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    混菌發(fā)酵對口含煙原料提質(zhì)降害研究

    2022-12-20 06:28:06李書貴
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年22期
    關(guān)鍵詞:含煙鹽溶液煙堿

    楊 靜,李書貴

    (1.貴州省煙草公司黔東南州公司,貴州凱里 556000;2.黔東南州煙草公司施秉縣分公司,貴州施秉 562000)

    煙葉中煙堿(nicotine)的含量占總植物堿含量的95%以上,是影響煙葉品質(zhì)的特征性指標(biāo)之一[1]。煙堿的含量與煙民的健康密切相關(guān),含量過高可能會對身體健康產(chǎn)生嚴重危害[2]。近年來,隨著國內(nèi)外控?zé)熜蝿莸娜找鎳谰?,口含煙成為煙草工業(yè)企業(yè)的重要研究方向之一??诤瑹煯a(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的重要指標(biāo)之一就是煙堿的釋放量[3],同時煙堿對味覺具有很重要的影響,尤其在口含煙中,游離煙堿直接透過口腔黏膜被人體吸收,刺激人腦多巴胺的產(chǎn)生,從而增加人的滿足感[4]。在煙葉中煙堿含量偏高,導(dǎo)致放入口中使用時刺激性、辛辣味較重,煙堿含量的降低有利于降低煙草原料的辛辣感,從而改善口含煙的刺激感。有學(xué)者利用煙草土壤為試驗材料,從中篩選提取一株有效降解煙堿的微生物,并且進行了鑒定、確定其最佳生長條件及其降解煙堿最大的發(fā)酵條件,其降解率能達到82%[4-7]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),微生物對煙葉化學(xué)成分和評吸品質(zhì)有一定的影響,能夠降低煙葉煙堿含量,對提高香氣量、改善香氣質(zhì)有很好的作用[2,8-11]。現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中,純種發(fā)酵占很大的比例[12]。但在長期的試驗和生產(chǎn)實踐中,人們不斷地發(fā)現(xiàn)很多重要生化過程僅靠單株微生物不能完成或只能微弱地進行,必須依靠2種或多種微生物共同培養(yǎng)來完成,即混菌培養(yǎng)或稱為混菌發(fā)酵。混菌發(fā)酵是采用2種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某發(fā)酵過程的一種新型發(fā)酵技術(shù),是純種發(fā)酵技術(shù)的新發(fā)展,也是一種不需要進行復(fù)雜的DNA體外重組卻可取得類似效果的新型發(fā)酵技術(shù)。目前很多研究表明混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)品品質(zhì)明顯強于單一菌種發(fā)酵[13-19]。該研究通過以解淀粉芽孢桿菌GUHP86、枯草芽孢桿菌B01復(fù)合菌進行口含煙煙草原料發(fā)酵試驗,通過控制菌種比、接種量、有糖鹽溶液添加量,以發(fā)酵后煙堿含量為指標(biāo),優(yōu)化發(fā)酵工藝,并對發(fā)酵后煙草原料進行感官品評,從嗅香、滿足感、口感特征、異味、口腔余香5個方面對發(fā)酵后煙草原料進行一個比較全面的評價,綜合評價混菌發(fā)酵口含煙煙草原料的煙堿含量及感官品質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料解淀粉芽孢桿菌GUHP86、枯草芽孢桿菌B01來自貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院實驗室保藏菌株??诤瑹煙煵菰线x用貴州省黔東南州煙區(qū)生產(chǎn)的云煙87上、中部葉片(B2F、C3F)。將葉片用水清洗掉表面的灰塵和雜質(zhì)后分別放入烘箱中在 40 ℃以下低溫烘干,粉碎密封保存。

    1.2 菌株培養(yǎng)種子培養(yǎng)液:胰蛋白胨 0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化鈉2.5 g、葡萄糖 0.25 g、蒸餾水400 mL,加熱溶解,均等裝入小錐形瓶各20 mL,于121 ℃、20 min滅菌,取出冷卻。冷卻后,將培養(yǎng)好的菌株(在無菌操作臺中)分別加至小錐形瓶中,每瓶一株菌(液體保藏菌接2 mL),蓋好,寫上標(biāo)簽,放入搖床中37 ℃培養(yǎng)12 h,用于第2天接菌進入煙葉。

