金屬基3D打印支架的構建與功能化研究進展*

蔡興博 董艷 王斌 張必歡 張悅 陸聲 徐永清*

1 金屬基3D打印支架概述

骨是一種復雜的不均勻多孔生物組織，起到支撐器官、肌肉和其他身體組織的關鍵作用。骨組織的孔隙率和纖維方向是由其具體的生物功能決定的。此外，骨的不同成分（骨小梁或皮質(zhì)）在個體年齡、性別、解剖位置間的差異性，增大了生物制造的難度[1]。功能化支架可以增強、恢復或替換丟失/缺陷的受損組織微環(huán)境中的完整細胞功能。因此，機械刺激、良好的生物降解率和骨誘導的營養(yǎng)支持成為優(yōu)化植入物設計的3 個關鍵因素[2]。近年來，3D打印技術可制造出適合骨整合的復雜幾何形狀及微結構，是具備優(yōu)良應用前景的醫(yī)療器械制造技術[3]。

傳統(tǒng)制造屬于減材制造，受模具限制，難以達到精細化制造，如骨小梁結構。相對于傳統(tǒng)制造，3D打印技術具有如下優(yōu)點：①屬于增材制造，通過文件導向實體，無須實體開模與制造工廠生產(chǎn)線，就能實現(xiàn)任何設計，大大提高了制造效率；②更加精細化的制造，可打印出血管、骨小梁、肝臟、心臟等器官；③個性化制造，解決個體差異問題，如手術導板、口腔烤瓷牙、骨腫瘤術后或嚴重創(chuàng)傷后的肢體重建；④將傳統(tǒng)制造業(yè)的生產(chǎn)力密集轉變成腦力密集，打印文件具有行業(yè)統(tǒng)一標準，構建文件時更加集思廣益；⑤形象立體，幫助醫(yī)生更全面客觀地了解病情。

與非金屬支架相比，金屬基3D打印支架具有較高的強度、良好的韌性、性能穩(wěn)定、可靠性高、延展性好、較強的抗疲勞彎曲、優(yōu)異的加工性、可制成復雜結構等其他醫(yī)用材料不可替代的性能。相對于常規(guī)制造金屬支架，金屬基3D打印支架具有如下優(yōu)點：①個性化定制，形態(tài)上任意設計，能達到骨缺損的精準匹配，結構與材料屬性更接近人體骨組織；②具有骨整合效果，加速金屬—骨界面與宿主骨整合的速度[4]。但也有如下缺點：①金屬支架的表面修飾工藝相對較少，功能化的手段不豐富；②金屬支架加工成本高，加工周期較長，制造時容錯率較低。

2 金屬基3D打印支架的構建和功能化方法

金屬基3D打印支架可以通過改變自身的拓撲結構和表面修飾，獲得不同的功能。改變自身的拓撲結構，主要通過改變支架材料成分、設置不同的打印參數(shù)、改變晶胞結構來實現(xiàn)；在獲得理想的拓撲結構之后，可以對支架進行表面修飾（浸泡技術、微弧氧化、納米材料修飾等）進一步獲得不同功能。

2.1 改變支架的拓撲結構

支架材料成分及打印參數(shù)是決定其機械性能和生物功能的關鍵。Lei等[5]通過設置不同的3D打印參數(shù)，如3D印刷激光功率、掃描間隔和切片厚度層，控制多孔鈦合金（Ti-6Al-4V）支架的微觀拓撲結構，發(fā)現(xiàn)支架的定制化可以調(diào)控細胞行為和生物學特性。金屬基3D打印支架構建方法不僅可以通過改變打印參數(shù)來控制支架內(nèi)部結構，還可以通過金屬與陶瓷粉末的混合來實現(xiàn)。Yi 等[6]將直徑約為25 μm的羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）粉末和直徑為15 ～53 μm 的Ti-6Al-4V 粉末混合調(diào)制，制備Ti-6Al-4V/HA 復合多孔支架，證明通過不同材料的混合可以實現(xiàn)精確控制支架的機械性能和生物功能。該研究團隊還發(fā)現(xiàn)電化學沉積時間的長短會影響3D 打印Ti-6Al-4V 支架表面羥基磷灰石涂層的形態(tài)和黏附MC3T3-E1 細胞的功能。設置不同的打印參數(shù)和摻入非金屬粉末是控制金屬支架理化特性的基礎方式。

