不同面團(tuán)強(qiáng)度小麥品種差異表達(dá)貯藏蛋白基因分析

晁岳恩，李文旭，王沙沙，楊 攀，吳政卿

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分子育種研究院，河南 鄭州 450002）

小麥籽粒貯藏蛋白主要包括醇溶蛋白、麥谷蛋白、球蛋白、清蛋白以及近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的類燕麥貯藏蛋白等。小麥面粉的獨(dú)特性在于其貯藏蛋白中的面筋蛋白質(zhì)（主要是醇溶蛋白和麥谷蛋白）與水相互作用能交聯(lián)成高分子的、疏松多孔的網(wǎng)狀膠狀物質(zhì)面筋，面筋蛋白質(zhì)的類型和含量影響著面團(tuán)的強(qiáng)度、黏彈性、延展性等指標(biāo)。其中，麥谷蛋白主要影響面團(tuán)的強(qiáng)度和彈性，醇溶蛋白主要影響面團(tuán)的黏性和延展性，這兩類蛋白質(zhì)是影響面團(tuán)性狀的主要因素[1-3]。通常認(rèn)為，小麥成熟籽粒中，蛋白質(zhì)含量占總干質(zhì)量的8%～20%[4]。其中，面筋蛋白質(zhì)占小麥總蛋白質(zhì)的80%～85%[5]。

小麥的加工品質(zhì)與籽粒中貯藏蛋白的總含量直接相關(guān)。一般情況下，總蛋白質(zhì)含量增加，面筋蛋白質(zhì)含量也相應(yīng)增加，并導(dǎo)致面團(tuán)強(qiáng)度增強(qiáng)、面包體積增大。但實(shí)際生產(chǎn)中也存在蛋白質(zhì)含量較低但面團(tuán)強(qiáng)度較高的小麥品種，表明面粉質(zhì)量形成原因比較復(fù)雜，不僅受籽粒貯藏蛋白質(zhì)含量影響，還受蛋白質(zhì)成分等因素影響[6]。面筋蛋白質(zhì)的主要成分是麥谷蛋白和醇溶蛋白，其中，麥谷蛋白按分子質(zhì)量大小又可分成高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基（High molecular weight glutenin subunits，HMWGS）、低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基（Low molecular weight glutenin subunits，LMW-GS）兩類。通常認(rèn)為，HMW-GS 約占小麥貯藏蛋白的10%，可通過(guò)分子間或分子內(nèi)二硫鍵作用形成面筋骨架，決定著面團(tuán)的強(qiáng)度和彈性[5-7]。ZHANG 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HMW-GS 對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度有正向效應(yīng)；CHEN 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，1Bx7或1By9基因缺失導(dǎo)致面團(tuán)強(qiáng)度變?nèi)?；ALTPETER 等[10]通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法證明了超表達(dá)1Dy10亞基基因可增加面筋蛋白質(zhì)含量，特別是將1Dx5和1Dy10兩個(gè)亞基基因同時(shí)表達(dá)時(shí)，面筋蛋白質(zhì)含量可提高至原來(lái)的3 倍以上[10]。另外，HMW-GS 之間的組合方式被認(rèn)為決定著小麥70%的優(yōu)良加工品質(zhì)性狀[11-12]。然而，在育種過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)，即使HMW-GS 組合完全一致，小麥品種之間的面粉質(zhì)量也存在較大差異，暗示HMW-GS 組合可能只是影響面粉質(zhì)量的因素之一。為明確可能存在的其他影響面粉品質(zhì)的蛋白質(zhì)，以具有一定親緣關(guān)系且HMW-GS組合完全一致而面團(tuán)強(qiáng)度不同的2 個(gè)小麥品種為試驗(yàn)材料，在籽粒貯藏蛋白積累速度較穩(wěn)定的灌漿中期（前期蛋白質(zhì)表達(dá)量較低，而后期表達(dá)的蛋白質(zhì)多為種子防御和抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)）[13-16]，對(duì)籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，比較貯藏蛋白基因的表達(dá)差異，探討HMW-GS 組合相同情況下面粉質(zhì)量差異的可能原因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為鄭麥119 和鄭麥158，2 個(gè)品種由鄭麥366 與不同品種雜交后選育而成。其中，鄭麥119 親本組合為濟(jì)麥1 號(hào)×鄭麥366，鄭麥158 親本組合為[（Bigeaz-250/96）×周麥16]×鄭麥366。試驗(yàn)于2019—2020 年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地（新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣，113°42′4″E、35°0′17″N）進(jìn)行。成熟期，收獲成熟籽粒，用BUHLER實(shí)驗(yàn)?zāi)ツシ郏瑴y(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

