谷氨酸棒桿菌表達(dá)大腸桿菌來(lái)源海藻糖酶

滿(mǎn)在偉，崔慧慧，李錦，張迎陽(yáng)，張建波，張建濤*

（1.常州大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.山東恒仁工貿(mào)有限公司，山東 棗莊 277533）

海藻糖是由葡萄糖以α-1，1糖苷鍵連接而成的二糖，無(wú)還原性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠保護(hù)細(xì)胞的生物大分子，是生物體的一種應(yīng)激合成產(chǎn)物[1-2]。海藻糖酶可以水解海藻糖的α-1，1糖苷鍵，將海藻糖分解為兩分子葡萄糖[3-5]。近年來(lái)，海藻糖酶逐漸應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)。玉米乙醇發(fā)酵中，海藻糖是發(fā)酵殘?zhí)堑闹匾煞?。在玉米乙醇發(fā)酵工業(yè)中，利用含有海藻糖酶活性的葡糖淀粉酶套件可水解發(fā)酵殘?zhí)侵械暮Ｔ逄?，進(jìn)而提高乙醇產(chǎn)率和利潤(rùn)率[6]。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸過(guò)程中，菌體會(huì)合成海藻糖并積累于發(fā)酵液中，導(dǎo)致發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛绕?。在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中添加海藻糖酶，可大幅降低發(fā)酵液中海藻糖濃度并提高谷氨酸得率，還可減小海藻糖對(duì)下游谷氨酸提取的影響[7-10]。另外，海藻糖酶也可用于海藻糖的快速檢測(cè)。利用海藻糖酶將樣品中海藻糖特異性分解成葡萄糖，對(duì)分解而來(lái)的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)即可得出樣品中海藻糖的含量[11]。

隨著海藻糖酶的應(yīng)用逐漸增加，微生物生產(chǎn)海藻糖酶相關(guān)研究逐漸受到重視。通過(guò)菌株篩選可得產(chǎn)海藻糖酶微生物，如大黃歐文氏菌（Erwinia rhapontici）[12]、路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）[13]、分散泛菌（Pantoea dispersa）[14]、 玫瑰色微球菌（Micrococcus roseus）[15]等。通過(guò)將海藻糖酶基因在特定微生物中過(guò)量表達(dá)，也可獲得高效合成海藻糖酶重組菌株。利用大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）BL21 可過(guò)量表達(dá) E.coli str.K-12 substr.MG1655的海藻糖酶編碼基因，獲得的海藻糖酶可高效水解海藻糖[16]。利用黑曲霉HL-1表達(dá)來(lái)源于嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）和瘤胞毀絲霉（Myceliophthora sepedonium）的高活力海藻糖酶編碼基因，采用增加基因拷貝數(shù)和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方法提高產(chǎn)酶水平，純化后的海藻糖酶用于酵母乙醇發(fā)酵可提高葡萄糖乙醇轉(zhuǎn)化率[17-20]。利用畢赤酵母表達(dá)來(lái)源于嗜熱真菌的海藻糖酶編碼基因，獲得的海藻糖酶也可用于酵母乙醇發(fā)酵過(guò)程并提高乙醇轉(zhuǎn)化率[21]。

E.coli BL21中同樣存在海藻糖酶編碼基因trl，該基因與E.coli str.K-12 substr.MG1655的海藻糖酶編碼基因相似度為98.42%，基因中存在26個(gè)核苷酸差異，編碼蛋白中507位氨基酸殘基存在差異。目前，鮮有關(guān)于E.coli BL21中海藻糖酶Trl的相關(guān)研究和報(bào)道。谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum，C.glutamicum）是一種一般認(rèn)為安全的（generally recognized as safe，GRAS）菌株，營(yíng)養(yǎng)要求低，蛋白合成能力強(qiáng)，蛋白水解酶活性低。C.glutamicum廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、生物燃料等發(fā)酵生產(chǎn)[22]。近年來(lái)，將C.glutamicum作為蛋白表達(dá)宿主用于表達(dá)目標(biāo)蛋白逐漸受到重視[23-24]。

