速升高趨勢[3]。據(jù)估計，在未來幾十年里北半球的地面O3濃度還會繼續(xù)以每年0.5%～2.0%的速度增長，到2060年全球平均地表濃度將達到40～60 μg/m3[1]。近幾十年來，我國許多城市和地區(qū)經(jīng)歷了高O3事件，且地表O3濃度呈上升趨勢。目前我國存在著難以想象的O3污染，2005～2010年O3年平均濃度峰值高達60 μg/L[4]?？諝獗O(jiān)測發(fā)現(xiàn)，亞洲一些地區(qū)的重要農(nóng)作物生長季節(jié)，O3月平均濃度達到50 μg/L十分常見[5]。印度學者進行模型研究后認為，未來幾年O3濃度將會進一步升高[6，7]。

高濃度的O3會對植物造成各個方面的不利影響，其直接影響植物的生理生化過程，從而可能導致植物對其他生物或非生物脅迫應激反應降低[8]。如，O3脅迫可能會導致植物葉綠素含量下降，光合作用和氣孔導度降低[9]；降低植物的抗氧化劑水平，加速葉片衰老[10]，最終導致植物總生物量和營養(yǎng)產(chǎn)量降低[11～15]。最近一項關于全球性O3污染導致作物減產(chǎn)的風險評估數(shù)據(jù)顯示，2010～2012年我國每年因為O3污染造成的水稻、小麥減產(chǎn)幅度分別為8.1%和9.8%[16]。長三角地區(qū)是我國經(jīng)濟發(fā)展活躍區(qū)域之一，也是我國農(nóng)作物主產(chǎn)區(qū)和O3主要污染區(qū)，2014～2017年O3污染導致該區(qū)域水稻年均減產(chǎn)2 445百萬t，年經(jīng)濟損失約為10億美元[17]。由于水稻種植季節(jié)與環(huán)境的O3濃度峰值重疊，今后由O3污染造成的產(chǎn)量損失將進一步加大[18]。小麥是僅次于玉米的第二大糧食作物，2016年世界小麥產(chǎn)量為7.49億t（糧農(nóng)組織2016年）。我國小麥主產(chǎn)省位于華北平原以及華中和華東地區(qū)，這些區(qū)域也是O3污染嚴重的地區(qū)[19]。一項meta分析表明，與生長在木炭過濾空氣中的植物相比，O3濃度升高（50～75 μg/L）會造成小麥減產(chǎn)24%[12]。據(jù)估計，因O3濃度升高，2030年全球小麥產(chǎn)量與2000年相比將下降4%～17%[20]?？梢钥闯?，當前我國高濃度O3對稻麥作物的負面影響已經(jīng)到了不容忽視的地步。

意識到O3污染的嚴重性后，人們開始尋找解決辦法。1978年Carnahan等[21]報道了一種名為Ethylenediurea（EDU）的物質，似乎在保護植物免受O3傷害方面非常有效。截至目前，EDU仍被人們廣泛應用于緩解O3脅迫的不良影響。眾多研究也表明了EDU能夠有效抑制O3脅迫，對許多受O3脅迫的植物如水稻[22]、小麥[23]、玉米[24]、豆類[25]和楊樹[26]等具有明顯的保護作用。對EDU緩解稻麥臭氧脅迫的作用與機制研究進展進行綜述，以期提高人們對EDU緩解O3脅迫作用機理的認識，有利于在O3濃度較高的情況下合理應用EDU來保護作物。

1 EDU的簡介

1.1 EDU的由來

EDU由杜邦公司于1970年開發(fā)出來，并在1975年首次被人們發(fā)現(xiàn)具有抗O3脅迫的作用。EDU是一種非商業(yè)性化合物，但截至目前尚未見到其合成的詳細報道。EDU基本的兩大組成是尿素（U）和苯基脲（PU），在EDU的相對分子質量中，U、PU分別占23.46%和53.18%。EDU是一種含氮化合物，其中10.5%的氮素來自尿素，10.94%的氮素來自苯基脲成分[27]。從EDU的分子結構（圖1）可以看出，由于Remarkably化合物不含烯烴雙鍵，因此不太可能直接清除O3[2]。

圖1 EDU的分子結構Fig.1 Molecular formula of EDU

1.2 EDU在植物體內的運輸和吸收

眾所周知，當O3通過氣孔進入葉片，到達細胞膜或細胞壁，即質外體時，就開始對植物組織產(chǎn)生影響[28，29]。O3是通過破壞植物的膜結構和通過膜中脂質的過氧化作用改變膜的通透性，從而影響植物細胞膜的[30]。前人研究結果表明，EDU對受O3脅迫植物的保護作用發(fā)生在植物的質外體中，而不是發(fā)生在原生質體中[31～34]。