分別于開花后14、21、28 d 取小麥穗中部?jī)蓚?cè)籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。RNA 提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因組比對(duì)、轉(zhuǎn)錄本組裝、FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）定 量 及 GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析工作均由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司完成。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，基因表達(dá)量差異倍數(shù)＞2 倍且達(dá)到0.05顯著水平定義為差異表達(dá)基因。

1.3 面粉品質(zhì)參數(shù)分析

用瑞典Perten 公司的2200 型面筋儀（Glutomatic）按GB/T 14608—93 測(cè)定小麥粉濕面筋含量、面筋指數(shù)；用德國(guó)Brabender 公司的810104 型粉質(zhì)儀（Farinograph）按GB/T 14614—93 測(cè)定面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間等。

1.4 面粉蛋白質(zhì)提取和SDS-PAGE電泳

面粉醇溶蛋白和麥谷蛋白按照文獻(xiàn)[17]優(yōu)化的方法進(jìn)行提取，然后進(jìn)行SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，12%分離膠、4%濃縮膠）電泳。采用考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色。

1.5 硫及巰基含量測(cè)定

硫含量檢測(cè)：稱量10 mg 面粉，加入200 μL 濃硝酸在95 ℃下消化30 min，然后在115 ℃下消化90 min，冷卻至室溫后用超純水定容至1 mL。采用液相離子色譜（IC-2001，TOSOH，Japan）測(cè)定硫元素含量，陰離子標(biāo)準(zhǔn)液來(lái)自Wako Pure Chemicals（Japan），詳細(xì)操作參照文獻(xiàn)[18]。自由巰基、總巰基含量測(cè)定及二硫鍵含量計(jì)算參考WANG 等[19]的方法。

1.6 半胱氨酸和自由巰基含量預(yù)測(cè)

利用DiANNA1.1 Web 服務(wù)器（http://clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/）在線預(yù)測(cè)差異表達(dá)基因編碼蛋白質(zhì)的半胱氨酸和自由巰基含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)小麥品種的面粉質(zhì)量參數(shù)分析

從2 個(gè)小麥品種的面粉質(zhì)量參數(shù)（表1）可以看出，鄭麥158 的粗蛋白含量、濕面筋含量分別顯著、極顯著低于鄭麥119，而形成時(shí)間、面筋指數(shù)、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間均顯著或極顯著高于鄭麥119，其中面筋指數(shù)、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間是面團(tuán)強(qiáng)度代表性參數(shù)，表明鄭麥158籽粒中含有對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度貢獻(xiàn)較大的貯藏蛋白類型；而鄭麥119的粗蛋白含量雖高，但對(duì)應(yīng)的面團(tuán)強(qiáng)度參數(shù)面筋指數(shù)、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間較低，表明其籽粒蛋白質(zhì)中含有較多的劣質(zhì)蛋白質(zhì)類型。

表1 2個(gè)小麥品種的面粉質(zhì)量參數(shù)Tab.1 Flour quality parameters of two wheat cultivars

2.2 2個(gè)小麥品種的面筋蛋白質(zhì)電泳分析

從等量面粉蛋白質(zhì)中抽提出麥谷蛋白、醇溶蛋白，等量體積點(diǎn)樣后的電泳結(jié)果見圖1。從1 圖可以看出，2 個(gè)小麥品種的HMW-GS 組合完全一致，說(shuō)明HMW-GS 組合不是導(dǎo)致這2 個(gè)品種面粉質(zhì)量差異的主要原因；在LMW-GS 條帶組成方面，鄭麥158 與鄭麥119 條帶亮度和位置略有差異；對(duì)于醇溶蛋白，鄭麥158 條帶類型較少且部分蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度也稍低。

圖1 2個(gè)小麥品種的麥谷蛋白和醇溶蛋白電泳分析Fig.1 SDS-PAGE of glutenin and gliadin from two wheat cultivars