晶胞是構成3D打印金屬支架的最基本的幾何單元，改變晶胞結構的形狀、孔隙率和孔徑可以使支架達到不同的力學強度與作用。支架的孔隙率和孔徑對細胞增殖、分化、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分泌和新生組織形成起重要作用，均勻的孔隙有利于細胞滲透、骨形成和血管生成[7]。Yang 等[8]設計了仿鉆-60°、仿鉆-90°、仿鉆-120°、正四面體和正六面體5種不同的鈦合金支架形狀，每種結構形狀都含3種孔徑（400 μm、600 μm和800 μm）；發(fā)現(xiàn)當孔徑增大時，每種結構的強度都會降低。研究發(fā)現(xiàn)，在3D打印中，單元配置和參數(shù)對三周期最小表面單元的機械和滲透性能有重大影響[9]。也有學者通過仿生學制造了模擬小梁結構的鈦合金單元細胞，通過改變細胞的支撐尺寸和縮放細胞整體，獲得了5 種不同孔徑和孔隙率的模擬小梁結構的單元細胞，發(fā)現(xiàn)結構孔隙率越大，剛度越小，承載能力越差[10]。因此，需要在統(tǒng)籌兼顧金屬支架的孔隙形態(tài)和大小的基礎上，尋找最優(yōu)化的支架晶胞結構，使其達到既能保證力學強度，又能促進成骨的效果。復雜拓撲結構的特點可以被用作人體植入物或組織工程的支架。這些多孔結構可以為細胞的附著和增殖提供大量的空間。3D打印晶胞結構目前主要包括正六面體、球體、模擬骨小梁三維體、鉆石體、陀螺體，具有150 ～500 μm多孔的金屬支架都特別有利于骨長入[11]。目前尚無最優(yōu)化的特定孔隙率與晶胞結構，也是多孔金屬支架領域仍在探索的問題。

2.2 對支架進行表面修飾

在確定理想的拓撲結構之后，可以通過浸泡技術、微弧氧化、納米材料修飾等對支架進行表面修飾，以獲得更好的生物相容性與誘導成骨特性。

浸泡技術是將支架浸入在具有生物活性化合物液體中，使支架表面獲得生物活性化合物涂層。Tsai 等[12]使用簡單的浸泡技術將硅酸鎂鈣（Mg-CS）和殼聚糖（CH）化合物附著到Ti-6Al-4V支架上，即Mg-CS/CH涂層的Ti-6Al-4V支架；實驗表現(xiàn)出該涂層可以創(chuàng)造一種有利的、誘導性的微環(huán)境，且在兔子臨界尺寸骨缺損模型上得到驗證。浸泡技術具有成本低、容易制備等優(yōu)點，但是載藥量有限，載藥后藥物緩釋時長有限，如前期釋放快、濃度高，后期釋放緩慢、濃度低。

微弧氧化（micro arc oxidation，MAO）也稱為陽極火花沉積或等離子體電解氧化，是通過在支架表面形成生物活性的TiO2層來提高網(wǎng)狀結構的生物活性的技術[13]。Zhang 等[14]在MAO 多孔Ti-6Al-4V 支架中加載萬古霉素，該支架顯示出較高的負載能力和持續(xù)的萬古霉素釋放動力學，證明了這種MAO多孔Ti-6Al-4V支架可以用于治療復雜的骨感染。微弧氧化技術不僅可用于提高鈦的骨整合性，還可以對鎂、銀、銅、鈣、鋅、硅、磷等材料進行表面涂層與修飾。雖然微弧氧化技術具有穩(wěn)定性好、成本低、無毒、制備簡單等優(yōu)點，但是微弧氧化瞬間放電特性難以控制，給不同結構和大小的孔隙修飾帶來巨大挑戰(zhàn)[15]。