本研究將E.coli BL21來(lái)源的海藻糖酶在C.glutamicum ATCC13032中表達(dá)，對(duì)表達(dá)條件和重組海藻糖酶性質(zhì)進(jìn)行研究，為海藻糖酶相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coli BL21菌株、C.glutamicum ATCC13032菌株、C.glutamicum表達(dá)質(zhì)粒pXMJ19：常州大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

基因組提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、基因膠回收純化試劑盒、基因連接試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、核酸電泳試劑盒、蛋白電泳試劑盒、改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和 Hind III、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氯霉素：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨：安琪酵母股份有限公司。

盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g/L，根據(jù)需要加入氯霉素10 mg/L。

LB加葡萄糖（LBG）培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加葡萄糖5 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（StabS2型）：上海潤(rùn)度生物科技有限公司；離心機(jī)（1-14型）：德國(guó) Sigma公司；電轉(zhuǎn)儀（MicroPulser）：美國(guó)Bio-Rad公司；生物傳感分析儀（S-10）：深圳市西爾曼科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海藻糖酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

利用基因組提取試劑盒提取E.coli BL21基因組并冷凍保存。利用引物19-trl-Hind III F（5′-CCCAAGCTTAAAGGAGGGAAATCATGCTCAATCAGAAAATTCAAAACC-3′）和 19-trl-EcoR I R（5′-CCGGAATTCTTATGGTTCGCCGTACAAACC-3′）和PCR試劑盒以E.coli BL21基因組為模板PCR擴(kuò)增E.coli BL21海藻糖酶編碼基因trl，并利用基因膠回收純化試劑盒進(jìn)行trl基因純化。利用EcoR I和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切pXMJ19質(zhì)粒和trl基因，酶切后產(chǎn)物利用基因膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化。然后，利用基因連接試劑盒將酶切純化后的pXMJ19質(zhì)粒片段和trl基因片段進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，涂布LB氯霉素平板并于37℃培養(yǎng)12 h。挑取轉(zhuǎn)化子利用液體LB氯霉素培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)12 h，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并利用EcoR I和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確連接的質(zhì)粒命名為pXMJ19-trl質(zhì)粒。

1.3.2 表達(dá)海藻糖酶重組C.glutamicum Cgtrl構(gòu)建

利用電轉(zhuǎn)化方法將pXMJ19-trl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C.glutamicum ATCC13032菌株，構(gòu)建表達(dá)海藻糖酶重組菌株 Cgtrl。取 2 μL pXMJ19-trl質(zhì)粒加入 100 μL C.glutamicum ATCC13032感受態(tài)，1 800 V、5 ms電擊。電擊后涂布于LBG氯霉素平板，30℃培養(yǎng)。長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子菌落即為含有pXMJ19-trl質(zhì)粒的重組菌株Cgtrl。將重組菌株Cgtrl菌落劃線至LBG氯霉素平板，30℃培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)好的平板可直接用于后續(xù)試驗(yàn)或者置于冰箱冷藏保存。

1.3.3 重組菌株Cgtrl海藻糖酶誘導(dǎo)表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

重組菌株Cgtrl冷藏保存的平板重新劃線至LBG氯霉素平板進(jìn)行30℃培養(yǎng)36 h。利用接種環(huán)在培養(yǎng)好的平板上劃取滿(mǎn)環(huán)菌苔接種至10 mL LBG氯霉素液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，獲得種子液。然后，取1 mL種子液接入50 mL LBG氯霉素液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)3 h后加入0.5 mmol/L IPTG，繼續(xù)25℃、180 r/min培養(yǎng)7 h，誘導(dǎo)海藻糖酶表達(dá)。然后收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎及蛋白電泳分析。

采用改變單因子的方法對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。添加不同濃度 IPTG（0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L），25 ℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h，優(yōu)化誘導(dǎo)劑添加量。添加0.5 mmol/L IPTG 后，在不同溫度（16、19、22、25、28 ℃）下180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h，優(yōu)化誘導(dǎo)溫度。添加0.5 mmol/L IPTG后，在22℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間（7、12、17、22 h），優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間。海藻糖酶酶活力為單位體積發(fā)酵液中的酶活力（U/mL），根據(jù)相應(yīng)體積發(fā)酵液菌體稀釋或濃縮倍數(shù)折算得出。