2.3 2個(gè)小麥品種差異表達(dá)貯藏蛋白基因分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在開花后14、21、28 d，2 個(gè)小麥品種籽粒中HMW-GS基因表達(dá)量均無(wú)顯著差異，這與蛋白質(zhì)電泳結(jié)果相似，從基因表達(dá)方面證明了HMW-GS僅是影響面團(tuán)強(qiáng)度的原因之一，并不是導(dǎo)致這2 個(gè)品種品質(zhì)差異的主要原因；但LMW-GS 基因表達(dá)量也無(wú)顯著差異，這與蛋白質(zhì)電泳結(jié)果明顯不符，推測(cè)可能是因?yàn)椴糠诸愌帑溬A藏蛋白與麥谷蛋白的溶解特性相似，提取的麥谷蛋白中含有類燕麥貯藏蛋白。相比鄭麥119，鄭麥158 籽粒發(fā)育的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)中僅有5 個(gè)貯藏蛋白基因（3 個(gè)類燕麥貯藏蛋白基因和2 個(gè)醇溶蛋白基因）表達(dá)量顯著上調(diào)（表2），暗示部分類燕麥貯藏蛋白和醇溶蛋白可能對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度有一定作用；共有23個(gè)貯藏蛋白基因表達(dá)量顯著下調(diào)，特別是開花后28 d 時(shí)所有差異表達(dá)基因均顯著下調(diào)表達(dá)。所有顯著下調(diào)表達(dá)的基因中，數(shù)量最多的是醇溶蛋白基因（16 個(gè)），其次是類燕麥貯藏蛋白基因（5個(gè)）和球蛋白基因（2個(gè)），這與一般認(rèn)為的醇溶蛋白對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度具有負(fù)向效應(yīng)的觀點(diǎn)一致[20-22]。從差異表達(dá)基因總數(shù)看，鄭麥158中下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量明顯高于上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量，這也從基因表達(dá)層面揭示了鄭麥158粗蛋白含量較低的原因。

從差異表達(dá)基因的染色體分布來(lái)看（表2），A組染色體上有12 個(gè)，D 組染色體上有5 個(gè)，B 組染色體上有3 個(gè)，不明位點(diǎn)基因有8 個(gè)。表明A 組染色體上基因編碼的貯藏蛋白對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度的影響最大，D組次之，B組最小。一個(gè)比較有意思的現(xiàn)象是，類燕麥貯藏蛋白基因主要定位于A、D 組染色體上，B 組染色體上未發(fā)現(xiàn)編碼類燕麥貯藏蛋白的基因。據(jù)前人研究推測(cè)，普通六倍體小麥的四倍體祖先中曾發(fā)生過(guò)4AL/7BS 易位或近著絲粒倒位情況，原來(lái)應(yīng)該位于7B 染色體短臂上的燕麥蛋白編碼位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了4A 染色體長(zhǎng)臂上[23]，導(dǎo)致4A 染色體的長(zhǎng)、短臂上都存在類燕麥貯藏蛋白基因，而B 組染色體上無(wú)類燕麥貯藏蛋白基因，這也可能是A、D、B染色體組和面團(tuán)強(qiáng)度的相關(guān)性依次遞減的一個(gè)原因。

表2 不同發(fā)育時(shí)期2個(gè)小麥品種籽粒中差異表達(dá)貯藏蛋白基因Tab.2 Differentially expressed storage protein genes in grains of two wheat cultivars at differential development stages

續(xù)表2 不同發(fā)育時(shí)期2個(gè)小麥品種籽粒中差異表達(dá)貯藏蛋白基因Tab.2（Continued） Differentially expressed storage protein genes in grains of two wheat cultivars at differential development stages

2.4 2個(gè)小麥品種面粉硫及巰基含量分析

許多研究結(jié)果都表明，面粉蛋白質(zhì)中的自由巰基和二硫鍵對(duì)面團(tuán)結(jié)構(gòu)及面團(tuán)穩(wěn)定性有重要影響[24-26]。為分析低蛋白質(zhì)含量、高面團(tuán)強(qiáng)度品種鄭麥158 的面粉蛋白質(zhì)是否含有較多的自由巰基，對(duì)2個(gè)小麥品種面粉的硫和巰基含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果（表3）表明，雖然鄭麥158 面粉的總硫含量較低，但其自由巰基含量、總巰基含量和二硫鍵含量均顯著或極顯著高于鄭麥119，表明鄭麥158 貯藏蛋白中的半胱氨酸殘基含量較高，且分子內(nèi)二硫鍵比例較低。

表3 2個(gè)小麥品種面粉硫及巰基含量Tab.3 Sulfur and sulfhydryl contents in flour of two wheat cultivars

2.5 2個(gè)小麥品種籽粒中差異表達(dá)貯藏蛋白的半胱氨酸和自由巰基含量分析

為深入比較差異表達(dá)貯藏蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)中自由巰基含量，對(duì)開花后14、21、28 d 鄭麥158籽粒中的5個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因中的3個(gè)（另外2個(gè)在不同時(shí)間點(diǎn)下調(diào)表達(dá)）和顯著下調(diào)基因中的9個(gè)貯藏蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的半胱氨酸和自由巰基含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果（表4）表明，鄭麥158 中顯著上調(diào)表達(dá)貯藏蛋白基因編碼的貯藏蛋白的平均半胱氨酸殘基含量、自由巰基含量均高于顯著下調(diào)表達(dá)基因編碼的貯藏蛋白，暗示高半胱氨酸含量、高自由巰基含量與高面團(tuán)強(qiáng)度相關(guān)，這與表3結(jié)果一致。

