泡菜母水細(xì)菌群落組成及潛在基因功能分析

李政強(qiáng)，鄧巍，安睿，張發(fā)，李靜超，楊曉燕，3，4*

（1.大理大學(xué) 東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；2.云南省高校洱海流域保護(hù)與可持續(xù)發(fā)展研究重點實驗室，云南 大理 671003；3.三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊，云南 大理 671003；4.中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003）

泡菜是一種具有獨特風(fēng)味和口感的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在中國已有三千多年的歷史[1]。泡菜的營養(yǎng)價值極高，含有大量的維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維和其他功能成分，在滿足人體營養(yǎng)需求的同時，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血清膽固醇、抗氧化和減肥等功能[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，泡菜微生物來源于添加的物質(zhì)及缸體本身，其中的微生物群落組成不僅影響泡菜的品質(zhì)，也會影響泡菜風(fēng)味[5]。母水發(fā)酵能較好地保證泡菜的原汁原味。

母水發(fā)酵是我國私房泡菜的主要制作方法之一，也是四川泡菜特色工藝[1]。將泡菜添加到母水中可增強(qiáng)泡菜中微生物群落穩(wěn)定性并保持其原有風(fēng)味，這是母水發(fā)酵制作泡菜的優(yōu)勢，母水中的微生物種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物數(shù)量巨大，且在整個儲存過程中并不是一成不變的[6]。泡菜母水的發(fā)酵環(huán)境是由微生物主導(dǎo)形成的高鹽、高酸、缺氧的極端生境，這樣的生境抑制了對這些環(huán)境因子敏感的微生物的生長繁殖，使得一些在pH值中性、氧濃度正常、無較多重金屬離子的正常生境中生物量極小的微生物得以大量生長，成為泡菜母水中的優(yōu)勢物種，造就了泡菜獨特的微生物群落[7-8]。隨著人類對微生物了解的加深，人類對功能微生物的需求日益增加，因此人類開始探索各種生境中的微生物多樣性，以期獲得更多更高效的功能菌株，其中以特殊生境造就的特殊微生物群落及其所含特殊的功能基因最受關(guān)注。目前從特殊生境中已經(jīng)分離獲得了很多功能性菌株和特殊代謝物，如：Saiki等[9]從溫泉中發(fā)現(xiàn)的廣泛用于分子生物學(xué)研究的TaqDNA聚合酶；Connor等[10]從海洋中獲得的有顯著抗腫瘤活性的化合物；丁壯等[11]從極地中獲得的有抑菌活性的代謝產(chǎn)物等。

細(xì)菌是泡菜母水中微生物群落的主要類群，主導(dǎo)著泡菜的發(fā)酵過程和貨架期[12]，因此，解析泡菜母水中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化及功能基因是泡菜資源開發(fā)的關(guān)鍵。鑒于目前可培養(yǎng)的微生物僅占所有微生物的1.5%[13]，而泡菜母水細(xì)菌群落組成復(fù)雜，要全面了解泡菜中真實的微生物群落構(gòu)成及可能的功能基因，需持續(xù)進(jìn)行樣品采集并借助現(xiàn)代分子生物學(xué)方法進(jìn)行分析。擴(kuò)增子測序變體（amplicon sequence variants，ASVs）是高通量測序技術(shù)的一種，利用二代測序平臺，對16s功能基因等特定區(qū)段PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，突破傳統(tǒng)微生物不可培養(yǎng)的缺點，獲得環(huán)境樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系以及微生物與環(huán)境相關(guān)性等信息。研究發(fā)現(xiàn)泡菜母水發(fā)酵后貯藏以第1天、第8天和第30天為節(jié)點，其中的細(xì)菌群落構(gòu)成發(fā)生明顯變化，包括母水的環(huán)境條件也發(fā)生階段性的變化[14]。因此，本研究采用擴(kuò)增子測序技術(shù)，探究泡菜母水在25℃的環(huán)境下，密閉儲存1、8、30 d的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，了解泡菜母水中的細(xì)菌多樣性和功能基因多樣性，為微生物學(xué)的功能物種篩選和功能基因挖掘提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蘿卜（Raphanus sativus）、卷心菜（Brassica oleracea L）、辣椒（Capsicum frutescens）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）、花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）、冰糖：市售；DNA抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；2%瓊脂糖：西班牙biowest公司；DNA聚合酶：中國北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA精確擴(kuò)增試劑盒：美國Axygen公司；DNA文庫制備試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國 ABI公司；Illumina Miseq測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜母水制備