EDU在注射后不久就開始遵循頂瓣方向在植物器官里移動，并且速度很快[35]；使用2 h后，便會出現(xiàn)在植物的所有組織，并且EDU濃度隨著使用后時間的推移而增加，直至應用的劑量被吸收[32]。植物根和莖中的EDU濃度隨使用后時間的延長而降低，但是葉片中的EDU濃度不存在該現(xiàn)象。

1.3 EDU的應用方式

1.3.1 莖注射 該方法主要適用于樹木，是對樹木木質組織注入化學物質的有效使用方法。但不論是作物還是樹木，與其他2種方式相比，該方法所需EDU劑量均較小[36]，且效果好于土壤噴施法。應用該方法需要在樹木上打開多個孔才能促進EDU充分吸收，所以會對樹木造成傷口，加大疾病感染的風險，且使用過程較土壤噴施和葉面噴施更復雜、耗時。

1.3.2 土壤噴施 該方法較其他2種方法使用簡單，且節(jié)省時間。但在使用過程中，需要考慮到影響EDU吸收和有效性的土壤因素，如土壤微生物數(shù)量、土壤有機質含量、土壤肥力、土壤結構等[2，37]。

1.3.3 葉面噴施 該方法是在稻麥作物上最常用的方法，使用劑量根據(jù)作物葉面積而定。該方式需要在植物氣孔完全打開時才能應用；在多風、干燥地區(qū)，植物氣孔大多關閉，EDU使用后可能無效，這種情況下需要在每次施用前一天對植物進行灌溉[36]。

1.4 EDU的適用濃度及有效時間

印度的一項研究表明，400 mg/L的EDU去評估環(huán)境O3的影響最有效，且能夠為生長好、產(chǎn)量高的小麥品種提供最大程度的保護。當EDU施用濃度達到400 mg/L以上時，對小麥正常生長無明顯影響。此外，僅在植物生命的特定階段或僅在旗葉上施用EDU不足以評估O3對植株的影響，因此在植株的整個生長期都需要施用EDU。需要注意的是，EDU葉面噴施1 h后若受到雨水沖洗，其濃度將在第3天開始下降[38]。一般來說，EDU在植物體內可以留存8～15 d，但在植物中的有效性和持久性因植物類型而異，因此需重復施用。

關于EDU的施用量，有人提出通過植物總葉面積來計算，因此，每次施用的EDU劑量較整個生長季節(jié)施用的EDU累計總劑量更有意義。已有證據(jù)表明，應用莖注射方式，按葉面積施用13～26 mg/m2的EDU，可有效防止O3毒性[38，39]。根據(jù)Agathokleou提供的數(shù)據(jù)進行重新計算，結果表明，按葉面積噴施14.6～29.1 mg/m2的EDU，相當于葉面噴施EDU的濃度為200 mg/L，可提供足夠的保護作用[40]。

2 EDU的作用

2.1 作為篩選作物O3耐性的工具

O3濃度不斷升高對糧食安全造成了一定威脅，我們要培育出適應高濃度O3環(huán)境的優(yōu)良作物品種，以確保糧食安全生產(chǎn)。這就要求我們在育種過程中對作物的高濃度O3適應性進行充分的實地評估，但是O3熏蒸設施的技術挑戰(zhàn)和建設成本都很大。近年來有研究表明，可以通過EDU來評估大田條件下O3對作物的負面影響，如利用EDU篩選稻麥作物及部分樹種對O3的敏感程度[41～44，2，37]，因為O3脅迫下，對O3敏感的基因型植物對EDU的反應較耐O3基因型植物強烈得多。Ashrafuzzaman等[45]為了研究EDU作為篩選作物是耐O3型還是敏感型的有效工具，選取3個不同基因型的水稻（耐O3型L81，敏感型NB和BR28）采用4種處理方式（空白對照，施用EDU的對照，O3處理，施用EDU的O3處理）研究了不同基因型水稻對EDU的反應，結果表明，O3脅迫處理下，施用EDU對水稻MDA含量、SPAD值、氣孔導度和光譜反射指數(shù)具有顯著影響，其中，對敏感基因型BR28和NB的單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)等重要產(chǎn)量性狀影響顯著，而對耐性基因型L81僅在株高、SPAD值和氣孔導度等少數(shù)性狀上影響較大。因此，EDU可以作為改良稻麥作物雜種優(yōu)勢的有效工具，用來篩選稻麥作物及其不同品種在自然田間條件下對O3的敏感性。尤其在O3監(jiān)測技術尚不成熟的發(fā)展中國家，使用EDU評估O3對植物的影響很有必要。在未來O3濃度升高的環(huán)境下，通過改良作物性狀培育耐O3或抗O3稻麥新品種可有效提升稻麥產(chǎn)量[46]，預計到2030年由高濃度O3引起的全球作物損害較2000年可減輕12%[47]，最終有望基本消除高濃度O3對作物造成的破壞性影響，確保全球糧食安全。

