蘆筍莖皮噴霧干燥工藝優(yōu)化及化學(xué)成分的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

李紫珊，衛(wèi) 瑞，李震宇

(山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030000)

蘆筍(Asparagus officinalisL.)，又名石刁柏、龍須菜，為百合科天門冬屬宿根性多年生草本植物。蘆筍鮮嫩可口，富含多種營養(yǎng)成分，如碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、硒、鋅、鐵以及礦物質(zhì)等。蘆筍具有提高免疫力、燃燒脂肪、抗疲勞、保肝解毒、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抗腫瘤等作用[1]。蘆筍在生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生老莖、皮等大量的廢棄物。研究表明，這些廢棄物同樣富含黃酮和皂苷類成分，具有資源利用價值[2-3]。

噴霧干燥是近年發(fā)展起來的一種新型高效干燥工藝，可將溶液、乳液或懸浮液干燥為固體粉末或顆粒[4-5]。噴霧干燥具有制備工藝簡單、營養(yǎng)成分保存好、溶解性好、快速、可重現(xiàn)、可連續(xù)、操作方便等諸多優(yōu)勢，在醫(yī)藥、食品、化工、等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且所得產(chǎn)品易于貯藏和運輸[6-8]。

本研究采用超高效液相-四級桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)快速分析鑒定蘆筍莖皮噴霧粉中的化學(xué)成分，通過化合物的精確分子量、MS/MS裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)中報道的數(shù)據(jù)等信息對噴霧粉中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合了UHPLC和QTOF-MS/MS的優(yōu)點，具有分辨率高、重復(fù)性好、分析時間短、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方中化學(xué)成分的鑒定[9]。

本研究以綠蘆筍生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的下腳料蘆筍莖皮為原料，采用噴霧干燥技術(shù)將其制備成噴霧干燥粉，利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)快速分析鑒定噴霧粉中的化學(xué)成分，并對其溶化性、潤濕性、含水量、溶解度等理化指標(biāo)進(jìn)行測定，旨在將其開發(fā)成一種新型功能食品原料，提高蘆筍廢棄資源利用率，為蘆筍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和創(chuàng)新提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

蘆筍莖皮購買于山西省永濟(jì)市耀輝綠色蘆筍種植專業(yè)合作社；純水、甲醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純；乙腈（質(zhì)譜級，美國Thermo公司），超純水由中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心制備。Milli-Q純凈水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；HH-S4恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；ZNHW電熱套（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；PX822ZH天平（奧豪司儀器有限公司）；LC-4012離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SP-1500試驗型噴霧干燥機（上海順儀實驗設(shè)備有限公司）；超聲波清洗器KQ5200E（昆山市超聲儀器有限公司）,ExionLCTMAD超高效液相色譜儀；QTOF 5600+四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 蘆筍莖皮→煎煮水提→真空減壓濃縮→測定可溶性固形物含量→添加輔料→調(diào)整密度→噴霧干燥→理化指標(biāo)測定、化學(xué)成分分析。

1.2.2 料液的提取 采用水煎煮的方法制備蘆筍莖皮提取液。稱取一定量的藥材，第一次加入16倍量水，煎煮提取2h，過濾。在濾渣中加入10倍量水，煎煮提取2 h，過濾。將兩次的濾液合并，濃縮，備用。

1.2.3 噴霧干燥單因素試驗 對影響提取液噴霧干燥效果的主要因素，如進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)樣流量以及料液密度進(jìn)行考察。

（1）進(jìn)風(fēng)溫度。固定進(jìn)樣流量為450 mL·h-1、料液密度為1.07 g·cm-3，考察進(jìn)風(fēng)溫度（100、130、160℃）對噴霧粉質(zhì)量的影響。

（2）進(jìn)樣流量。固定進(jìn)風(fēng)溫度為130℃、料液密度為1.07 g·cm-3，考察進(jìn)樣流量（350、450、550 mL·h-1）對噴霧粉質(zhì)量的影響。

（3）料液密度。固定進(jìn)風(fēng)溫度為130℃、進(jìn)樣流量為350 mL·h-1，通過添加麥芽糊精調(diào)節(jié)料液密度，并考察不同料液密度（1.05、1.07、1.09 g·cm-3）對噴霧粉質(zhì)量的影響。