將5kg白蘿卜、5kg卷心菜、0.5kg辣椒、0.5kg生姜、0.5 kg花椒、1.5 kg冰糖、20 kg冷開水（含有 6%NaCl）裝入陶制泡菜壇中。18℃～22℃自然發(fā)酵7 d后，用無菌紗布濾去泡菜，混勻后獲得20 kg泡菜母水，室溫靜置24 h。將泡菜母水分裝至1 000 mL玻璃瓶中密封，25℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1天、第8天及第30天進(jìn)行取樣，每次取3個平行，分別標(biāo)記為PC1.1、PC1.2、PC1.3、PC8.1、PC8.2、PC8.3、PC30.1、PC30.2、PC30.3。

1.3.2 樣品處理與采集

取樣時，將每個培養(yǎng)瓶混勻后用無菌注射器吸取50 mL泡菜母水于離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀置于-80℃冰箱儲存。

1.3.3 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提。DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量[15]；用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對16s的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3min，27個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后 72 ℃延伸 10 min[16]。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

采用QIIME2[17]進(jìn)行序列的質(zhì)控，修剪，去噪，拼接，以及去除嵌合體；使用GREENGENES[18]數(shù)據(jù)庫得到物種的分類信息表；用QIIME2 core-diversity[19]插件計算多樣性矩陣、特征序列水平alpha多樣性指數(shù)，包括Richness指數(shù)、Shannon指數(shù)、Gini-Simpson指數(shù)。應(yīng)用PICRUSt[20]軟件進(jìn)行基因功能的預(yù)測。稀釋曲線的繪制、群落物種豐度堆積圖均使用R語言繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序文庫評價

對樣品采用Illumina NovaSeq高通量測序后共獲得627 866條有效序列，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、去噪、去除嵌合體、抽平后，獲得405 990條優(yōu)化序列。泡菜母水樣品稀釋曲線見圖1。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

由圖1可知，泡菜母水樣品PC1.1、PC1.2、PC1.3、PC8.1、PC8.2、PC8.3、PC30.1、PC30.2、PC30.3 的稀釋曲線較為平坦，更深的測序幾乎不會檢出更多新的物種，測序結(jié)果較為合理可用于后續(xù)分析。

2.2 細(xì)菌alpha多樣性

泡菜母水中細(xì)菌alpha多樣性見表1。

表1 泡菜母水中細(xì)菌Alpha多樣性Table 1 Alpha-diversity of bacterial in Paocai brine

Alpha多樣性反映樣品內(nèi)部微生物群落的物種豐富度。由表1可知，Richness指數(shù)第8天最高，第30天次之、第1天最低；Shannon指數(shù)、Gini-Simpson指數(shù)均為第8天最高，第1天次之，第30天最低。這說明在25℃的環(huán)境下，密閉儲存1、8、30 d的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，發(fā)生持續(xù)性的變化，其中第8天的細(xì)菌多樣性最高且組成最復(fù)雜。

2.3 細(xì)菌門和屬水平群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化

不同發(fā)酵時間泡菜母水中細(xì)菌群落在門和屬水平上的組成見圖2。

由圖2可知，經(jīng)過有效序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接和優(yōu)化，總共獲得細(xì)菌20門、33綱、79目、92科、320屬、388種。在門水平上，泡菜母水中細(xì)菌群落以厚壁菌門（Firmicutes，47.55%～52.96%）和變形菌門（Proteobacteria，45.68%～52.17%）為優(yōu)勢門，且在不同時間點的含量無明顯差異；其余菌門占比較小（總含量<1%）。

圖2 不同發(fā)酵時間泡菜母水中細(xì)菌群落在門和屬水平上的組成Fig.2 Composition of bacterial community at phylum and genus level in Paocai brine at different fermentation time