納米材料修飾是指用物理、化學方法改變支架納米微粒表面的結構和狀態(tài)，實現(xiàn)人們對納米微粒表面的控制。部分研究表明，將金屬支架進行納米材料修飾，可以獲得更好的生物相容性與誘導成骨特性。納米級咪唑啉分子篩骨架-8 （nano porous zeolitic imidazolate framework，nanoZIF-8）是金屬有機骨架的一個亞類，Zhong 等[16]通過擠壓3D 打印技術將nanoZIF-8 加入到由聚己內(nèi)酯和二水磷酸二鈣組成的復合支架中；體外研究表明，與未摻入nanoZIF-8的支架相比，該支架與骨髓間充質(zhì)干細胞具有更好的生物相容性，顯著上調(diào)成骨相關基因和蛋白的表達，促進細胞外基質(zhì)礦化。也有團隊發(fā)現(xiàn)，通過多巴胺輔助將納米銀封裝在鈦合金支架表面，能夠使金屬鈦合金支架獲得抗菌能力[17]。納米材料修飾具有更好的穩(wěn)定性，容易獲得單分子層表面修飾，在極大保留原本納米材料結構特征的同時，實現(xiàn)其支架表面的功能化，獲得微納尺度上不同的功能界面。但是，由于納米顆粒的形貌、尺寸較難控制，生物體或生物分子的介入使得產(chǎn)物回收和純化的難度較大，大規(guī)模制造納米顆粒的均一性較難得到保證[18]。

3 金屬基3D打印支架的功能

通過上述改變拓撲結構和表面修飾后，金屬支架可被賦予抗菌、載藥與藥物控釋、誘導成骨、骨缺損重建等生物功能，在骨組織工程領域已經(jīng)得到廣泛應用。

3.1 抗菌

3D打印支架裝置添加長期穩(wěn)定緩釋的生物活性金屬離子，如銀離子、銅離子[19]、鋰離子[20]、鍶離子和鎂離子等可以自然地阻礙微生物的生長和細菌生物膜的植入物附著，從而不需要使用專門的抗感染藥物，且金屬離子在支架降解過程中緩慢釋放，可以發(fā)揮促進軟骨細胞增殖或血管生成等作用。Qing等[21]用激光熔融法制備了高孔不銹鋼元件，并采用原位水熱結晶法制備了銀摻雜沸石涂層，該支架對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。Jia等[17]通過物理交聯(lián)絲纖維蛋白多層膜封裝納米銀，在鈦合金支架上構建了原位水熱生長的微/納米結構鈦酸鹽層，即多層絲蛋白/納米銀生物功能化涂層/鈦合金支架；該銀固定支架不僅減少了細菌在表面的黏附，還能有效地殺死游離細菌，并且抗菌性能夠保持6周。不僅銀離子具有抗菌作用，金剛石修飾的支架也具有一定的抗菌性能。Rifai等[22]通過在選擇性激光熔化鈦上覆蓋納米金剛石涂層，培養(yǎng)3 d后明顯抑制金黃色葡萄球菌的定植。除了負載金屬離子，將多孔金屬支架負載抗菌藥物同樣能夠達到抗菌作用。目前，金屬支架抗菌的效果主要是通過將另一種抗菌物質(zhì)（銀、抗菌藥物等）在支架表面或內(nèi)部進行交聯(lián)，達到抗菌目的，如何達到良好的交聯(lián)，同時又能保證長效抗菌，是亟待攻克的重點與難點。