1.2.4 理化指標(biāo)測定方法（1）得率。精密量取一定量提取液（mL），烘干至恒質(zhì)量（g），計算提取液中固形物的含量[10]。得率計算公式如下：

產(chǎn)品得率=噴霧干燥出粉量（g）/（料液總固形物含量+麥芽糊精量）（g）×100%

（2）含水量。采用GB5009.3—2016中的第二法（減壓干燥法）[11]，將供試品置于真空減壓干燥箱內(nèi)，設(shè)置壓力40～53 kPa，溫度（60±5）℃，烘干至前后2次質(zhì)量差不超過2 mg，通過烘干前后的數(shù)值計算出含水量。

（3）溶化性。取供試品10 g，加入熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，粉末應(yīng)全部溶化或輕微渾濁[12-13]。

（4）溶解度。在干燥至恒質(zhì)量的10 mL離心管（最小刻度0.1 mL）中加入精密稱定的供試品0.5 g，加入沸水10 mL，攪拌振蕩5 min。噴霧粉溶解后溶液微濁，3000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，在80℃將殘渣烘干至恒質(zhì)量，精密稱定，計算溶解度[14]。溶解度計算公式如下：

溶解度=溶化顆粒質(zhì)量/總顆粒質(zhì)量×100%

（5）潤濕性。選取直徑為95 mm的培養(yǎng)皿，加入50 mL蒸餾水，水溫為25℃。在培養(yǎng)皿中加入2.5 g供試品，測定噴霧粉被水完全潤濕的時間（不借助任何外力，不攪拌）[15-16]。

1.2.5 質(zhì)譜分析方法（1）樣品溶液的制備。取噴霧干燥粉5 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶解，超聲提取30～40 min，冷卻至室溫，濾液過0.22 μm微孔濾膜，4℃冰箱備用。

（2）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；洗脫梯度：0～10 min（2%B），10～20 min（15% B），20～25 min（25% B），25～30 min（40% B），30～32 min（80% B），32～35 min（95% B），35～39 min（2%B）；柱溫40℃；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積2 μL。

（3）質(zhì)譜條件。采用正負(fù)離子模式分別進(jìn)行掃描，電噴霧離子源（ESI）。離子源參數(shù)如下：噴霧電壓5500 V（正離子），-4500 V（負(fù)離子）；離子源溫度450℃；加熱氣（Gas 2）55 psi、噴霧氣（Gas 1）55 psi、氣簾氣（CUR）30 psi、去簇電壓（DP）60 V，二級碰撞能量（CE）為（40±20）eV。TOF MS一級掃描范圍為m/z 100～1500，Production scan二級掃描范圍為m/z 50～1250。

（4）化合物鑒定。查閱蘆筍相關(guān)成分研究文獻(xiàn)，通過與文獻(xiàn)中化合物的準(zhǔn)分子離子峰、碎片裂解規(guī)律進(jìn)行比對分析，在滿足質(zhì)量偏差≤5條件下，最終確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧干燥單因素條件的確定

由表1可知，當(dāng)溫度過低時，噴霧粉水分含量大，易吸潮結(jié)塊；過高時，噴霧粉粉質(zhì)較粗。當(dāng)進(jìn)樣流量較小時，粉質(zhì)細(xì)膩、色澤呈乳白色或淡黃色、粘壁量少；過大時，噴霧粉水分含量大、粉質(zhì)粗、粘壁量大、產(chǎn)率低。當(dāng)料液密度較小時，噴霧粉水分含量高，易吸潮結(jié)塊；較大時，料液太濃、固形物和輔料容易沉淀，將機器管道堵塞。綜上所述，蘆筍莖皮噴霧干燥最優(yōu)試驗條件為：流速350 mL·h-1、密度1.07 g·cm-3，溫度130℃。

表1 噴霧干燥單因素試驗結(jié)果

2.2 最優(yōu)條件下制得的噴霧粉質(zhì)量分析

按照上述最優(yōu)條件，平行制備3批蘆筍莖皮噴霧粉，并分別對其進(jìn)行外觀性狀分析和理化指標(biāo)測定，測定結(jié)果如表2所示。3批噴霧粉的得率均大于50%，得率較高；含水量低；完全潤濕時間大于20 min，潤濕性小，不易吸潮，可長期儲存；溶解后無明顯雜質(zhì)或沉淀，溶化性和溶解度較好；粉質(zhì)細(xì)膩、顏色鮮亮、滋味獨特。

