藜麥啤酒工藝優(yōu)化及其理化品質(zhì)與抗氧化活性分析

周亞麗，游新勇*，崔利華，陳建光，李曉龍，劉慧，劉江山，方曉雪

（1.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000；2.安陽工學(xué)院 機械工程學(xué)院，河南 安陽 455000）

藜麥（Chenopodiun quinoa Willd.），屬于藜科，是安第斯山區(qū)的主要糧食作物之一，已有數(shù)千年的種植歷史[1]。藜麥是一種無麩質(zhì)的假谷物，近年來因其較高的營養(yǎng)價值和健康功效而受到廣泛關(guān)注[2]。研究表明，藜麥含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸及其他微量元素[3]。同時，藜麥含有多種生物活性成分，包括多酚、總黃酮、皂苷等，具有較強的抗氧化活性[4-6]，能夠降低氧化應(yīng)激相關(guān)疾?。ㄈ缣悄虿　┌Y和肥胖癥）發(fā)生的風險，因此，藜麥可作為開發(fā)功能性食品的主要原料[7-8]。

啤酒是一種低濃度酒精飲料，主要以麥芽為原料，然后經(jīng)過糖化、過濾、麥汁煮沸和冷卻等工藝發(fā)酵而成。近年來，啤酒的類型和釀制工藝也在不斷優(yōu)化改進，研究人員將雜糧應(yīng)用到啤酒釀造中，研制了蕎麥啤酒、薏米啤酒、青稞啤酒等[9-11]，這些谷物啤酒既有谷物的特殊香味，又保留了谷物自身的營養(yǎng)價值[12-13]。但關(guān)于藜麥啤酒的釀造及其深入研究鮮見報道。

藜麥是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的無麩質(zhì)堿性食物，胚芽占種子的比例較大，為68%[14]。藜麥發(fā)芽后能顯著提高營養(yǎng)物質(zhì)及總酚、總黃酮、皂苷等活性物質(zhì)含量，易于人體吸收，已被廣泛用于食品加工等領(lǐng)域[15-18]。研究人員通過正交試驗或響應(yīng)面分析等方法優(yōu)化了藜麥復(fù)合高纖維蛋白飲品、藜麥多谷物代餐粉、藜麥黃酒的配方或工藝條件[19-21]。研究表明，藜麥黃酒中可溶性蛋白、總酚、總黃酮含量均顯著提高，且藜麥黃酒中的揮發(fā)性成分比燕麥黃酒中的揮發(fā)性成分多[22-23]，同時，總酚和總黃酮在清除自由基方面效果顯著[21]。將藜麥添加到啤酒釀造過程中，可使藜麥的營養(yǎng)價值有效地發(fā)揮出來，制作出營養(yǎng)價值高、風味獨特且具有生物功效的大眾酒飲品。

本試驗以大麥、藜麥為原料，運用單因素試驗和響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化藜麥啤酒的最佳釀造工藝。同時，測定藜麥啤酒中總酚、總黃酮的含量及抗氧化活性，為藜麥深加工產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

藜麥：山東老鄉(xiāng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，產(chǎn)自青海?。淮篼?、卡斯卡特啤酒花：鄭州龍海啤酒物資有限公司，產(chǎn)自美國；S-04酵母：比利時弗曼迪斯酵母有限公司；無水乙醇、沒食子酸、福林酚試劑、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蘆丁標準品、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、鄰苯三酚、水楊酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

9684麥芽研磨器：山東工大機械有限公司；KOGV328A高精度恒溫糖化鍋：杭州正久機械制造股份有限公司；1.5 m硅膠吸虹器、30 L美式啤酒發(fā)酵桶：煙臺帝伯仕啤酒技術(shù)有限公司；LQJ 304不銹鋼冷卻盤管：深圳市海新萊實業(yè)有限公司；1.0～1.1糖度比重計：北京博科技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥啤酒釀造工藝流程

