蘆筍莖枯病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及鑒定

蘇卓文，盧彩鴿，蔡淑琳，張濤濤，董 丹，趙 娟，張殿朋

（北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097）

蘆筍莖枯病是由有絲分裂孢子真菌天門(mén)冬擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis asparagi）引起的莖部病變，是蘆筍生產(chǎn)上的毀滅性病害，其發(fā)生程度呈逐年加重的趨勢(shì)[1]。目前，我國(guó)傳統(tǒng)病蟲(chóng)害防治手段以物理防治和農(nóng)業(yè)防治為主，化學(xué)防治為輔，傳統(tǒng)防治技術(shù)雖然能夠在一定程度上對(duì)病蟲(chóng)害進(jìn)行防治，但病蟲(chóng)害抗藥性以及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題不僅影響防治效果，也與綠色可持續(xù)發(fā)展理念相悖。近年來(lái)，綠色防治技術(shù)逐漸受到人們的重視[2]。生物防治是綠色防治技術(shù)的重要內(nèi)容，具有經(jīng)濟(jì)、安全、不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，在病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

近年來(lái)，利用內(nèi)生生防細(xì)菌防治植物病害的生物防治手段備受關(guān)注。CUI 等[3]從馬鈴薯塊莖中分離出拮抗馬鈴薯瘡痂病的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌；HAMAOKA 等[4]發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌KOF112 是一株具有廣譜真菌拮抗作用的內(nèi)生菌株，能夠很好地定殖于葡萄植株，有助于葡萄栽培中的害蟲(chóng)管理；SREBOT 等[5]測(cè)定了固氮葡糖醋桿菌在番茄植株上的定殖能力及其對(duì)植物病原菌青枯菌的生防效果。大量研究表明，利用植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病蟲(chóng)害進(jìn)行生物防治，能夠更有效地解決拮抗菌在宿主植物中的生長(zhǎng)和繁殖問(wèn)題，從而為促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)提供更加有利的條件。目前，對(duì)于蘆筍莖枯病的防治技術(shù)大多還停留在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治方式上，如柴文臣等[6]研究了5種農(nóng)藥對(duì)蘆筍莖枯病的防治效果；倪蘭庭[7]從傳統(tǒng)防治技術(shù)的3個(gè)方面總結(jié)了蘆筍莖枯病的防治要點(diǎn)，如清除病株、加強(qiáng)管理、地表覆蓋和藥劑治療等；瞿華香等[8]闡述了蘆筍莖枯病的防控現(xiàn)狀，主要包括蘆筍的栽培技術(shù)、農(nóng)藥防治和防控技術(shù)，并強(qiáng)調(diào)了蘆筍抗病育種的重要性。有關(guān)蘆筍病害的生物防治研究較少，鑒于此，針對(duì)分離自北京密云區(qū)野生蘆筍根部的52 株內(nèi)生細(xì)菌，采用體外平板對(duì)峙試驗(yàn)和溫室防效測(cè)定試驗(yàn)，篩選對(duì)蘆筍莖枯病具有生防效果的優(yōu)良菌株，并確定菌株的分類(lèi)學(xué)地位，初步探索其抑菌活性，為蘆筍莖枯病的生物防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試52 株內(nèi)生細(xì)菌均分離自北京市密云區(qū)的野生蘆筍根部；供試病原菌天門(mén)冬擬莖點(diǎn)霉菌（P.asparagi）分離自北京市農(nóng)林科學(xué)院蘆筍種植基地的感病蘆筍。上述菌株均由北京市農(nóng)林科學(xué)院生防微生物研究室分離、純化和保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌活化培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基[9]；平板對(duì)峙培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基[10]；生防相關(guān)性狀測(cè)定培養(yǎng)基：CAS 培養(yǎng)基[11]（檢測(cè)嗜鐵素）、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[12]（檢測(cè)幾丁質(zhì)酶）、脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基[13]（檢測(cè)蛋白酶）、剛果紅培養(yǎng)基[14]（檢測(cè)纖維素酶）和Pikovskaya’s 瓊脂培養(yǎng)基[15]（檢測(cè)磷酸酯酶）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗菌的初篩 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選。將蘆筍莖枯病菌接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，自菌落邊緣用無(wú)菌打孔器取直徑5 mm 的菌餅，菌絲面朝下置于平板中央，在距離蘆筍莖枯病菌菌餅4 cm 處用接種環(huán)取供試內(nèi)生細(xì)菌劃線，以僅接種蘆筍莖枯病菌的平板作為空白對(duì)照（CK），每組試驗(yàn)3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察和記錄病原菌直徑，7 d后計(jì)算抑菌率[16]。