表2 噴霧粉理化指標(biāo)和外觀性狀分析

2.3 基于質(zhì)譜裂解途徑的蘆筍莖皮噴霧粉成分分析

目前，對于蘆筍噴霧干燥粉的工藝研究較多，但是對噴霧粉的成分分析較少，本研究利用UHPLCQ-TOF-MS/MS技術(shù)在蘆筍莖皮噴霧粉中共鑒定出38個活性成分，見表3。

表3 蘆筍莖皮噴霧粉的化學(xué)成分鑒定

2.3.1 皂苷類 在噴霧粉中共鑒定出5個甾體皂苷類化合物，其結(jié)構(gòu)見圖1。其中以菝葜皂苷元為苷元的甾體皂苷，包括ShatavarinⅨ、Asparinin B、Asparagoside A和(25S)-5beta-spirostan-3beta-yl-O-[O-Alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-4)]-Beta-Dglucopyranoside；其他類型的甾體皂苷包括Pseudoprotoneodioscin和Aspacochioside D。研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍皂苷對結(jié)腸癌細(xì)胞[17]、人肝癌細(xì)胞[18]、肺癌細(xì)胞[19]以及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞[20]等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒活性，可使其凋亡或者抑制癌細(xì)胞生長。

圖1 甾體皂苷類化合物結(jié)構(gòu)

以ShatavarinⅨ為例說明甾體皂苷的鑒定過程。在正離子模式下，化合物1得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 903.4930[M+H]+,失去一分子葡萄糖(Glc)得到m/z 741.4403[M+H-Glc]+,繼續(xù)失去一分子Glc得到m/z 579.3875[M+H-2Glc]+，再失去一分子Glc得到m/z 417.3350[M+H-3Glc]+。通過和Hayes等[21]報道的數(shù)據(jù)相比較，推測化合物1為ShatavarinⅨ。

2.3.2 黃酮類 在噴霧粉中共鑒定出8個黃酮類化合物，其苷元結(jié)構(gòu)見圖2。以異鼠李素為苷元的黃酮醇苷3個，包括Isorhamnetion-3-O-rutinoside-7-Oglucoside、Narcissoside和Isorhamnetin；以山奈酚為苷元的黃酮醇苷2個，包括Camelliaside A和Kaempferol-3-O-rutinoside；以槲皮素為苷元的黃酮醇苷3個，包括Quercetin diglucoside、Quercitin 3-Oglucosylrutinoside和Rutin。研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍黃酮對力竭大鼠、D-半乳糖衰老小鼠等模型具有抗氧化作用[22-23]，還可清除超氧陰離子自由基以及羥自由基[24]。

圖2 黃酮類化合物苷元結(jié)構(gòu)

在正離子模式，化合物9的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 611.1602[M+H]+,失去一分子鼠李糖(Rha)得到m/z 465.1029[M+H-Rha]+，進(jìn)一步失去一分子Glc則得到其m/z 303.0498[M+H-Rha-Glc]+。該苷元可發(fā)生裂解得到m/z 147.0646,并進(jìn)一步失去一分子H2O得到m/z 129.0542。通過和對照品的保留時間以及質(zhì)譜碎片相比對和Hamdi等[25]報道的數(shù)據(jù)一致，確認(rèn)化合物9為Rutin。

2.3.3 氨基酸 在噴霧粉中共鑒定到8種氨基酸，其中人體必需氨基酸4種包括L-valine、Isoleucine、Phenylalanine和Methionine；非必需氨基酸4種包括Aspartic acid、L-Arginine、Histidine、Pipecolic acid。膳食氨基酸在維持健康方面發(fā)揮著重要作用，不僅可以調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌，還是免疫代謝物和免疫遞質(zhì)的主要來源[26-27]。

2.3.4 有機酸 在噴霧粉中共鑒定到8個天然有機酸，包括、Ferulic acid、Amber acid等。天然有機酸具有預(yù)防疾病和維護(hù)人體健康的功效[28]。例如，F(xiàn)erulic Acid是一種酚酸類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品以及化妝品等行業(yè)[29]。

