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    基于高通量測(cè)序分析黔中金蕎麥內(nèi)生菌及其根際土壤微生物多樣性

    2022-12-20 02:20:06張濤周思旋唐遠(yuǎn)江陶小艷盧昱希趙宇史開志李婷楊粵黔
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:高通量菌門根際

    張濤,周思旋,唐遠(yuǎn)江,陶小艷,盧昱希,趙宇,史開志,李婷,楊粵黔

    (貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550005)

    植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織內(nèi)并不引起明顯病害癥狀的一類菌,包括真菌、細(xì)菌、放線菌和卵菌,幾乎在所有植物組織中都存在[1]。在與植物長(zhǎng)期共存中內(nèi)生菌會(huì)產(chǎn)生與宿主植物類似的生理活性次級(jí)代謝產(chǎn)物,在很大程度上豐富了人類藥用寶庫(kù)[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中,藥用植物內(nèi)生菌不僅可提高宿主自身抗性,還可用來(lái)開發(fā)動(dòng)物飼料或添加劑,或開發(fā)獸藥等[3]。目前,藥用植物內(nèi)生菌的研究主要集中在其次級(jí)代謝產(chǎn)物上,對(duì)其內(nèi)生菌的分離主要通過(guò)體外培養(yǎng)法純化得到,由于部分菌株無(wú)法在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[4,5],即使使用多種培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行分離,也無(wú)法保證寄生于植物體內(nèi)全部的內(nèi)生菌都能被分離出來(lái)。高通量測(cè)序技術(shù)為全面分析植物組織中微生物多樣性提供了便利,可準(zhǔn)確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和比例,已廣泛應(yīng)用于微生物多樣性及群落分析等研究[6]。

    黔中金蕎麥(Fagopyrum dibotrysQian Zhong)是貴州省畜牧獸醫(yī)研究所以貴州黔中地區(qū)野生金蕎麥為原始材料馴化而成的牧草新品種[7],是一種高蛋白牧草,具有產(chǎn)量高、適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)[8,9]。同時(shí),也是一種價(jià)值高的中草藥,含苷類、萜類以及黃酮類等多種化學(xué)成分,具有清熱解毒、活血化瘀、健脾利濕等功效。目前,黔中金蕎麥以藥飼兼用、綠色無(wú)污染的優(yōu)質(zhì)飼草資源被廣泛應(yīng)用在仔豬和肉雞等畜禽飼料中作為減抗替抗飼料添加制品[10,11]。本研究以黔中金蕎麥為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其內(nèi)生菌16S rDNA V3-V4 和ITS1 區(qū)擴(kuò)增系列進(jìn)行分析,揭示黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物的組成和豐度,為進(jìn)一步對(duì)黔中金蕎麥資源的可持續(xù)利用及其內(nèi)生菌優(yōu)質(zhì)菌株開發(fā)提供可靠菌種來(lái)源。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    于2021年7月分別采集貴州省黔西市(27°4′0″N,105°49′4 E,海拔1 330 m)、貴州省貴陽(yáng)市龍洞堡(26°31′49″N,106°47′26″E,海拔1 100 m)、花溪區(qū)麥坪鎮(zhèn)(26°25′49″N, 106°20′26″E,海拔1 100 m)3 個(gè)地點(diǎn)的新鮮健康黔中金蕎麥樣本各4 株,所有植株均為整株采挖,采集對(duì)應(yīng)植株根際土壤,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,24 h 內(nèi)進(jìn)行處理。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 樣本表面消毒 將不同地區(qū)新鮮健康的黔中金蕎麥沖洗干凈并晾干,根、莖剪成0.5~1.0 cm 的小段,葉片剪成0.5 cm × 0.5 cm 小方塊。組織塊表面消毒:0.1%吐溫表面活化3~5 min,無(wú)菌水沖洗3 次;75%乙醇浸泡3 min,無(wú)菌水沖洗3次,用無(wú)菌濾紙吸干表面水分;再用70%乙醇+3% H2O2混合液消毒,根莖5~7 min,葉1~2 min,無(wú)菌水沖洗3 次,無(wú)菌濾紙吸干,置于50 mL 無(wú)菌離心管中,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA 進(jìn)行檢測(cè),取適量于離心管中,無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL。利用16S rRNA V3-V4 區(qū)引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG- 3′)、 806R (5′ - GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系:2×Phusion master mix 15 μL,引物(2 μmol/L)各1.5 μL,DNA 模板10 μL,ddH2O 2 μL;擴(kuò)增程序:98℃1 min;98℃10 s,50℃30 s,72℃30 s,共30 個(gè)循環(huán);72℃10 min。利用ITS1-1F 區(qū)引物ITS1-1F-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、 ITS1-1F-R ( 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系:5×FastpfuBuffer 4 μL,引物(5 μmol/L)各0.8 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,DNA 聚合酶0.4 μL,DNA 模板1 μL,ddH2O 補(bǔ)加至20 μL;擴(kuò)增程序:95℃3 min;95℃30 s,55℃30 s,72℃45 s,共30 個(gè)循環(huán);72℃10 min。采用TruSeq?DNA PCRFree Sample Preparation Kit 構(gòu)建文庫(kù),經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后,使用NovaSeq 6000 上機(jī)測(cè)序。高通量測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