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 藜麥添加量的確定

設(shè)置藜麥添加量分別為0%、15%、25%、35%、45%、55%、65%，發(fā)酵時間為16 d，糖化溫度為70℃，進行啤酒發(fā)酵，發(fā)酵完成后，對啤酒進行感官評定，并測定啤酒中總酚和總黃酮含量，考察不同藜麥添加量對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響。

1.3.2.2 發(fā)酵時間的確定

設(shè)置藜麥啤酒的發(fā)酵時間分別為13、14、16、18、19 d，藜麥添加量為55%，糖化溫度為70℃，進行啤酒發(fā)酵，發(fā)酵完成后，對啤酒進行感官評定，并測定啤酒中總酚和總黃酮含量，考察不同發(fā)酵時間對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響。

1.3.2.3 糖化溫度的確定

設(shè)置藜麥啤酒糖化溫度分別為 60、65、70、75、80℃，藜麥添加量為55%，發(fā)酵時間為16 d，進行啤酒發(fā)酵，發(fā)酵完成后，對啤酒進行感官評定，并測定啤酒中總酚和總黃酮含量，考察不同糖化溫度對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥啤酒發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken中心試驗設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗，以感官評分為響應(yīng)值，以藜麥添加量、發(fā)酵時間、糖化溫度作為自變量，試驗因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.4 感官評定

參照國家標準GB/T 4927—2008《啤酒》，運用綜合評分法從外觀、泡沫性能、香氣、口感4個方面對藜麥啤酒品質(zhì)進行感官評定。選取10位身體健康且無不良嗜好的食品專業(yè)學(xué)生和老師組成感官評定小組，年齡在18歲～29歲之間，均接受過啤酒評定方面的專業(yè)訓(xùn)練，對制得的藜麥啤酒進行評分，總分100。藜麥啤酒感官評分標準見表2。

表2 藜麥啤酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of quinoa beer

1.3.5 藜麥啤酒基本理化指標的測定

1.3.5.1 總糖含量的測定

葡萄糖標準曲線的制作：準確稱取100 mg無水葡萄糖，用蒸餾水定容至100 mL，得到1 mg/mL標準溶液。分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖標準溶液于試管中，加蒸餾水補充至2 mL，加入6 mL蒽酮試劑，混勻，放沸水中加熱15 min，冷卻，于625 nm處測吸光值，吸光值作為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=2.728 6x+0.069 7（R2=0.999 6）。每組試驗重復(fù)3次。

藜麥啤酒中總糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法。分別吸取藜麥啤酒樣品溶液2 mL于試管中，分別加入6 mL蒽酮試劑，混勻，沸水浴15 min，冷卻，于625 nm處測吸光值，根據(jù)標準曲線的回歸方程計算樣品中總糖含量。

1.3.5.2 總酸含量的測定

啤酒中總酸含量的測定參考國家標準GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的第一法。

1.3.5.3 酒精度的測定

啤酒中酒精度的測定采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的密度瓶法。

1.3.6 藜麥啤酒活性成分測定

1.3.6.1 藜麥啤酒酚類物質(zhì)提取液的制備

分別吸取5 mL藜麥啤酒樣品，加入45 mL乙醇（60%～70%），混合均勻，60℃超聲輔助提取80 min后，在溫度4℃、轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下離心15 min，收集濾液，濃縮冷卻后，用乙醇定容到20 mL。

1.3.6.2 藜麥啤酒總酚含量的測定

藜麥啤酒中總酚含量的測定采用福林肖卡法[24-25]，提取物中總酚含量表示為沒食子酸當量，單位記為μg/mL。

沒食子酸標準曲線的制作：準確稱取沒食子酸標準品25 mg，用蒸餾水定容至250 mL，得到0.1 mg/mL對照溶液。分別吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 的容量瓶中，加入2 mL福林酚，混合均勻后再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容，搖勻后避光反應(yīng)1 h，測定765 nm處的吸光值。吸光值作為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.088 3x+0.042 8（R2=0.999 5）。每組試驗重復(fù)3次。