在屬水平上的菌群組成：腸桿菌屬（Enterobacter）在第1天、第8天、第30天的含量分別為23.77%～25.23%、19.80%～23.63%、14.06%～18.29%；乳球菌屬（Lactococcus）含量分別為 10.39%～13.64%、18.30%～20.86%、2.14%～2.61%；明串珠菌屬（Leuconostoc）含量分別為22.53%～25.85%、9.67%～16.51%、4.22%～5.42%；未分類的腸桿菌屬（Unspecified_Enterobacteriaceae）含量分別為 13.20%～13.83%、10.47%～12.45%、8.75%～9.95%；未分類的乳桿菌屬（Unspecified_Lactobacillales）含量分別為7.25%～9.58%、3.79%～5.27%、2.98%～4.20%；未分類的乳酸桿菌屬（Unspecified_Lactobacillaceae）含量分別為1.14%～1.66%、3.45%～5.99%、31.52%～38.10%。隨著發(fā)酵時間的延長，泡菜母水中細(xì)菌的群落組成隨之發(fā)生改變。

不同發(fā)酵時間泡菜母水中細(xì)菌群落在屬分類水平上的組成見圖3。

圖3 不同發(fā)酵時間泡菜母水中細(xì)菌群落在屬分類水平上的組成Fig.3 Composition of bacterial community in Paocai brine of different fermentation time at genus classification level

由圖3可知，泡菜母水中細(xì)菌群落的優(yōu)勢屬（在體系中含量>1%）為腸桿菌屬（Enterobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、未分類的腸桿菌屬（Unspecified_Enterobacteriaceae）、乳球菌屬（Lactococcus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、未分類的乳桿菌屬（Unspecified_Lactobacillales）、未分類的乳桿菌屬（Unspecified_Lactobacillaceae）、拉恩氏菌屬（Rahnella）。但在不同儲存時間的含量存在差異，雖然不同儲存時長的泡菜母水中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，但優(yōu)勢細(xì)菌屬的組成卻是基本一致的，這與朱琳等[21]和李恒等[1]的研究結(jié)果相似。說明盡管不同地區(qū)的泡菜發(fā)酵方式不同、原料不同，但泡菜母水中的細(xì)菌優(yōu)勢群落構(gòu)成卻是相似的，主導(dǎo)泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢細(xì)菌也相似。目前對泡菜中細(xì)菌群落組成的研究報道不少，對泡菜資源的開發(fā)也有較多研究[22-23]，但關(guān)注點主要在優(yōu)勢菌群的變化及其功能上，而優(yōu)勢菌群的變化往往會掩蓋稀有類群的動態(tài)變化[24]。本研究發(fā)現(xiàn)稀有屬細(xì)菌（在體系中含量<0.01%）在不同儲存時間的變化劇烈，無統(tǒng)一規(guī)律，其在泡菜母水群落變化中可能發(fā)揮著非常重要的功能，這或許意味著低豐度群落在維持生態(tài)系統(tǒng)健康方面具有重要作用和意義[25-26]。

未分類的細(xì)菌占比見圖4。

圖4 未分類出的細(xì)菌占比Fig.4 Proportion of bacteria unspecified

由圖4可知，有1門89屬細(xì)菌未分類。其中，第1天未能分類的有1門2屬，在其所處水平上所占比例分別為門水平0.02%、屬水平15.37%；第8天未能分類的有1門89屬，在其所處水平上占比為門水平0.07%、屬水平20.96%；第30天未能分類的有1門23屬，在其所處水平上占比為門水平0.17%、屬水平43.56%。說明隨著發(fā)酵時間的延長，對泡菜母水中細(xì)菌的認(rèn)知度越低，潛藏的未開發(fā)資源也越多，其中未開發(fā)資源更多地集中于長時間發(fā)酵的泡菜母水中。

2.4 細(xì)菌基因功能預(yù)測

微生物資源開發(fā)的關(guān)注點多在于功能菌株的挖掘，目前關(guān)注較多的是溫泉等特殊生境[27]中分布的微生物。泡菜體系中存在極其多樣且特殊的微生物類群[28]，其中必然蘊藏了獨特的功能基因，通過高通量測序可以實現(xiàn)免培養(yǎng)下的功能基因預(yù)測。本研究發(fā)現(xiàn)泡菜母水中細(xì)菌的功能基因類型在L1級（即在PICRUSt分析時選擇L1級別即對基因序列對應(yīng)功能大類的分析）可初步劃分為6種類型，結(jié)果見圖5。