3.2 載藥與藥物控釋

金屬基3D打印支架的多孔結構可負載一定量的藥物，針對不同的疾病，可裝載相應的藥物進行治療，如慢性骨髓炎、骨腫瘤、骨質(zhì)疏松等[23]。支架能夠搭載藥物首先需要具有高比表面積和大孔容的特點。而介孔材料的結構特征是有序的大孔體系，孔徑大小在2 ～50 nm 之間，非常適合進行載藥；包括沸石、碳分子篩、多孔金屬氧化物、有機和無機多孔雜化和柱狀材料、硅包合物和包合物水合物[24]。此外，藥物－3D打印金屬基支架裝置組合系統(tǒng)（應用金屬藥物裝載等方式對3D打印裝置進行表面修飾）可以在不影響支架機械性能的情況下裝載抗生素，如多西環(huán)素、萬古霉素，在骨科多種疾病中發(fā)揮抗感染、誘導成骨的雙重生物作用[25]。對于慢性骨髓炎，也有研究團隊將萬古霉素負載至MAO 的3D 打印多孔Ti-6Al-4V 支架上，通過高效液相色譜證實，該支架具有高負載能力和持久的萬古霉素釋放動力學，且可抑制兔的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌骨感染[14]。在臨床骨肉瘤的治療中，術后腫瘤的復發(fā)和化療耐藥性提出了開發(fā)局部功能化支架的迫切需求：選擇性地殺死殘留腫瘤細胞，同時為有效填補腫瘤切除引起的骨缺損提供支架[26]。Dang等[27]通過將支架浸泡在不同濃度的氮化鈦（titanium nitride，TiN）和阿霉素（doxorubicin，DOX）溶液中，在支架表面連續(xù)包覆TiN微粒子和DOX；經(jīng)過局部控釋化療，在體內(nèi)外均取得了良好的治療效果。對于骨質(zhì)疏松癥，骨重建不平衡是導致種植體植入失敗的主要原因，針對此機理，Kwon等[28]開發(fā)了2,5-二羥基苯甲酸乙酯（E-2,5-DHB）結合的鈦植入物，使用聚乳酸-乙醇酸（polylactic glycolic acid，PLGA）涂層進行E-2,5-DHB的局部遞送，發(fā)現(xiàn)E-2,5-DHB 的釋放導致了骨吸收的減少和植入物周圍骨形成的增加。載藥微球是藥物與支架的中間載體，如何提高支架的載藥量及控制藥物的精準釋放是亟待解決的問題。

3.3 誘導成骨

眾所周知，若想讓支架促進成骨，則需要在支架周圍營造特定的微環(huán)境，金屬3D打印支架經(jīng)過表面涂層、摻入鎂粉、負載蛋白、細胞與生物活性物質(zhì)均可達成該目標。礦化膠原蛋白（mineralized collagen，MC）基質(zhì)具有與天然骨組織相似的成分和微觀結構，MC 基質(zhì)還可誘導骨再生和刺激血管新生，可通過緩慢的替代過程被降解。Ma等[29]將3D 打印的多孔鈦合金（porous titanium，PT）支架浸泡在含有膠原和羥基磷灰石（HA）前體的礦化液中，在支架上形成仿生MC 基質(zhì)，是一種兼具類骨機械性能和骨誘導能力的新支架（MC/PT）；該團隊發(fā)現(xiàn)，MC/PT 支架可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨細胞分化；并在兔橈骨缺損模型中，MC/PT支架顯著改善“骨—植入物”一體化，通過誘導血管生成和成骨，成功修復骨缺損，該支架可用于精確修復不規(guī)則的大型承重骨缺損。也有團隊設計了一種獨特的可注射生物活性水凝膠，由海藻酸鹽、明膠和納米晶羥基磷灰石組成，能夠滲透到多孔結構的Ti-6Al-4V支架中，通過細胞活性檢測、細胞黏附和細胞骨架蛋白表達及堿性磷酸酶檢測，驗證了Ti-6Al-4V 支架/水凝膠系統(tǒng)具有細胞相容性與誘導成骨能力[30]。

鎂（Mg）是天然骨的重要組成部分，具有良好的骨誘導活性和生物活性。有研究表明，鎂在體外和體內(nèi)抑制破骨細胞早期分化并抑制骨吸收[31]。Lai等[32]對傳統(tǒng)的多孔鈦合金支架添加鎂粉，發(fā)現(xiàn)該支架具有更好的成骨和血管生成能力，且植入后進行0 ～12周的生物安全性評估發(fā)現(xiàn)該支架未引起血清Mg 離子濃度增加。也有研究團隊利用聚多巴胺的表面黏附能力，將Mg摻雜到3D打印鉭金屬支架的表面；通過大鼠股骨髁骨缺損模型觀察，該支架可顯著促進血管化骨形成和骨結合[33]。除了鎂離子，功能化支架通過釋放銀離子、鋰離子、鍶離子和鎂離子等，也能發(fā)揮刺激刺激軟骨、軟骨細胞增殖或血管生成等作用。