1.3.6.3 藜麥啤酒總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定采用Z?otek等[18]的方法，并稍加修改，提取物中總黃酮含量表示為蘆丁當量，單位記為μg/mL。

蘆丁標準曲線的制作：準確稱取蘆丁標準品20mg，用60%乙醇定容至10 mL，吸取5.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到200 μg/mL標準溶液。分別吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 對照溶液于 15 mL試管中，用蒸餾水補充至5 mL，加入0.5 mL 5%的NaNO2溶液，混合均勻，反應(yīng)6 min。加入0.5 mL 10%Al（NO3）3溶液，混合均勻，反應(yīng)6 min。加入4 mL 4%NaOH溶液，搖勻后反應(yīng)20 min，測定510 nm處吸光值。以吸光值為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程 y=0.004 9x+0.016 5（R2=0.999 7）。每組試驗重復(fù)3次。

1.3.7 DPPH·清除能力的測定

DPPH·清除能力測定參考Hirose等[26]的方法，并稍加修改。將多酚提取液配制成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的溶液，分別吸取 2.0 mL不同濃度的提取溶液置于10 mL比色管中，再加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，混合均勻，避光靜置15 min，于517 nm處測定吸光值記為A1；以2.0 mL蒸餾水溶液代替0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，測定吸光值記為A2；以2.0 mL蒸餾水代替樣液，測定吸光值記為A0。DPPH·清除率計算公式如下。

DPPH·清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件分別進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析（p<0.05），使用Origin 2016軟件繪圖，采用Minitab和Design-Expert軟件進行響應(yīng)面分析。數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 藜麥添加量對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響藜麥添加量對啤酒感官品質(zhì)的影響見表3。

表3 藜麥添加量對啤酒感官品質(zhì)的影響Table 3 The effect of quinoa addition amount on sensory quality of beer

由表3可知，隨著藜麥添加量的增加，藜麥啤酒的外觀和香氣評分呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，色澤呈現(xiàn)淡黃色，與卞猛[27]的研究結(jié)果一致。藜麥添加量為55%時，感官評分達到最大值，此時，啤酒酒體飽滿，柔和爽口，且二氧化碳的殺口感較強，感官品質(zhì)最高。因此，選擇藜麥添加量為45%、55%、65%進行后續(xù)試驗。

2.1.2 發(fā)酵時間對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對啤酒感官品質(zhì)的影響見表4。

表4 發(fā)酵時間對啤酒感官品質(zhì)的影響Table 4 The effect of fermentation time on sensory quality of beer

由表4可知，當發(fā)酵13 d時，藜麥啤酒各項指標雖達到啤酒的感官標準，但相比于發(fā)酵16 d的藜麥啤酒，啤酒的香氣較弱，外觀澄清度、泡沫性能較差，感官評分較低。發(fā)酵16 d的藜麥啤酒，其外觀、香氣、口感均較好，且感官評分達到最大值。隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，啤酒的澄清度下降，泡沫性能和香氣減弱。因此，選擇發(fā)酵時間為14、16、18 d進行后續(xù)的試驗。

2.1.3 糖化溫度對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響

糖化溫度對啤酒感官品質(zhì)的影響見表5。

表5 糖化溫度對啤酒感官品質(zhì)的影響Table 5 The effect of saccharification temperature on sensory quality of beer

由表5可知，糖化溫度對藜麥啤酒的口感影響較大。糖化溫度在70℃時，口感最佳。隨著糖化溫度的增加，藜麥啤酒的泡沫性能有所減弱，80℃時，口感和泡沫性能均較差，且感官評分較低。因此，選擇糖化溫度為65、70、75℃進行后續(xù)的試驗。

2.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化藜麥啤酒發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

通過Design-Expert軟件對藜麥啤酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化試驗設(shè)計及分析，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of response surface test