2.2 對稻麥作物的影響

2.2.1 對稻麥作物生長和形態(tài)參數(shù)的影響 以往研究早已證實，高濃度O3脅迫下施用EDU可以保護植物進行正常生長。研究表明，EDU能夠改善高O3脅迫植物的各種形態(tài)參數(shù)[48，49]，300 mg/L處理下小麥株高顯著增加[50]，500 mg/L處理下小麥葉片數(shù)量明顯增多[51]。

2.2.2 對稻麥作物生物量和產(chǎn)量的影響 高濃度O3脅迫會加速稻麥作物葉片衰老，表現(xiàn)為脂質氧化增強，色素含量和光合速率快速下降[52]，最終導致千粒重和產(chǎn)量降低[53]。施用EDU可以減少O3對稻麥作物的可見傷害和生長衰退[2]，盡管這種保護作用通常并不完美。EDU處理后，相對生長速率和凈同化率等生長指標提高，表明生物積累量增加，植物已經(jīng)克服了O3的負面影響[54]；比葉重增大，表明光合產(chǎn)物在葉片分配得較多，導致有效葉面積比高于非EDU處理。與未EDU處理的對照組相比，450 mg/L的EDU處理可明顯提高水稻葉、穗、莖、芽、根以及整個植物的干物質重，指標值增幅分別為15.3%、16.2%、25.3%、18.2%、23.9%和18.7%[55]。

EDU對受O3脅迫稻麥作物的保護作用最終體現(xiàn)在產(chǎn)量和產(chǎn)量性狀上，EDU處理的稻麥作物產(chǎn)量和產(chǎn)量性狀較未處理對照顯著增加。在作物生長過程中重復施用EDU，可為作物提供一系列的保護，最終使產(chǎn)量增加（圖2）。EDU能使營養(yǎng)生長期的葉片保持較高的生物量，并將更多的光合產(chǎn)物轉移到生殖部位，從而提高產(chǎn)量[56]。與水分處理相比，EDU處理的所有品種小麥均可顯著提高千粒重和收獲指數(shù)，指標值增幅分別為16.7%和17.7%[57]。環(huán)境O3濃度為34.2～54.2 μg/L時，400 mg/L的EDU處理可顯著提高小麥產(chǎn)量，且對O3越敏感的品種對EDU處理的反應越積極，5個小麥品種（HUW468、HUW510、HUW234、Sonalika和PBW343）中最敏感品種HUW468施用EDU后增產(chǎn)幅度最大[48]。Agrawal等[51]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，在產(chǎn)量上HUW468對O3的敏感性高于其他小麥品種（HUW234和HD2329）。Shang等[55]研究表明，水稻在2個不同濃度的O3（NF和NF60）脅迫下，EDU處理的水稻平均產(chǎn)量和千粒重較非EDU處理分別提高16.4%和6.7%；且O3×EDU互作效應顯著，NF60較NF顯著降低了非EDU處理植株的穗粒數(shù)。因此，EDU處理不僅能防止作物總產(chǎn)量損失，還能有效避免作物產(chǎn)量構成的其他因素受到影響。

圖2 作物生長過程中施用EDU對作物的積極影響Fig.2 The positive impact of EDU on crops during growth

3 EDU的作用機制

3.1 生理學機制

EDU在緩解O3對植物的傷害方面具有積極作用。研究表明，EDU可能通過直接影響生理參數(shù)或通過抗氧化劑介導的防御反應來清除O3對植物的有害活動[2]。O3通過植物膜中脂質的過氧化作用影響膜的通透性，而EDU可以通過清除O3產(chǎn)生的活性氧和提高相關自由基的酶活性來保護植物組織免受脂質過氧化。O3會在細胞間隙產(chǎn)生一系列潛在的破壞性活性氧（ROS），從而引發(fā)抗氧化反應[58]。同時在葉子內部潮濕的環(huán)境中這些氧化過程會產(chǎn)生H2O2，這是很重要的O3衍生氧化劑之一，它的產(chǎn)生可能會導致其他ROS如超氧化物和羥基自由基的形成[59]。ROS能夠氧化細胞成分如脂質、蛋白質、巰基和核酸，并引發(fā)自由基連鎖反應[60]。研究表明，EDU對受O3脅迫植物的積極影響是因為EDU引起了植物質外體抗氧化劑水平的變化，從而提高ROS清除酶的效率[61]。植物體內的幾種抗氧化劑（如抗壞血酸、谷胱甘肽）和抗氧化酶〔如抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）〕可保護植物免受O3的氧化傷害。在芥菜上的研究結果顯示，EDU處理后可誘導抗壞血酸含量增加，谷胱甘肽循環(huán)酶、SOD和CAT活性提高，這對ROS解毒有很大幫助[62]。