1.3.4 海藻糖酶酶液制備

重組菌株Cgtrl海藻糖酶誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，離心（8 000×g，5 min，4℃）收集菌體。利用原培養(yǎng)液體積一半的50 mmol/L pH7.0磷酸鉀緩沖液懸浮菌體，冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎液離心（8 000×g，5 min，4℃），所得上清即為海藻糖酶酶液。

1.3.5 海藻糖酶酶活力測(cè)定

利用50 mmol/L的pH7.0磷酸鉀緩沖液配制10 g/L海藻糖溶液，30℃預(yù)熱10 min的5 mL海藻糖溶液中加入50 L海藻糖酶酶液，30℃反應(yīng)10 min后沸水浴5 min。利用生物傳感分析儀檢測(cè)反應(yīng)液中生成的葡萄糖濃度。

海藻糖酶酶活定義：每分鐘水解1 μmol海藻糖生成2 μmol的葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（1U）。海藻糖酶比酶活為每毫克蛋白中所含的酶活力。

1.3.6 重組海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)

1）底物特異性

利用50 mmol/L的pH7.0磷酸鉀緩沖液配制10 g/L海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖溶液，按照1.3.5方法測(cè)定海藻糖酶酶活力。

2）溫度對(duì)重組海藻糖酶活力的影響

海藻糖溶液分別在 30、35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴中預(yù)熱30 min，然后每5 mL預(yù)熱好的海藻糖溶液加入25 L海藻糖酶酶液，繼續(xù)在各溫度下反應(yīng)10 min。將最高酶活設(shè)置為100%。

3）重組海藻糖酶溫度穩(wěn)定性

重組海藻糖酶酶液加入10%體積的甘油，然后分別放置于-20、5、20、30、40、45 ℃溫度下，取樣按照1.3.5方法測(cè)定海藻糖酶酶活力。將初始酶活設(shè)置為100%。

4）pH值對(duì)重組海藻糖酶活力的影響

利用pH5.8～7.8的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液溶解海藻糖，配制不同pH值的10 g/L海藻糖溶液。每5 mL不同pH值的海藻糖溶液加入25 L海藻糖酶酶液，45℃反應(yīng)10 min。將最高酶活力設(shè)置為100%。

5）海藻糖水解率

利用50 mmol/L pH6.6磷酸鉀緩沖液將重組海藻糖酶酶液稀釋至8 000 U/L（45℃、pH6.6條件下酶活力）。利用50 mmol/L pH6.6磷酸鉀緩沖液配制0.25、0.5、1、2、4 g/L海藻糖溶液。取0.5 mL海藻糖溶液加入0.5 mL8000U/L的重組海藻糖酶酶液，45℃反應(yīng)5min。根據(jù)產(chǎn)生的葡萄糖濃度計(jì)算海藻糖水解率。

式中：342為海藻糖相對(duì)分子質(zhì)量，360為兩分子葡萄糖的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株Cgtrl構(gòu)建及海藻糖酶表達(dá)

圖1為pXMJ19-trl質(zhì)粒單雙酶切驗(yàn)證圖。

圖1 pXMJ19-trl質(zhì)粒酶切Fig.1 Restriction enzyme digestion of pXMJ19-trl plasmid

E.coliBL21海藻糖酶編碼基因trl長(zhǎng)度為1650bp。由圖1可以看出，雙酶切出現(xiàn)大小正確的條帶，因此pXMJ19-trl質(zhì)粒構(gòu)建成功。海藻糖酶蛋白分子量為63.7 kD，由圖2蛋白可知，在66 kD位置附近出現(xiàn)明顯加粗的蛋白條帶。酶活分析表明C.glutamicum ATCC13032細(xì)胞破碎液中無(wú)海藻糖酶活力，重組菌株Cgtrl細(xì)胞破碎液中海藻糖酶活力為10.2 U/mg蛋白。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)海藻糖酶重組菌株Cgtrl構(gòu)建成功。