圖5 L1級水平上不同發(fā)酵時間泡菜母水中細(xì)菌群落功能預(yù)測Fig.5 Prediction of bacterial community function in Paocai brine of different fermentation time at L1 level

由圖5可知，新陳代謝相關(guān)的基因含量最多（70.43%～70.74%），其次是與遺傳信息（9.39%～9.97%）、細(xì)胞轉(zhuǎn)化（7.00%～7.87%）、致病（5.97%～6.27%）、環(huán)境信息處理（3.75%～4.27%）和有機(jī)系統(tǒng)（2.09%～2.24%）等相關(guān)的基因。

在L3級（即在PICRUSt分析時選擇L3級別即基因序列對應(yīng)具體功能的分析）進(jìn)行功能預(yù)測，共分析出364種不同的功能基因，且不同發(fā)酵時間的泡菜母水中所蘊含的細(xì)菌基因功能類型均相同，僅含量出現(xiàn)波動，結(jié)果見圖6。

圖6 L3級水平上不同發(fā)酵時間泡菜母水中細(xì)菌群落功能預(yù)測（TOP 40）Fig.6 Prediction of bacterial community function in Paocai brine of different fermentation time at L3 Level（TOP 40）

由圖6可知，泡菜母水所蘊含的基因中除已知的有關(guān)促消化、維持腸道菌群平衡等功能基因外，還有與新陳代謝相關(guān)的基因，其次為與遺傳信息的處理、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、致病等相關(guān)的基因。致病基因主要與癌癥、食物毒素相關(guān)，蔡炯等[29]也發(fā)現(xiàn)正常發(fā)酵泡菜中都含有一定量的致病微生物，雖然致病基因在體系中存在不一定就能引起疾病，但仍然需要關(guān)注這些微生物可能引起的食品安全問題。同時，泡菜母水中細(xì)菌含有較多的與產(chǎn)維生素、產(chǎn)抗生素、促細(xì)胞吸收、癌癥的膽堿代謝等相關(guān)的基因。有關(guān)泡菜體系中細(xì)菌的研究不僅需要關(guān)注與人類疾病的治療、預(yù)防相關(guān)的功能基因，與此有關(guān)聯(lián)的功能菌株的開發(fā)也是非常有必要的。

3 結(jié)論

泡菜母水是一個高鹽、高酸、厭氧、寡營養(yǎng)的特殊生境，特殊生境孕育了獨特的微生物群落[30]，且會隨儲存、發(fā)酵過程的變化而發(fā)生改變[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌屬、明串珠菌屬、未分類的腸桿菌屬、乳球菌屬、檸檬酸桿菌屬、未分類的乳桿菌屬、未分類的乳酸桿菌屬、拉恩氏菌屬是泡菜母水中的優(yōu)勢菌屬。在整個泡菜母水的菌群構(gòu)成中，稀有菌屬在泡菜母水群落變化中可能發(fā)揮著非常重要的功能。未分類的細(xì)菌的占比較大，基因功能劃分與預(yù)測也說明了泡菜微生物體系中仍有較多未被開發(fā)的細(xì)菌種質(zhì)資源，在新型代謝產(chǎn)物研發(fā)、人類疾病預(yù)防、益生菌菌株開發(fā)等方面具有較大的開發(fā)潛力，是一個很好的微生物資源庫。因此，未來應(yīng)當(dāng)重視對泡菜母水中未開發(fā)的微生物資源尤其是稀有類群的研究。但即使應(yīng)用有較高分辨率的高通量測序技術(shù)，其存在的局限性仍然非常大。未來對泡菜可開發(fā)資源的探究需要結(jié)合宏基因組、宏代謝組和宏蛋白組學(xué)，進(jìn)一步探究泡菜微生物可能蘊藏的功能基因，獲取到這些基因的功能，或許就能為泡菜功能的開發(fā)提供線索。同時，對功能基因進(jìn)行開發(fā)需要結(jié)合純培養(yǎng)技術(shù)，因此，需要加強(qiáng)對泡菜微生物的分離培養(yǎng)技術(shù)研究，豐富泡菜微生物菌種資源庫及基因庫，以支持泡菜微生物的開發(fā)和應(yīng)用研究。