原料前處理對玉米漿酶解效果的影響及酶解工藝優(yōu)化

常大偉，雷琦，杜小平，唐德劍，沈文，丁勇

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康 725000；2.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

谷物作為人類主要的食物原料，是人體碳水化合物、蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，對保持膳食營養(yǎng)和平衡非常重要，同時(shí)，谷物還可以提供多酚、黃酮和生育酚等功能性成分[1-3]。以谷物為原料開發(fā)的加工食品、飲品發(fā)展迅速，市場占有率逐步擴(kuò)大，成為新興食品的發(fā)展方向[4-6]。我國是玉米的第二大生產(chǎn)國，產(chǎn)量約占谷物總產(chǎn)量的20%[7]。玉米含有碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、必需氨基酸、多酚類、植酸等。此外，玉米所含有的長壽因子谷胱甘肽，在硒的參與下，可生成谷胱甘肽氧化酶，具有延緩衰老的功能[8-9]。玉米中的葉黃素、玉米黃質(zhì)具有延緩雙眼老化的作用[10]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，玉米有消渴、利尿、解毒之功效[11]。

玉米漿中已糊化的淀粉會(huì)隨著溫度的降低和貨架期的延長而老化。這是由于淀粉分子熱運(yùn)動(dòng)能量不足，玉米漿體系處于熱力學(xué)非平衡狀態(tài)，分子鏈間借助氫鍵作用相互吸引和排列，使得體系的自由焓降低，最終形成結(jié)晶束，從而引起淀粉的老化。體系中淀粉老化的主要表現(xiàn)為變稠甚至結(jié)團(tuán)，形成弱凝膠狀，上層析出清水，底部形成凝膠塊，玉米漿或其加工制品口感變得粗糙，香味明顯減弱或風(fēng)味改變。玉米漿表現(xiàn)為顆粒變硬、凝膠、粗糙和反生等[12]。

通過對谷物原料進(jìn)行酶解處理，可以豐富產(chǎn)品口感、風(fēng)味，降低漿液的黏度，有利于消化吸收及體系的穩(wěn)定等。谷物酶解常見的水解酶有淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等。呂滿霞等[13]以新鮮甜玉米為原料，按照料液比 1∶4（g/mL），利用 0.35%中溫 α-淀粉酶，55℃條件下酶解25 min以及0.15%的糖化酶，55℃酶解20 min制取了甜玉米漿，制得的玉米汁可溶性固形物含量為3.9%。李長見[14]以新鮮玉米為原料，采用20 U/g的高溫α-淀粉酶，80℃條件下酶解60 min以及200 U/g的糖化酶，60℃酶解5 h，制得玉米汁的葡萄糖當(dāng)量（dextrose equivalent，DE）最高為81.876%。高愿軍等[15]運(yùn)用正交試驗(yàn)方法得到了玉米最佳的酶解條件：料液比1∶10（g/mL），60℃下，自然 pH 值，0.25%α-淀粉酶酶解40min；然后60℃下，pH值4.5，0.25%的葡萄糖淀粉酶酶解3h。吳素萍等[16]采用α-淀粉酶對玉米汁基料進(jìn)行酶處理，酶解條件為在pH6.0下，酶添加量1%、酶解溫度90℃、酶解時(shí)間60 min，酶處理后得到的玉米汁飲料基料色澤淡黃，具有玉米清香。但是目前對于選用酶技術(shù)酶解玉米工藝的系統(tǒng)研究還較少，對不同前處理方法對酶解谷物的影響也相對較少，玉米酶解后得到玉米漿的可溶性固形物含量和原料利用率也比較低。

針對玉米漿加工存在的問題以及不同酶的作用原理，本試驗(yàn)擬以玉米為原料，分別采用烘烤和膨化方法對原料進(jìn)行預(yù)處理，采用中溫淀粉酶與葡萄糖淀粉酶兩步法對玉米漿進(jìn)行酶解。以可溶性固形物含量和原料利用率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)探究原料的不同前處理方法、料液比、酶添加量、酶解溫度和時(shí)間的影響。同時(shí)以DE值為指標(biāo)，采用響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步確定最優(yōu)的酶解工藝條件。以期為玉米飲品的研發(fā)、生產(chǎn)及其在其他品類飲料產(chǎn)品中的應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米糝：紫陽縣開源富硒科技發(fā)展有限公司；斐林試劑：上海源葉生物科技有限公司；酶制劑（中溫淀粉酶Ban480，葡萄糖淀粉酶AMG300L）：諾維信（中國）投資有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器（SHZ-A）：上海醫(yī)療器械有限公司；高速離心機(jī)（L500-A）：湖南湘儀股份有限公司；pH計(jì)（pHS-3E型）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