金屬基支架表面負載蛋白與生物活性物質(zhì)，也是促進支架周圍成骨的方法。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉化生長因子-β 家族，具有良好的骨誘導性，被認為有可能促進骨的生成[34]。Zhang 等[35]先將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白加載到Ti-6Al-4V支架的空腔中，成功地改善了Ti-6Al-4V支架的骨整合能力，實現(xiàn)了羊頸椎缺損模型中種植體術后更早、更穩(wěn)定的固定。研究表明，在多孔Ti-6Al-4V支架上負載雪旺細胞衍生的外泌體，可以促進BMSCs的遷移、增殖和分化[36]。相關蛋白與生物活性物質(zhì)能夠創(chuàng)造有利于成骨的微環(huán)境，但是活性物質(zhì)的篩選具有探索性，其意義大于金屬支架本身。

3.4 骨缺損重建

3D打印技術因個性設計、快速成型等特點，可以克服患者的骨缺損不規(guī)則情況和局部解剖形態(tài)變異等問題，定制個性化的骨缺損模型，實現(xiàn)精準治療。金屬支架材料目前主要應用在腫瘤切除術后重建，包括骨盆、骶骨、脊柱、肩關節(jié)周圍、四肢長骨骨干及踝關節(jié)、肘關節(jié)、腕關節(jié)周圍的骨腫瘤切除重建；其中在骶骨、脊柱、骨盆的腫瘤切除術后的骨缺損重建中應用相對成熟[4]。吳家昌等[37]通過Mimics軟件三維重建腫瘤及周圍解剖關系，個體化設計腰椎和頸椎的金屬人工椎體，分別對2 例患者完成頸椎和腰椎椎體重建，術后長期隨訪顯示人工椎體與周圍椎體匹配良好，頸腰椎活動度好。也有研究團隊設計了3D打印的鈦合金人工椎體對脊柱腫瘤（T11-L1）切除術后進行重建，多孔鈦合金人工椎體的孔和網(wǎng)的直徑分別為800 μm和550 μm，平均孔隙率為50%～80%，患者隨訪2年，恢復良好，無腫瘤復發(fā)，無并發(fā)癥[38]。其次，在復雜的關節(jié)翻修案例中金屬支架也得以應用，如打印制造個體化的髖臼假體、髖臼墊塊、髖臼缺損加強環(huán)及感染后的臨時間隔器等。許康永等[39]應用個體化3D打印鈦合金臼杯重建重度骨缺損髖臼旋轉中心，術后肢體長度和髖關節(jié)功能均有顯著改善，術后6個月隨訪X線片示3D臼杯固定可靠，有較好的骨長入。雷鵬飛等[40]應用3D打印多孔金屬髖臼雙動頭重建系統(tǒng)治療17例嚴重髖臼結構性骨缺損患者，術后1個月Harris 髖關節(jié)評分顯著改善，隨訪顯示髖臼組件在影像學上均穩(wěn)定、無移位。