    1.3 煙葉發(fā)酵工藝

    1.3.1制備種子液。準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g,加入1 000 mL容量瓶定容至刻度,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,待冷卻后接入菌種,180 r/min 37 ℃進行培養(yǎng)18 h,最終得到植物乳桿菌SQ-4種子液活菌濃度為9.52 CFU/mL、解淀粉芽孢桿菌GUHP86種子液活菌濃度為9.58 CFU/mL、枯草芽孢桿菌B01種子液活菌濃度為9.56 CFU/mL。

    1.3.2煙草原料發(fā)酵工藝。圖1為煙葉的發(fā)酵工藝。用水將煙葉表面的灰塵和雜質(zhì)清洗后放入烘箱中在 40 ℃以下低溫烘干,打磨成粉,稱取20 g裝入14 cm×10 cm的無菌密封袋,滅菌備用。在無菌操作臺中將培養(yǎng)好的菌株分別放入均等的大離心管中,于8 000 r/min離心10 min。離心以后,傾倒出上清液,保留菌體,用已滅菌的生理鹽水20 mL加至此離心管中,搖勻。吸取適量離心管內(nèi)菌液于裝有已滅菌的煙粉塑封袋內(nèi),適量加入鹽溶液,充分混勻,貼上標(biāo)簽放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)酵,每天需進行換氣。取樣時將煙粉在120 ℃滅菌20 min后冷凍保藏[20]。

    圖1 煙葉的發(fā)酵工藝

    1.4 單因素試驗

    1.4.1不同菌種比接種發(fā)酵對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區(qū)生產(chǎn)的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料,分別稱取發(fā)酵煙草原料20 g,按1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1比例添加混合菌種6 mL,空白試驗不添加微生物添加4 mL有糖鹽溶液,每組混菌試驗添加有糖鹽溶液4 mL,在37 ℃下發(fā)酵15 d,將發(fā)酵后煙粉在 115 ℃下滅菌 20 min,測定其煙堿含量,并對其進行感官評價。

    1.4.2不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區(qū)生產(chǎn)的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料,分別稱取發(fā)酵煙草原料20 g,按解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種,接菌量按3、4、5、6、7 mL添加,空白試驗不添加菌種添加4 mL有糖鹽溶液,每組混菌試驗添加有糖鹽溶液4 mL,在37 ℃下發(fā)酵15 d,將發(fā)酵后煙粉在115 ℃下滅菌20 min,測定其煙堿含量,并對其進行感官評價。

    1.4.3有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。選用黔東南地區(qū)生產(chǎn)的云煙87中部葉C3F為口含煙煙草原材料,分別稱取發(fā)酵煙草原料20 g,按3、4、5、6、7 mL添加有糖鹽溶液,添加解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1混合菌種6 mL,空白試驗不添加有糖鹽溶液加入蒸餾水,在37 ℃下發(fā)酵15 d,將發(fā)酵后煙粉在115 ℃下滅菌 20 min,測定其煙堿含量,并對其進行感官評價。

    1.4.4煙堿含量的測定方法。參照煙草行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)YC/T 468—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(硫氰酸鉀)法》[21]進行煙堿含量測定。

    1.5 正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取菌種比、接種量和有糖溶液添加量作為因素進行L9(34)正交試驗,優(yōu)化口含煙混菌發(fā)酵工藝。

    1.6 數(shù)據(jù)分析與處理試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,n=3。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗

    2.1.1不同菌種比接種發(fā)酵對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。由圖2可知,按照“1.4.1”的方法及條件進行試驗,添加菌種能夠明顯降低口含煙煙草原料中煙堿含量,當(dāng)解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發(fā)酵時,煙堿含量最低(1.52%),煙堿降解率最高(45.91%),相對單菌發(fā)酵有所提高。同時當(dāng)解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發(fā)酵時,其感官評分最高,為92分,其綜合口感和香氣比較和諧(表1)。

    表1 不同菌種比條件下感官評定結(jié)果

    圖2 不同菌種比對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

    2.1.2不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。試驗結(jié)果表明(圖3和表2),接菌量對發(fā)酵后煙堿的降解率、原料的感官評價是有影響的,隨著接菌量的增加,發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量逐漸降低,當(dāng)接菌量為6 mL時,發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量最低(1.50%),煙堿降解率最高(47.37%),相對單菌發(fā)酵有所提高;當(dāng)接菌量超過6 mL 時煙堿降解率降低。同時從表2可以看出,當(dāng)接種量為6 mL時,其感官評分最高,為93分,嗅香、口腔余味提升。