    1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析 將測(cè)試得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分、拼接、過(guò)濾及校正后得到優(yōu)化序列。再經(jīng)去除嵌合體序列,得到最終的有效數(shù)據(jù)。

    利用UPARSE 對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為分類操作單元( operational taxonomic units,OTUs),選取出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs 代表序列,采用Mothur 方法與SILVA138 中SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析。基于OTUs 聚類結(jié)果,利用Qiime 軟件進(jìn)行樣本復(fù)雜度分析(alpha diversity),計(jì)算Observed species、Chao 1、Shannon、Simpson 及ACE 指數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物OTUs分析

    經(jīng)Illumina NovaSeq 測(cè)序,內(nèi)生細(xì)菌按照97%相似性進(jìn)行聚類注釋得到OTUs 1 675 條;內(nèi)生真菌注釋得到OTUs 2 045 條。各樣品序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。莖葉、根及根際土壤間細(xì)菌共有OTUs為87 個(gè),特有OTUs 分別為12、38 個(gè)和1 213 個(gè);莖葉、根及根際土壤中真菌共有OTUs 為233 個(gè),特有OTUs 分別為358、141 個(gè)和812 個(gè)(圖1)。

    表1 各樣品序列統(tǒng)計(jì)

    圖1 細(xì)菌(左)和真菌(右)OTUs 分布韋恩圖

    2.2 Alpha 多樣性分析

    由圖2 可知,隨著測(cè)序深度的增加,所有樣本OTUs 數(shù)量先增加后逐漸趨于平緩,說(shuō)明樣本量充足,測(cè)序數(shù)據(jù)合理,能夠較好地反映黔中金蕎麥內(nèi)生菌菌群信息。Chao 1 和ACE 指數(shù)用來(lái)估計(jì)群落中生物豐富度;Simpson 和Shannon 指數(shù)用來(lái)描述物種均勻度和多樣性。由表2 可知,黔中金蕎麥莖葉內(nèi)生細(xì)菌Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)分別為117.01、130.14、0.37、1.13,均低于根部;而真菌的Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)分別為652.71、656.73、0.92、5.30,均高于根部。表明黔中金蕎麥莖葉的內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度及多樣性低于根部,真菌的豐富度及多樣性則比根部的高。根際土壤微生物的Alpha 多樣性各指數(shù)均高于黔中金蕎麥莖葉和根部,說(shuō)明土壤中微生物種類最為復(fù)雜、數(shù)量最多。根據(jù)Observed species 指數(shù)直觀觀測(cè)到的細(xì)菌物種數(shù)目為根際土壤>黔中金蕎麥根>黔中金蕎麥莖葉,真菌物種數(shù)目為根際土壤>黔中金蕎麥莖葉>黔中金蕎麥根。

    圖2 樣本中細(xì)菌(左)和真菌(右)稀釋曲線圖

    表2 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物的Alpha 多樣性指數(shù)

    2.3 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成

    由表3 可知,黔中金蕎麥莖葉和根中內(nèi)生細(xì)菌群落在門水平上主要為藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes),其在莖葉中的相對(duì)豐度分別為75.23%、14.07%、5.35%、4.94%,在根中的相對(duì)豐度分別為63. 83%、34.01%、0.64%、0.30%。根際土壤中主要有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,相對(duì)豐度分別為36.12%、13.52%、1.41%。真菌群落門水平要包括子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota),在莖葉中的相對(duì)豐度分別為67.45% 和23.07%,在根中的相對(duì)豐度分別為35.77%和33.53%,根際土壤中的相對(duì)豐度分別為37.10%和14.12%。

    表3 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物門水平相對(duì)豐度(%)