4 金屬支架體內(nèi)降解與生物安全性

金屬支架經(jīng)過修飾后在體內(nèi)是否會降解、降解率如何以及生物安全性都是不可忽視的問題。傳統(tǒng)不可降解金屬材料主要為鈷鉻合金、鈦合金、鉭金屬等，其優(yōu)點是物理化學性能穩(wěn)定，但是無法做到完全生物整合；可降解金屬支架可以在體內(nèi)進行生物整合，降解過程中釋放的金屬離子還具有誘導成骨的作用，但目前還處在實驗研究階段，主要包括鎂基（Mg）可降解金屬、鋅基（Zn）可降解金屬、鐵基（Fe）可降解金屬[41]。鎂合金作為一種新型可降解金屬材料，是目前的研究熱點。值得一提的是，純鎂支架在降解過程中會產(chǎn)生較多的氣體，不易被組織全部吸收，因此產(chǎn)生更少量氣體的多孔鎂合金支架，是目前應用最廣泛的可降解金屬支架。多孔鎂合金支架植入兔的股骨缺損處后36周后顯示出緩慢的降解和良好的骨結合，孔隙中觀察到良好的血管化與適度的細胞反應[42]。類似研究表明，多孔鎂支架植入兔子體內(nèi)后0 ～12周，鎂支架早期降解為鎂離子，隨后逐漸被鈣、磷等無機成分所取代，經(jīng)過生物安全評估，發(fā)現(xiàn)鎂支架沒有引起血清鎂離子濃度的增加，兔的免疫反應、肝臟和腎臟功能參數(shù)都處于正常水平[43]。研究表明，將植入鋅合金內(nèi)固定板釘于新西蘭兔皮下，6 個月后白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、血鋅、血鎂、血鈣、血銅指標與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義；肝臟、腎臟、脾臟的鋅離子含量也未發(fā)現(xiàn)異常[44]。

5 總結與展望

雖然3D打印金屬支架的基礎研究是近期的研究熱點，創(chuàng)新成果也層出不窮，但是與成果轉化與臨床應用還有一定的距離。目前3D打印金屬支架的臨床適用范圍：①骨腫瘤切除術后重建，包括骨盆、骶骨、脊柱、肩關節(jié)周圍、四肢長骨骨干及踝關節(jié)、肘關節(jié)、腕關節(jié)周圍的骨腫瘤切除重建；其中在骶骨、脊柱、骨盆的腫瘤切除術后的骨缺損重建中應用相對成熟。②個性化定制關節(jié)假體初次置換與假體翻修，如打印制造個體化的髖臼假體、髖臼墊塊、髖臼缺損加強環(huán)及感染后的臨時間隔器。③各種原因導致的創(chuàng)傷及感染性骨缺損重建。

通過基礎實驗的驗證與臨床探索，可見將金屬3D打印支架功能化具有如下優(yōu)勢：①匹配度高，同時具備抗菌功能，降低感染風險；②治療骨缺損時能更快誘導成骨，避免取自體骨造成二次損傷；③支架本身具有藥物緩釋功能，可抗骨質(zhì)疏松、預防骨腫瘤切除術后復發(fā)和治療慢性骨髓炎，提高治療效率；④支架植入體內(nèi)后，前期可提供穩(wěn)定支撐，中后期在體內(nèi)緩慢吸收，大大縮短治療周期，降低治療成本。同時也存在如下局限性：①金屬彈性模量低，容易發(fā)生應力屏蔽，造成假體周圍骨折或骨質(zhì)吸收；②材料多孔結構容易使細菌定植，造成疾病傳播和感染[45]；③3D打印機目前的分辨率低，與骨組織納米級的超微結構差距甚遠，仍需提高打印設備的分辨率來匹配人體骨組織；④人體骨組織由蛋白質(zhì)、鈣等多種物質(zhì)組成，其力學性能適應人體需求，而傳統(tǒng)3D打印多孔支架通常局限于單一材料，支架性能與骨修復需求不吻合；⑤特定形態(tài)的骨缺損定制3D打印支架的制作周期長、時效性低下。目前，金屬3D打印支架的拓撲結構如何優(yōu)化，支架表面如何進一步改性，其生物安全性問題，以及如何提高體內(nèi)降解效率都是亟待解決的問題。

綜上所述，目前金屬基3D打印支架功能化已經(jīng)在基礎研究中獲得一定成果（見表1），但尚未廣泛應用于臨床；將金屬支架與生物材料或生物活性物質(zhì)相交聯(lián)，發(fā)揮各個材料與成分的優(yōu)勢，開發(fā)出具有多種功能的生物活性支架；并且在承重條件下達到支架多功能化、生物相容性、成骨誘導性和生物力學完整性之間的平衡，是未來的研究方向。

表1 金屬基3D打印植入體系的基礎研究