    表2 不同接菌量條件下感官評定結(jié)果

    圖3 不同接菌量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

    2.1.3有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響。從圖4可以看出,隨著有糖鹽溶液添加量的增加,發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量逐漸降低,當(dāng)有糖鹽溶液添加量為4 mL時,發(fā)酵后口含煙煙草原料中煙堿含量最低(1.46%),煙堿降解率最高(45.52%),相對單菌發(fā)酵有所提高;當(dāng)有糖鹽溶液添加量高于4 mL時煙堿降解率降低。當(dāng)有糖鹽溶液添加量為4 mL時,其感官評分最高,為93分(表3)。

    表3 不同有糖鹽溶液添加量條件下感官評定結(jié)果

    圖4 有糖鹽溶液添加量對口含煙煙草原料中煙堿含量的影響

    2.2 正交試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取對口含煙煙草原料煙堿含量影響較大的 3 個因素,分別為菌種比、接菌量、有糖鹽溶液添加量,采用 L9(34)正交進行試驗設(shè)計。正交試驗因素與水平見表4,正交試驗結(jié)果見表5。

    表4 正交試驗因素和水平

    從表5可以看出,各因素對口含煙煙草原料混菌發(fā)酵降煙堿的影響程度不同,對煙草原料發(fā)酵感官評價影響也不同,從R值可以得出其影響順序均為A>B>C,即菌種比的影響最大,其次是接菌量,有糖鹽溶液添加量影響最小。從煙堿含量及感官評分得出最佳提取條件為A3B3C1,而根據(jù)k值分析得出的最佳提取條件組合為A3B2C1,因此要對這2個組合進行3組平行對比試驗,試驗結(jié)果如表6所示。通過驗證試驗對比,組合A3B2C1比組合A3B3C1發(fā)酵口含煙煙草原料降煙堿效果更好,感官評分更高,所以可以確定最優(yōu)組合為A3B2C1,當(dāng)解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1添加混合菌種發(fā)酵,接菌量為6 mL、有糖鹽溶液添加量為4 mL 時,發(fā)酵口含煙煙草原料降煙堿效果更好,感官評價更優(yōu)。

    表5 正交試驗結(jié)果

    表6 驗證試驗對比

    3 小結(jié)

    煙堿是煙草最重要的化學(xué)成分之一,煙堿含量過高會影響口含煙產(chǎn)品的品質(zhì),該研究采用解淀粉芽孢桿菌GUHP86與枯草芽孢桿菌B01對口含煙煙草原料進行混菌發(fā)酵,以發(fā)酵后煙堿含量和感官評分為指標(biāo),通過監(jiān)測發(fā)酵過程中煙草原料中煙堿含量變化和感官評分確定混菌發(fā)酵的條件。結(jié)果表明,經(jīng)過混菌發(fā)酵后,口含煙煙草原料中煙堿含量在不同的菌種比、接菌量、有糖鹽溶液添加量條件下均發(fā)生了明顯的變化,在解淀粉芽孢桿菌GUHP86∶枯草芽孢桿菌B01為3∶1、接種量為 6 mL、有糖鹽溶液添加量為4 mL 的條件下,37 ℃ 發(fā)酵15 d,口含煙煙草原料中煙堿含量達到最低值(1.53%),發(fā)酵后口含煙煙草原料感官評分達到最高(94分)。這可能是發(fā)酵產(chǎn)生了一定活力的酶如蛋白酶,將煙葉中蛋白質(zhì)分解為一些具有特殊風(fēng)味的氨基酸參與微生物代謝,因此在感官上,加菌發(fā)酵煙葉較自然發(fā)酵煙葉整體更為協(xié)調(diào),香味復(fù)雜濃烈,勁頭足,刺激性小,滋味更豐富[22]。通過試驗發(fā)現(xiàn),混菌發(fā)酵可以提高煙草中煙堿的降解率,降低煙葉有害物質(zhì),提升煙葉質(zhì)量,提高食用舒適性,使煙葉整體香味更為諧調(diào),為煙葉的混菌發(fā)酵技術(shù)開發(fā)提供一定的理論和技術(shù)參考。

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