    由表4 可知,在屬水平上,黔中金蕎麥莖葉中內(nèi)生細(xì)菌有變形菌門未知屬(unidentified_Chloroplast)、藍(lán)藻菌門未知屬(unidentified_M(jìn)itochondria)、痤瘡丙酸桿菌(Cutibacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus),相對(duì)豐度均大于3%,其中變形菌門未知屬相對(duì)豐度最高,占所有菌屬的75.23%,被鑒定出來(lái)的優(yōu)勢(shì)屬為痤瘡丙酸桿菌(5.03%)。黔中金蕎麥根中內(nèi)生細(xì)菌有變形菌門未知屬(unidentified_Chloroplast)、藍(lán)藻菌門未知屬(unidentified_M(jìn)itochondria)和Ellin6067 屬,相對(duì)豐度分別為63.82%、32.48%和3.08%。根際土壤中內(nèi)生細(xì)菌主要有赫黃嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Dongia屬、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、Ellin6067 屬、MND1 屬,相對(duì)豐度均大于1%,其中赫黃嗜鹽囊菌屬相對(duì)豐度最高,占所有菌屬的2.96%。黔中金蕎麥莖葉真菌群落屬水平上主要為枝孢菌屬(Cladosporium)、腥擲抱菌屬(Tilletiopsis)、間座殼屬(Diaporthe)、織球殼菌(Plectosphaerella)、刺盤孢屬(Colletotrichum),其中枝孢菌屬相對(duì)豐度最高,占所有菌屬的16.10%,為莖葉中的優(yōu)勢(shì)菌屬。黔中金蕎麥根內(nèi)生真菌群落屬水平上主要有灰球菌屬(Bovista)、斜蓋傘屬(Clitopilus)、織球殼菌(Plectosphaerella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、枝鼻菌屬(Cladorrhinum),其中灰球菌屬相對(duì)豐度最高,占所有菌屬的17.67%,為根中的優(yōu)勢(shì)菌屬。根際土壤真菌群落屬水平主要有鐮孢菌屬(Fusarium)、織球殼菌(Plectosphaerella)、赤霉菌屬(Gibberella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、枝孢菌屬(Cladosporium)、斜蓋傘屬(Clitopilus),其中鐮孢菌屬相對(duì)豐度最高,占所有菌屬的21.09%,為根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

    表4 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物屬水平相對(duì)豐度(%)

    3 討論與結(jié)論

    隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)因其具有免培養(yǎng)、信息量大等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物、腸道微生物、植物內(nèi)生菌等微生物多樣性及群落分析研究中[12-14]。高通量測(cè)序技術(shù)不僅能獲得植物內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)情況,用于分析組織內(nèi)部生態(tài)水平與環(huán)境因子間的關(guān)系,還可篩選得到具有生物防治、發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)良及能進(jìn)行藥材道地性鑒別的優(yōu)質(zhì)菌株。魏玉潔等[15]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)、葉片及土壤微生物多樣性,得到包括5 個(gè)菌門、237 個(gè)真菌菌屬和8 個(gè)菌門、314 個(gè)細(xì)菌菌屬,為葡萄酒相關(guān)微生物多樣性及葡萄種植產(chǎn)區(qū)提供理論支持。靳松等[16]利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)從石蟬草組織樣本中分離得到167 個(gè)OTUs,歸屬于11 個(gè)門、26 個(gè)綱、48 個(gè)目、82 個(gè)科和104 個(gè)屬,其中以變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群(62.48% ~93.24%),同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌與石蟬草的抗炎抗腫瘤等活性有關(guān)。吳媛等[17]利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合高效液相色譜在朝鮮淫羊藿葉片中分離得到686 種內(nèi)生真菌,歸屬于451 個(gè)屬,其中橫斷孢屬、念珠菌屬、線黑粉酵母屬等菌屬與黃酮類化學(xué)成分呈正相關(guān)。宋昭昭等[18]從巨菌草分離得到1 株可用于生物防治的內(nèi)生菌菌株JK7-2,并通過(guò)Illumina MiSeq 高通量測(cè)序分析得到該菌株有349 個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因,為相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制研究提供參考依據(jù)。郭偉強(qiáng)等[19]采用宏基因測(cè)序技術(shù)分析得出野生及栽培人參內(nèi)生細(xì)菌主要有變形菌門、硬壁菌門及放線菌門,其中類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬在野生人參和栽培人參內(nèi)生細(xì)菌中均為優(yōu)勢(shì)種群。

    本研究表明黔中金蕎麥莖葉的內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度及多樣性低于根部,真菌的豐富度及多樣性則比根部高。根際土壤各指數(shù)均高于黔中金蕎麥莖葉和根部,微生物種類最為復(fù)雜、數(shù)量最多。可見植物內(nèi)生真菌具有一定的器官組織特異性。從內(nèi)生菌群落組成來(lái)看,黔中金蕎麥內(nèi)生細(xì)菌在門水平主要為藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes),真菌門水平上主要包括子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota),與其他植物內(nèi)生菌研究結(jié)果[20]一致,說(shuō)明植物內(nèi)生菌在較大分類級(jí)別單元存在相似性;根際土壤細(xì)菌、真菌群落均較黔中金蕎麥組織豐富,目前普遍認(rèn)為植物內(nèi)生菌主要來(lái)源于根際土壤,微生物由土壤進(jìn)入根,隨著蒸騰作用、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸?shù)角o葉。

    隨著對(duì)藥用植物內(nèi)生菌研究的不斷深入,挖掘與植物生長(zhǎng)代謝相關(guān)的益生菌,篩選具有抗菌活性的菌株,可為解決藥用植物資源緊缺、充分利用其藥用資源提供新思路。黔中金蕎麥內(nèi)生細(xì)菌和真菌具有一定的多樣性,下一步將對(duì)黔中金蕎麥內(nèi)生菌進(jìn)行分離培養(yǎng),對(duì)可培養(yǎng)菌株進(jìn)行多樣性分析,篩選具有生物活性的優(yōu)勢(shì)菌株,為進(jìn)一步對(duì)黔中金蕎麥內(nèi)生菌的開發(fā)利用和資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

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