2.3.5 其他類 除了皂苷、黃酮、氨基酸和有機酸這些主要功效成分外，在噴霧粉中還鑒定出其他類化合物9個。例如，有機堿類化合物Vitamin B2，一種天然維生素，可抵抗多種疾病（如敗血癥、缺血等），同時也有助于降低人類患某些癌癥的風(fēng)險[30]。Diferuoloyl glycerol是水溶性阿魏酸的甘油脂類物質(zhì)，可用作食品、化妝品、化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)的紫外吸收劑和抗氧化劑等[31]。

3 結(jié)論與討論

進(jìn)樣流量、進(jìn)樣溫度、料液密度是影響噴霧干燥的主要因素[47]，本研究著重從以上3個方面考察蘆筍莖皮提取物的實驗室噴霧干燥工藝。當(dāng)進(jìn)樣溫度過低、進(jìn)樣量過大或料液密度小、含水量大時，料液在干燥室內(nèi)難以被完全干燥，顆粒容易粘在壁上，導(dǎo)致產(chǎn)率降低；溫度過高、進(jìn)樣量過小，會使料液焦糖化、破壞料液中的活性成分、降低產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和產(chǎn)率。Jafari等[48]試驗發(fā)現(xiàn)，石榴噴霧干燥粉中的花青素含量隨著溫度的升高而降低；密度過大時，料液流動性差，固形物和輔料易沉淀，容易堵塞管道、損壞機器。當(dāng)進(jìn)樣溫度130℃、進(jìn)樣流量350 mL·h-1、料液密度1.07 g·cm-3時，蘆筍莖皮噴霧粉粉質(zhì)細(xì)膩、分散、粘壁量少、含水量低、濕度小、結(jié)塊現(xiàn)象不明顯，產(chǎn)率高。按照最優(yōu)工藝平行制備3批蘆筍莖皮噴霧粉，得率均大于50%，且最高可達(dá)61.31%，得率較高；溶化性較好，無明顯雜質(zhì)或沉淀；溶解度均大于97%，溶解度較好；潤濕性小，不易吸潮；含水量≤7.0%,符合GB/T 29602—2013《固體飲料》國家標(biāo)準(zhǔn)，可作為長期儲存的原料。

已有研究對蘆筍莖皮的噴霧干燥工藝進(jìn)行了考察，但未對其化學(xué)成分進(jìn)行全面的分析和鑒定。高分辨質(zhì)譜技術(shù)適用于中藥材和食品中復(fù)雜成分的快速解析，本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對蘆筍莖皮噴霧粉中的化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別，共鑒定出38個化合物。其中含有皂苷類化合物5個，ShatavarinⅨ是蘆筍中具有代表性的甾體皂苷，最新研究表明其可與新型冠狀病毒（COVID-19）的蛋白酶受體SARS-CoV-2 Mpro緊密結(jié)合，抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是一種潛在的天然抑制劑[49]；其他皂苷類化合物和Asparinin B、Asparagoside A等，同樣具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等作用[50-51]黃酮類化合物8個,Rutin是蘆筍中具有代表性的黃酮類化合物，Kalai等[52]發(fā)現(xiàn)Rutin可以抑制阿爾茨海默病小鼠模型中tau的聚集以及tau寡聚物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，降低促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可預(yù)防阿爾茨海默病；其他的黃酮類化合物如Narcissoside、Isorhamnetin等，對糖尿病、高血脂、冠狀病毒等也具有潛在的抑制作用[53-54]。其次，本研究還鑒定到8種氨基酸，8個有機酸、9個其他類型化合物，例如Ferulic acid，具有抗炎、抗菌、抗癌的功效，可預(yù)防疾病和維護(hù)人體健康；Vitamin B2，一種天然的維生素，可抵抗敗血癥等多種疾?。籇iferuoloyl glycerol，可作為食品、醫(yī)藥、化工行業(yè)的抗氧化劑。

近年來，我國蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)模和產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了全球第一。相應(yīng)的，其在生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的廢棄物也大量增加和積累，造成了一定的資源浪費和環(huán)境污染。通過查閱文獻(xiàn)筆者發(fā)現(xiàn)，這些蘆筍廢棄物中不僅富含脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，同樣含有豐富的黃酮、皂苷等藥用成分，具有極其可觀的利用價值。本研究制備的噴霧粉很好地保留了蘆筍中的活性成分，具有蘆筍特有風(fēng)味且營養(yǎng)豐富，可進(jìn)一步加入其他輔料制備成固體飲料、代餐粉、泡騰片、含片等復(fù)合功能食品。