圖2 重組菌株Cgtrl蛋白電泳分析Fig.2 Protein electrophoresis of recombinant strain Cgtrl

2.2 重組菌株Cgtrl海藻糖酶誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.2.1 IPTG添加量對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響

IPTG添加量對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響如圖3所示。

圖3 IPTG添加量對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響Fig.3 The effect of IPTG additive amount on trehalase expression

由圖3可知，當(dāng)IPTG添加量為0.5 mmol/L時(shí)，重組菌株Cgtrl細(xì)胞破碎液中海藻糖酶酶活力最高，達(dá)到5.7 U/mL。IPTG添加量過(guò)低則誘導(dǎo)效率低，不利于酶的表達(dá)。同時(shí)，IPTG對(duì)微生物細(xì)胞具有一定毒性，過(guò)量添加同樣不利于海藻糖酶的表達(dá)[25]。因此，最適IPTG添加量為0.5 mmol/L。

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響

誘導(dǎo)溫度對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響如圖4所示。

圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響Fig.4 The effect of induction temperature on trehalase expression

由圖4可知，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)，海藻糖酶酶活力最高，達(dá)到6.3 U/mL。溫度過(guò)低，細(xì)胞代謝減慢，不利于酶的合成。而溫度偏高，則有可能形成包涵體或者加快酶的變性失活，導(dǎo)致酶活力降低[16]。因此，誘導(dǎo)溫度選擇22℃。

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響

誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響如圖5所示。

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)海藻糖酶表達(dá)的影響Fig.5 The effect of induction time on trehalase expression

由圖5可知，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)，海藻糖酶酶活最高，達(dá)到9.1 U/mL。誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，海藻糖酶酶活力基本不再增加。這是由于重組菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，菌株合成代謝和酶的表達(dá)停止。因此，誘導(dǎo)時(shí)間選擇12 h。

2.3 重組海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 重組海藻糖酶底物特異性

重組海藻糖酶催化不同底物水解產(chǎn)生葡萄糖的研究結(jié)果如圖6所示。

圖6 重組海藻糖酶底物特異性Fig.6 The substrate specificity of recombinant trehalase

由圖6可知，相同條件下，重組海藻糖酶不能催化麥芽糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖水解產(chǎn)生葡萄糖。因此，重組海藻糖酶具有較好的底物特異性。較好的底物特異性能夠?yàn)橹亟M海藻糖酶的特殊應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，如應(yīng)用于海藻糖的檢測(cè)[11]，可避免受到其他糖類(lèi)的干擾。

2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)重組海藻糖酶活力的影響

反應(yīng)溫度對(duì)重組海藻糖酶活力的影響如圖7所示。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)重組海藻糖酶活力的影響Fig.7 The effect of temperature on recombinant trehalase activity

由圖7可知，45℃重組海藻糖酶活力最高，海藻糖酶活力隨溫度降低而逐漸降低，30℃條件下海藻糖酶活力降低約50%。反應(yīng)溫度高于45℃時(shí)，隨溫度升高海藻糖酶活力逐漸降低，70℃下海藻糖酶基本失去活力。

2.3.3 重組海藻糖酶溫度穩(wěn)定性

重組海藻糖酶溫度穩(wěn)定性如圖8和圖9所示。

圖8 高溫條件下重組海藻糖酶溫度穩(wěn)定性Fig.8 The temperature stability of recombinant trehalase under high temperature conditions

圖9 低溫條件下重組海藻糖酶溫度穩(wěn)定性Fig.9 The temperature stability of recombinant trehalase under low temperature conditions

由圖8和圖9可知，重組海藻糖酶在40℃下半衰期為1 h，在45℃下半衰期為10 min，在50℃下保存10 min后酶活降低90%。結(jié)果表明，高溫（40℃～50℃）條件下重組海藻糖酶穩(wěn)定性較差容易變性失活，這與E.coli str.K-12 substr.MG1655來(lái)源的海藻糖酶性質(zhì)相近[16]。酶液中加入10%體積的甘油后，-20℃冷凍保存90 d酶活無(wú)明顯降低，5℃冷藏保存5 d、20℃存放3 d、30℃存放32 h酶活均維持在90%以上。該結(jié)果表明，未經(jīng)純化的重組海藻糖酶低溫（-20℃～30℃）條件下穩(wěn)定性較好，可長(zhǎng)時(shí)間保存。這應(yīng)該是由于C.glutamicum蛋白水解酶活性低，有利于重組海藻糖酶長(zhǎng)時(shí)間保存[23]。