玉米糝前處理（膨化處理、烘烤處理）→粉碎過80目篩→配制一定料液比溶液→調(diào)pH值至6→中溫淀粉酶酶解→滅酶（95℃、30 min）→調(diào)pH值至4→葡萄糖淀粉酶酶解（酶解溫度70℃，加酶量為0.2%）→滅酶（95℃、30 min）→冷卻離心（4 000 r/min）→去除沉淀部分為酶解液。

1.3.2 原料的預(yù)處理

膨化玉米糝粉：采用壓差膨化工藝，物料的加熱溫度控制在145℃～155℃，膨化腔的壓力控制在0.30 MPa，另一個(gè)和膨化腔相連的抽真空腔進(jìn)行抽真空并使其真空度達(dá)到-0.093 MPa。

烘烤預(yù)處理：選取優(yōu)質(zhì)玉米糝，精選去雜，進(jìn)行烘烤處理，將玉米粉置于烤箱處理180℃，30 min。冷卻后包裝，置于干燥處，備用。烘烤過程中定時(shí)翻面，以防受熱不勻，烘至微光亮黃色且?guī)厥庀阄丁?/p>

1.3.3 中溫淀粉酶酶解條件優(yōu)化

1.3.3.1 料液比

分別選取不同預(yù)處理的原料樣品各20 g，料液比分別為 1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL），控制 pH 值為 6，加入中溫淀粉酶Ban480在酶解溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量0.2%條件下進(jìn)行反應(yīng)，滅酶，調(diào)節(jié)溶液pH值至4，加入葡萄糖淀粉酶AMG300L在酶解溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量0.2%條件下進(jìn)行反應(yīng)，滅酶后離心取上清液測定可溶性固形物含量和還原糖含量，并計(jì)算樣品DE值。

1.3.3.2 酶添加量

分別選取不同預(yù)處理的原料樣品各20 g，固定反應(yīng)料液比1∶5（g/mL），控制pH值為6，加入中溫淀粉酶Ban480在酶解溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量分別為 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%進(jìn)行反應(yīng)，滅酶，調(diào)節(jié)溶液pH值至4，加入葡萄糖淀粉酶AMG300L在酶解溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量0.2%條件下進(jìn)行反應(yīng)，滅酶后離心取上清液測可溶性固形物含量和還原糖含量，并計(jì)算樣品DE值。

1.3.3.3 酶解時(shí)間

分別選取不同預(yù)處理的原料樣品各20 g，固定反應(yīng)料液比1∶5（g/mL），控制pH值為6，加入中溫淀粉酶Ban480在酶解溫度70℃、加酶量0.2%，反應(yīng)時(shí)間分別為 60、70、80、90、100 min 進(jìn)行反應(yīng)，滅酶，調(diào)節(jié)溶液pH值至4，加入葡萄糖淀粉酶AMG300L在酶解溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量0.2%條件下進(jìn)行反應(yīng)，滅酶后離心取上清液測可溶性固形物含量和還原糖含量，并計(jì)算樣品DE值。

1.3.3.4 酶解溫度

分別選取不同預(yù)處理的原料樣品各20 g，固定反應(yīng)料液比 1∶5（g/mL），控制 pH 值為 6，加入中溫淀粉酶Ban480反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量0.2%，反應(yīng)溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃進(jìn)行反應(yīng)，滅酶，調(diào)節(jié)溶液 pH值至4，加入葡萄糖淀粉酶AMG300L在酶解溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、加酶量0.2%條件下進(jìn)行反應(yīng)，滅酶后離心取上清液測可溶性固形物含量和還原糖含量，并計(jì)算樣品DE值。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）為考察因素，以DE值為指標(biāo)，利用Design Expert軟件建立的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，進(jìn)一步探究玉米漿酶解的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface test

1.5 酶解指標(biāo)測定方法

1.5.1 可溶性固形物含量

可溶性固形物含量采用手持糖度儀測定。

1.5.2 還原糖含量測定

還原糖的檢測采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》的直接滴定法[17]。

1.5.3 DE值與總固形物含量測定方法

DE值是指糖化液中還原糖全部以葡萄糖計(jì)所占干物質(zhì)的百分比，表示淀粉的水解程度或糖化程度。取15 mL～20 mL的酶解液采用1.5.2的方法測定還原糖的含量。計(jì)算公式如下。