1.3.2 初篩拮抗菌的溫室防效測(cè)定 以體外篩選的拮抗菌作為溫室防效測(cè)定的出發(fā)菌株。供試蘆筍品種為京綠蘆1 號(hào)（購(gòu)自北京鳳鳴雅士公司），選取株高、莖粗和生長(zhǎng)階段相同的健康蘆筍，采用共同接種法，接種P.asparagi孢子懸液（105個(gè)/mL）后，同一時(shí)間段內(nèi)用拮抗菌株發(fā)酵液（107cfu/mL）噴施，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（僅接種P.asparagi，不噴施拮抗菌株發(fā)酵液）及空白對(duì)照（CK，不接種P.asparagi，不噴施拮抗菌株發(fā)酵液），每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)20 株健康蘆筍。記錄10 d 后蘆筍莖枯病的發(fā)病情況并進(jìn)行拮抗菌液的第2 次噴施，之后每隔10 d 統(tǒng)計(jì)1 次發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防治效果，30 d 后結(jié)束病情統(tǒng)計(jì)。

蘆筍莖枯病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17]：

0級(jí)：蘆筍整株沒(méi)有病斑；

1 級(jí)：蘆筍主莖病斑繞莖長(zhǎng)度占主莖周長(zhǎng)25%以下，或側(cè)枝發(fā)病率25%以下；

2 級(jí)：蘆筍主莖病斑繞莖長(zhǎng)度占主莖周長(zhǎng)25%～50%，或側(cè)枝發(fā)病率25%～50%；

3 級(jí)：蘆筍主莖病斑繞莖長(zhǎng)度占主莖周長(zhǎng)50%～75%，或側(cè)枝發(fā)病率50%～75%；

4 級(jí)：蘆筍主莖病斑繞莖長(zhǎng)度占主莖周長(zhǎng)75%以上，或側(cè)枝發(fā)病率75%以上。

防效計(jì)算方法：

病株率=（病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%，

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×該級(jí)嚴(yán)重度）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100，

防治效果=（病原菌孢子液處理組病情指數(shù)-拮抗細(xì)菌與病原菌共同處理組病情指數(shù)）/病原菌孢子液處理組病情指數(shù)×100%。

1.3.3 拮抗菌株生防相關(guān)性狀檢測(cè) 將靶標(biāo)拮抗菌在28 ℃下培養(yǎng)24 h，然后分別接種于1.2 中制備的生防相關(guān)性狀測(cè)定培養(yǎng)基平板上，每處理3 個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)平板上菌落周?chē)该魅χ睆酱笮〕醪皆u(píng)估菌株的生防能力。

1.3.4 拮抗菌株鑒定 形態(tài)觀察：將最終篩選出的拮抗內(nèi)生細(xì)菌接種于LB 平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)、大小，并記錄菌落的色澤、透明度、致密度和邊緣等特征情況。

生理生化特性分析：參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)拮抗菌株的生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：參照TIANGEN 細(xì)菌基因組試劑盒說(shuō)明書(shū)提取生防細(xì)菌的基因組DNA。以總DNA作為模板，用引物27F/1492R（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′/5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）擴(kuò)增16S rDNA 序列[19]，引物gyrB1/gyrB2（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′/5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCA-3′）擴(kuò) 增gyrB基因[20]。PCR 擴(kuò) 增 體 系：2×TaqMix 20 μL、基 因 組DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 23 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火35 s（16S rDNA）或者60 ℃退火30 s（gyrB），72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果（北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）在NCBI 的BLAST 搜索比對(duì)，根據(jù)同源性鑒定種屬。使用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析（重復(fù)次數(shù)為1 000）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件，差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍莖枯病菌拮抗菌株的體外篩選

采用平板對(duì)峙法對(duì)52 株蘆筍內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了體外拮抗試驗(yàn)，共有7 株（占比13%）內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘆筍莖枯病菌具有拮抗活性。其中，抑菌率超過(guò)60%的有3 株，分別是YS-G10、YS-G3 和GLDJ5，其對(duì)應(yīng)抑菌率分別為85.00%、63.70%、75.89%；其余菌株抑菌率在32.33%～47.63%，YS-J1 抑菌率最低（表1）。菌株YS-G10 對(duì)蘆筍莖枯病菌的抑制效果最為明顯（圖1a），通過(guò)顯微鏡觀察病原菌菌絲發(fā)現(xiàn)，YS-G10能夠使病原菌菌絲卷曲、折疊，菌絲細(xì)胞出現(xiàn)泡囊化現(xiàn)象，而正常菌絲細(xì)長(zhǎng)，光滑且均勻（圖1b）。