表4 2個(gè)小麥品種籽粒中差異表達(dá)貯藏蛋白基因編碼蛋白質(zhì)的半胱氨酸和自由巰基含量Tab.4 Cysteine and free sulfhydryl contents in proteins encoded by differentially expressed storage protein genes of two wheat cultivars grains with differential dough strength traits 個(gè)

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，HMW-GS 組合并不是決定面團(tuán)強(qiáng)度的唯一因素，醇溶蛋白和類燕麥貯藏蛋白的含量、類型差異是引起2 個(gè)供試小麥品種面團(tuán)強(qiáng)度差異的原因。醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成分之一，占總貯藏蛋白的40%～50%[27]。通常認(rèn)為，醇溶蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵形式結(jié)合到面筋中，主要影響面團(tuán)的黏性和延展性，對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度具有負(fù)向效應(yīng)。本研究結(jié)果也表明，在高面團(tuán)強(qiáng)度品種鄭麥158中，絕大多數(shù)醇溶蛋白基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)。但是，也有一些研究認(rèn)為，含有奇數(shù)半胱氨酸殘基的醇溶蛋白中，至少會(huì)存在一個(gè)自由巰基能夠形成分子間二硫鍵；而含有偶數(shù)半胱氨酸殘基的醇溶蛋白中，也并非全部半胱氨酸殘基都形成了分子內(nèi)二硫鍵，未形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基也可以通過(guò)分子間二硫鍵與別的面粉蛋白質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而影響面團(tuán)強(qiáng)度[28-32]。本研究發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)在鄭麥158 中高表達(dá)的α-醇溶蛋白、α/β-醇溶蛋白與面團(tuán)強(qiáng)度是否相關(guān)需要在今后的研究中進(jìn)一步確認(rèn)。類燕麥貯藏蛋白基因是除醇溶蛋白基因外，第二大類表達(dá)量有顯著差異的貯藏蛋白基因。類燕麥貯藏蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與燕麥胚乳蛋白相似的一類富含半胱氨酸的貯藏蛋白，也被視為非典型面筋蛋白質(zhì)組分（Atypical gluten components），包括a、b 2 個(gè)大類，且進(jìn)一步又可分為若干小類[33-35]。目前，類燕麥貯藏蛋白與面粉品質(zhì)的相關(guān)研究還不多[36-38]，但已有的研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似，都表明類燕麥貯藏蛋白對(duì)面粉強(qiáng)度有促進(jìn)作用。例如：WANG 等[36]曾將中國(guó)春中的類燕麥b 貯藏蛋白基因在鄭麥9023中超表達(dá)，明顯提高了轉(zhuǎn)基因材料的面團(tuán)強(qiáng)度；但有意思的是，在這個(gè)類燕麥貯藏蛋白中增加1 個(gè)半胱氨酸突變后，面團(tuán)強(qiáng)度和彈性下降，這是因?yàn)樾略黾拥膸€基與原有的一個(gè)自由巰基形成了分子內(nèi)二硫鍵，說(shuō)明相對(duì)于總巰基含量的增加，類燕麥貯藏蛋白中的高自由巰基含量是其影響面團(tuán)強(qiáng)度的根本原因。MA 等[37-38]研究也發(fā)現(xiàn)，類燕麥b 貯藏蛋白具有改善面團(tuán)強(qiáng)度的潛力。

在揉面過(guò)程中，不同面粉蛋白質(zhì)分子的自由巰基相互結(jié)合成二硫鍵，形成的面筋骨架決定著面團(tuán)的結(jié)構(gòu)和特性[5，26，35，39]。小麥貯藏蛋白的自由巰基含量是決定面團(tuán)流變學(xué)特性及烘焙質(zhì)量的關(guān)鍵因素[40-41]。本研究結(jié)果表明，高面團(tuán)強(qiáng)度的小麥品種鄭麥158中，自由巰基含量、總巰基含量和二硫鍵含量均高于面團(tuán)強(qiáng)度較低的鄭麥119；鄭麥158 高表達(dá)的類燕麥貯藏蛋白中含有較多的半胱氨酸殘基和自由巰基。因此，進(jìn)一步探索小麥籽粒蛋白質(zhì)中的高半胱氨酸和高自由巰基含量形成原因，對(duì)于闡釋小麥面粉質(zhì)量形成機(jī)制、完善優(yōu)質(zhì)小麥育種技術(shù)具有重要意義。