通過多元回歸分析，得到二次多項擬合方程為Y=84.28+2.48A-1.39B-4.14C+3.20AB-2.85AC-1.08BC-3.20A2-2.78B2-6.38C2。

由表7可知，多元二次模型p＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項p=0.030 1＜0.05，差異顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.980 8，說明該方程擬合度較好，可用該模型預(yù)測藜麥啤酒感官評分的變化。顯著性檢驗結(jié)果表明，A、C、AB、AC、A2、B2、C2影響極顯著（p＜0.01），而 BC項對藜麥啤酒的感官品質(zhì)影響不顯著（p＞0.05）。各因素對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響次序依次為藜麥添加量（A）＞糖化溫度（C）＞發(fā)酵時間（B），即藜麥添加量對藜麥啤酒感官評分的影響程度最大。

表7 方差分析結(jié)果Table 7 The results of analysis of variance

各因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖1。

響應(yīng)曲面圖可直觀反映各因素交互作用對藜麥啤酒感官品質(zhì)的影響程度，曲面越陡峭說明影響越大，相反，越平緩說明影響越弱。由圖1可以看出，藜麥添加量與發(fā)酵時間、藜麥添加量與糖化溫度之間交互作用的響應(yīng)面較陡峭，說明藜麥添加量與發(fā)酵時間、藜麥添加量與糖化溫度交互作用顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖1 兩因素交互作用對藜麥啤酒感官評分影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots showing the interaction effects of factors on the sensory score of quinoa beer

2.2.2 藜麥啤酒最佳發(fā)酵工藝條件的確定

根據(jù)模型擬合，得到最佳的工藝參數(shù)為藜麥添加量54.55%，發(fā)酵時間15.58 d，糖化溫度70.40℃，得到的藜麥啤酒感官評分為86.096。為了方便實際操作，調(diào)整最佳工藝參數(shù)為藜麥添加量55%，發(fā)酵時間16 d，糖化溫度70℃，并在此條件下進行3次平行驗證試驗，結(jié)果表明，得到的藜麥啤酒感官評分為86.0±0.1。試驗結(jié)果與模型預(yù)測值相近，說明試驗設(shè)計預(yù)測的試驗參數(shù)比較精準，證明結(jié)果合理可靠。

2.3 藜麥啤酒理化指標的測定結(jié)果

對未添加藜麥和最優(yōu)工藝下制得藜麥啤酒的理化指標進行對比分析，結(jié)果見表8。

由表8可知，藜麥啤酒的酒精度、總糖含量顯著高于未添加藜麥的啤酒，總酸含量顯著低于未添加藜麥的啤酒。此外，藜麥啤酒中總酚、總黃酮含量顯著高于未添加藜麥的啤酒，這與Carciochi等[28]的研究結(jié)果一致。同時，藜麥啤酒中DPPH·的清除能力也顯著高于未添加藜麥的啤酒，且其清除DPPH·能力的IC50值為39.65 mg/mL，說明藜麥的添加顯著提高了藜麥啤酒中酚類物質(zhì)的含量，進而直接影響藜麥啤酒的抗氧化活性。

表8 產(chǎn)品理化指標測定結(jié)果Table 8 Measurement results of physical and chemical indexes of products

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定最佳發(fā)酵工藝條件為藜麥添加量55%，發(fā)酵時間16 d，糖化溫度70℃，該條件下藜麥啤酒的感官評分為86.0±0.1，與預(yù)測值誤差在1%內(nèi)，得到的回歸方程合理可靠，具有可行性。同時，此工藝條件下，藜麥啤酒中總糖含量為0.65 mg/mL、總酸含量為11.52 g/L、酒精度為1.64%vol，總酚、總黃酮含量分別為5.44、79.00 μg/mL，且 DPPH·清除率為 76.60%，DPPH·清除能力的IC50值為39.65 mg/mL。本試驗結(jié)果為藜麥產(chǎn)品深加工提供了一定的參考。