表1 7株拮抗菌株對(duì)蘆筍莖枯病菌拮抗活性的體外試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Antagonistic activity of seven antagonistic strains against P.asparagi in vitro

圖1 菌株YS-G10對(duì)P.asparagi的拮抗活性Fig.1 Antifungal activity of strain YS-G10 against P.asparagi

2.2 拮抗菌株對(duì)蘆筍莖枯病的溫室防效

對(duì)體外對(duì)峙試驗(yàn)篩選出的3株拮抗能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行溫室防效測(cè)定，結(jié)果（表2）表明，第1 次拮抗菌噴施處理后10 d，各試驗(yàn)處理組與對(duì)照組的病情指數(shù)之間出現(xiàn)差異，處理后30 d 陽(yáng)性對(duì)照組染病植株整株枯萎死亡。統(tǒng)計(jì)顯示，處理后30 d 菌株YS-G10 和GLDJ5 發(fā)酵液對(duì)蘆筍莖枯病的防治效果在50%以上，分別為73.44%、62.50%；YS-G3 發(fā)酵液處理的防效較弱，僅為21.88%。綜合體外平板對(duì)峙結(jié)果和溫室防效結(jié)果，最終確定菌株YS-G10 為蘆筍莖枯病的最優(yōu)拮抗菌株，拮抗效果較為明顯（圖2）。

表2 3株初篩生防細(xì)菌對(duì)蘆筍莖枯病的溫室防效Tab.2 Greenhouse control effect of three strains of primarily screened biocontrol bacteria on stem blight of asparagus

圖2 菌株YS-G10溫室防效測(cè)定Fig.2 Control effect of strain YS-G10 in greenhouse

2.3 菌株YS-G10生防相關(guān)性狀檢測(cè)

將菌株YS-G10 在生防相關(guān)性狀檢測(cè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～72 h 后，觀察其產(chǎn)酶特性。由圖3 可知，菌株YS-G10 在蛋白酶和纖維素酶檢測(cè)平板上能夠形成明顯的透明圈，在嗜鐵素、幾丁質(zhì)酶和磷酸酯酶檢測(cè)平板上沒(méi)有水解活性。推測(cè)菌株YS-G10 可能通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等水解酶類(lèi)物質(zhì)破壞病原真菌細(xì)胞壁或抑制病原菌致病毒素的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制蘆筍莖枯病的效果。

圖3 菌株YS-G10產(chǎn)蛋白酶（a）和纖維素酶（b）檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of strain YS-G10 producing protease（a）and cellulase（b）

2.4 菌株YS-G10的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征 將所篩選的內(nèi)生細(xì)菌YS-G10接種于LB 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行菌株形態(tài)觀察。在LB 培養(yǎng)基上菌株YS-G10 的菌落呈奶白色，菌落中心偏黃，邊緣偏白，不透明，表面有褶皺，易挑起，隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，菌落變厚，邊緣不規(guī)則（圖4a）。革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性菌，單個(gè)，短桿狀（圖4b）。

圖4 菌株YS-G10的菌落形態(tài)（a）及顯微鏡觀察結(jié)果（b）Fig.4 Results of YS-G10 colony morphology（a）and microscopic observation（b）

2.4.2 生理生化特性 菌株YS-G10 的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果如表3。由表3可得出，該菌在pH 值7.5環(huán)境下能夠正常生長(zhǎng)，在pH 值8.5 和pH 值9.5 環(huán)境下不能生長(zhǎng)。該菌株能夠利用甘油、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、衛(wèi)茅醇、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-甘露糖糖苷、α-甲基-D-葡萄糖糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈檸檬酸鐵、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、木糖醇、D-龍膽二糖、葡萄糖酸鉀、2 酮基-葡萄糖酸鉀。YS-G10 在20 ℃和40 ℃下生長(zhǎng)良好，60 ℃下不能生長(zhǎng)。