2.3.4 pH值對(duì)重組海藻糖酶活力的影響

反應(yīng)體系pH值對(duì)重組海藻糖酶活力的影響如圖10所示。

由圖10可知，重組海藻糖酶最適作用pH值為6.6。pH值小于6.6時(shí)，海藻糖酶活力隨pH值降低而逐漸降低。pH值高于6.6時(shí)，海藻糖酶活力隨pH值升高而逐漸降低。說(shuō)明偏酸性條件有利于海藻糖酶催化反應(yīng)。

圖10 pH對(duì)重組海藻糖酶活力的影響Fig.10 The effect of pH on recombinant trehalase activity

2.3.5 重組海藻糖酶海藻糖水解率

重組海藻糖酶海藻糖水解率如圖11所示。

圖11 重組海藻糖酶海藻糖水解率Fig.11 The trehalose hydrolysis ratio of recombinant trehalase

由圖11可知，重組海藻糖酶催化海藻糖水解反應(yīng)5 min后海藻糖水解率均達(dá)到96%以上。在分析重組海藻糖酶海藻糖水解率過(guò)程中，反應(yīng)體系中海藻糖濃度分別為 0.125、0.25、0.5、1、2 g/L，反應(yīng)體系中海藻糖酶活力為4 000 U/L。反應(yīng)體系中的海藻糖酶理論上每分鐘可水解 4000 μmol/L（1.37 g/L）海藻糖產(chǎn)生8 000 μmol/L（1.44 g/L）葡萄糖。該結(jié)果表明，當(dāng)海藻糖濃度在0.125 g/L～2 g/L時(shí)，重組海藻糖酶能夠在較短時(shí)間較徹底地分解反應(yīng)體系中的海藻糖。該催化特性能夠?yàn)槔弥亟M海藻糖酶快速檢測(cè)較低濃度海藻糖奠定基礎(chǔ)[11]。對(duì)于較高濃度海藻糖的檢測(cè)，可以將樣品適當(dāng)稀釋后再利用該重組海藻糖酶進(jìn)行分析測(cè)定。同時(shí)，針對(duì)乙醇和谷氨酸等發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中海藻糖積累和殘留問(wèn)題[6，10]，該重組海藻糖酶較高的海藻糖水解率有利于徹底水解生產(chǎn)過(guò)程中剩余海藻糖，在提高底物利用率和目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)率方面具有很大應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本文利用GRAS菌株C.glutamicum ATCC13032表達(dá)E.coli BL21來(lái)源海藻糖酶，對(duì)海藻糖酶表達(dá)條件和重組海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。重組海藻糖酶最適表達(dá)條件：誘導(dǎo)劑IPTG添加量為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為22℃，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。在最適表達(dá)條件下重組海藻糖酶酶活為9.1 U/mL。后期工作中，可對(duì)重組菌株培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化并采用補(bǔ)料發(fā)酵模式以進(jìn)一步提高重組海藻糖酶酶活。未經(jīng)純化的重組海藻糖酶具有較好的底物特異性，能專(zhuān)一性水解海藻糖，海藻糖水解率在96%以上，低溫條件下穩(wěn)定性較好能夠長(zhǎng)時(shí)間低溫保存，最適作用溫度為45℃，最適作用pH值為6.6。該重組海藻糖酶在海藻糖快速檢測(cè)和海藻糖降解利用方面具有良好的應(yīng)用前景。由于C.glutamicum是GRAS生物安全菌株，利用C.glutamicum ATCC13032表達(dá)獲得的重組海藻糖酶具有良好的安全性，可用于食品行業(yè)。同時(shí)，重組海藻糖酶不用經(jīng)過(guò)純化即可應(yīng)用，有利于降低酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本。