O3脅迫對植物類囊體膜中的電子傳遞過程會產(chǎn)生負面影響[63]，而EDU處理可保護葉綠素免受損失[64]。有研究顯示，EDU處理有助于緩解O3誘導的PSⅡ反應中心失活等問題[65]，且對光反應的積極影響能夠延續(xù)到暗反應中，使植物光合速率提高，主要表現(xiàn)為植物固碳能力的增強。但大多數(shù)研究表明，EDU對植物光合作用的影響并不顯著[48，66]。值得思考的是，既然EDU對植物的光合作用無明顯影響，那么，為什么經(jīng)過EDU處理后植物會生長得更好？探究EDU對O3環(huán)境中幾種植物氣孔導度的影響，結果顯示，EDU并未對氣孔導度產(chǎn)生直接影響[67，68]。一項關于EDU對植物影響的分析也表明，EDU對植物氣孔的直接影響甚微[44]?？梢钥闯鯫3對植物氣孔的作用機制復雜，今后應在這方面開展更多的研究和探討。

3.2 遺傳學機制

2018年Ashrafuzzaman等[18]將O3敏感和耐受的水稻品種暴露于O3和對照環(huán)境中，然后對水稻進行RNA測序，并對轉錄圖譜進行分析，結果顯示，對O3敏感的品種有上千個基因對O3做出了反應，卻沒有一個基因對EDU做出反應。該研究結果為EDU是一種表面保護劑提供了有力證據(jù)，說明EDU可以在不直接干擾植物脅迫反應系統(tǒng)的情況下減輕O3脅迫。

Gupta等[24]通過鑒定小麥葉片質外體和葉綠體中的EDU響應蛋白，啟動了MAE的蛋白質組學研究。這是首次對質外體和葉綠體分離株響應EDU蛋白質組學的研究。結果表明，EDU能夠影響植物的光合作用蛋白，同時減輕ROS造成的氧化壓力。使用1D/2D PAGE對2種EDU濃度（200、300 mg/L）的葉綠體分離蛋白在高濃度O3條件下進行蛋白質組圖譜分析，并從2個小麥品種（Kundan、PBW 343）的鮮葉中分離出質外體和葉綠體，結果表明，質外體蛋白（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、類胚芽蛋白和抗壞血酸過氧化物酶）通過維持O3脅迫下的最佳ROS池來達到清除O3損害的作用。在葉綠體中，參與光合作用、能量代謝和PSAD的蛋白如Rubisco LSU、OEE、細胞色素b-6-f復合物、捕光a/b結合蛋白、FNR等增加了蛋白豐度，以應對O3脅迫帶來的不利影響。這一研究極大地擴展了我們對EDU作用模式的認知。分析葉綠體分離株的蛋白質豐度模式，可以從分子水平上更好地解釋在普遍的O3脅迫下EDU是如何影響光合作用機制的。

4 總結與討論

通過文獻分析，我們很清楚地了解到EDU對遭受O3脅迫的植物具有一定的保護作用，且稻麥敏感品種對這種保護反應更加顯著。雖然這種保護并不完美，但在一定程度上能夠減少O3脅迫造成的損失。EDU可以作為檢測稻麥作物品種對O3敏感性的有效工具，用于培育耐O3品種，降低高O3造成的損失，在一定程度上確保糧食安全。

EDU對稻麥作物的保護作用是系統(tǒng)性的，對作物的生理生化過程以及生物量和產(chǎn)量均有一定的積極效應，但是具體的代謝途徑我們還不完全明白。目前專家們對EDU的保護作用研究已經(jīng)開始往“組學”方面深入，這將使我們在未來能夠更加清楚地了解EDU的保護機制?，F(xiàn)階段應用“組學”工具解釋EDU的作用機制研究較少，基因表達和蛋白質譜的研究可以幫助我們更好地了解EDU使植物免受O3傷害、提供部分保護的實際機制。