表3 菌株YS-G10的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain YS-G10

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定 以菌株YS-G10 基因組DNA 為模板，對(duì)其16S rDNA 序列和gyrB基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別獲得1 400 bp 左右的單一特異性片段。根據(jù)16S rDNA 序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果（圖5）表明，菌株YS-G10 與4 株貝萊斯芽孢桿菌[Bacillus velezensisstrain NN95（MT114576.1）、Bacillus velezensisstrain NN05（MT114571.1）、Bacillus velezensisFC37（OU487633.1）、Bacillus velezensisstrain BCRC 17467（EF433407.1）]聚類(lèi)在一個(gè)分支上。根據(jù)gyrB基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（圖6），菌株YS-G10 也與4 株貝萊斯芽孢桿菌[Bacillus velezensisstrain JT3-2（MT437378.1）、Bacillus velezensisstrain NN05（MT119758.1）、Bacillus velezensisstrain NN95（MT119763.1）、Bacillus velezensisstrain BCRC 17467（DQ903176.1）]單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支，而同屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的其他菌種則聚于其他幾個(gè)組中。綜合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定菌株YS-G10 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖5 菌株YS-G10的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain YS-G10

圖6 菌株YS-G10的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of gyrB gene sequence of strain YS-G10

續(xù)表3 菌株YS-G10的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果Tab.4（Continued） Physiological and biochemical characteristics of strain YS-G10

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，芽孢桿菌屬被認(rèn)為是最成功的生物防治劑，有些菌株可以在根組織中定殖而不產(chǎn)生有害影響，并通過(guò)拮抗、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性、爭(zhēng)奪根際生態(tài)位等不同機(jī)制抑制植物病原菌。其中，貝萊斯芽孢桿菌是一種具有廣譜抑菌能力的生防細(xì)菌，其對(duì)多種病原菌具有不同程度的抑制作用，具有拮抗多種病原菌的能力，如立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、鐮孢菌（Fusarium）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea） 、草 莓 炭 疽 病 菌（Colletotrichum gloeospoioides）、煙 草 黑 脛 病 菌（Phytophthora nicotianae）、鏈格孢菌（Alternaria alternate）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum）[21]等。且此類(lèi)細(xì)菌具有許多不同的生防特性，如產(chǎn)植物激素和抗生素、產(chǎn)水解酶破壞真菌結(jié)構(gòu)、溶磷和固氮作用等[22]。

本研究成功篩選出1株內(nèi)生芽孢桿菌YS-G10，在體外平板對(duì)峙試驗(yàn)中，YS-G10 對(duì)P.asparagi的抑菌率達(dá)到85.00%，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，YS-G10對(duì)病原菌真菌菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，使真菌菌絲產(chǎn)生明顯的形態(tài)扭曲；溫室防效測(cè)定結(jié)果表明，蘆筍莖枯病菌與107cfu/mL YS-G10發(fā)酵液共同接種，蘆筍莖枯病癥狀相比陽(yáng)性對(duì)照和其他拮抗菌處理明顯減輕，防效達(dá)到73.44%。根據(jù)形態(tài)學(xué)檢測(cè)以及16S rDNA 和gyrB基因測(cè)序，初步鑒定YS-G10 為貝萊斯芽孢桿菌。

水解酶的產(chǎn)生是細(xì)菌作為潛在生物防治劑的一個(gè)重要特征，這些水解酶能夠通過(guò)降解真菌的細(xì)胞壁或抑制病原菌致病毒素的產(chǎn)生來(lái)抑制真菌的生長(zhǎng)。DHOUIB 等[23]從番茄組織中分離出1 株能夠產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和β-葡聚糖酶的內(nèi)生芽孢桿菌C2，其能夠在體內(nèi)和體外有效抑制番茄黃萎病。病原真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)、葡聚糖、纖維素等物質(zhì)，因此，許多內(nèi)生細(xì)菌可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶等來(lái)控制植物真菌病害。此外，有些真菌病原菌侵染植物是通過(guò)分泌真菌效應(yīng)蛋白來(lái)抑制植物防御反應(yīng)，調(diào)控植物生理機(jī)制使其能適應(yīng)真菌侵染，并為真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，YS-G10 能夠大量分泌蛋白酶和纖維素酶，因此，推測(cè)YS-G10 可能通過(guò)產(chǎn)生水解酶類(lèi)物質(zhì)達(dá)到抑制病原菌的效果。

盡管YS-G10 是一株較為有效的生防芽孢桿菌，但要將該菌株實(shí)際應(yīng)用于蘆筍莖枯病的防治中，還需要進(jìn)行生物制劑的研發(fā)和菌劑安全性評(píng)估等生產(chǎn)試驗(yàn)，并深入研究該菌株抑菌活性成分及其作用機(jī)制，為蘆筍莖枯病的生物防治奠定基礎(chǔ)。