總固形物含量測定采用105℃恒重法[18]。

1.5.4 原料利用率

稱取20 g酶解后的玉米漿酶解液于離心管中，4 000 r/min離心10 min，去除沉淀得到酶解液。酶解液中固形物的質(zhì)量占添加的原料干基的質(zhì)量即為原料利用率，每個(gè)樣品重復(fù)3次。計(jì)算公式如下。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS7.05軟件檢驗(yàn)分析比較試驗(yàn)各組間均值差異顯著性（p<0.05），響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design expert軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料的料液比對不同前處理玉米漿可溶性固形物含量和原料利用率的影響

底物濃度的高低是影響酶解的參數(shù)之一[19]。料液比對玉米漿可溶性固形物含量和原料利用率的影響見圖1。

圖1 料液比對玉米漿可溶性固形物含量和原料利用率的影響Fig.1 Effect of the solid-to-liquid ration on the soluble solid content and raw material utilization rate

由圖1可知，在可溶性固形物含量和原料利用率方面，膨化處理組均顯著高于烘烤處理組（p<0.05）。兩種前處理所得原料的可溶性固形物含量均隨著溶劑含量的提高，逐漸下降。這主要是由于可溶性固形物溶出的速率遠(yuǎn)低于溶劑的增加速率。膨化處理組在料液比1∶5（g/mL）時(shí)，原料的利用率達(dá)到最高值（41.2%）。主要原因?yàn)樵谳^低底物濃度時(shí)，酶分子不能充分與底物結(jié)合，隨著底物濃度的增加，與底物結(jié)合的酶逐漸增多，直到飽和。如果進(jìn)一步增加底物濃度，會(huì)因?yàn)榈孜餄舛冗^高而減少酶與底物結(jié)合的幾率進(jìn)而降低反應(yīng)速率，從而導(dǎo)致原料利用率下降[20]。綜合考慮，選擇料液比 1∶5（g/mL）為宜。

2.2 酶添加量對不同前處理玉米漿可溶性固形物含量和原料利用率的影響

酶添加量對原料利用率和可溶性固形物含量的影響見圖2。

由圖2可知，在底物濃度一定的情況下，當(dāng)酶添加量從0.05%增加到0.6%時(shí)，可溶性固形物含量和原料利用率均呈緩慢增加，并且膨化處理組顯著高于烘烤組（p<0.05）。這主要是由于酶的聚集或產(chǎn)物的影響等引起了水解程度的降低?？紤]到酶的成本，選擇0.4%的酶添加量為宜。

圖2 酶添加量對可溶性固形物含量和原料利用率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on the soluble solid content and raw material utilization rate

2.3 酶解時(shí)間對不同前處理玉米漿可溶性固形物含量和原料利用率的影響。

酶解時(shí)間對可溶性固形物含量和原料利用率的影響見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對可溶性固形物含量和原料利用率的影響Fig.3 Effect of the enzymatic hydrolysis time on the soluble solid content and raw material utilization rate

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，可溶性固形物含量和原料的利用率不但沒有增加，反而略有下降。在玉米漿的酶解過程中，可溶性固形物含量的增加主要是由于不溶性的淀粉大分子水解成的可溶性糊精、還原糖小分子以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的溶出。隨著酶解時(shí)間的延長，在底物逐漸減少及酶解產(chǎn)物的積累對酶的抑制作用下，酶解速度減慢，可溶性物質(zhì)的含量不再增加。隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步延長，已經(jīng)溶出的蛋白質(zhì)長時(shí)間處在高溫條件下，造成蛋白質(zhì)結(jié)團(tuán)、凝集、沉淀，在測量前離心時(shí)被分離出去，從而導(dǎo)致可溶性固形物含量的降低[21]。呂滿霞等[13]采用中溫淀粉酶對甜玉米的漿液進(jìn)行酶解，研究發(fā)現(xiàn)隨著酶解時(shí)間的延長，甜玉米漿液中淀粉逐漸酶解，可溶性固形物含量快速上升，在30 min時(shí)達(dá)到最大，之后增長趨于平緩。曹盼等[21]采用了α-淀粉酶進(jìn)行了燕麥漿的酶解研究發(fā)現(xiàn)，隨著酶解時(shí)間的延長，可溶性固形物含量先增大后減小，在酶解時(shí)間30 min時(shí)達(dá)到最大，而當(dāng)超過30 min后可溶性固形物含量略有下降。因此，選擇酶解時(shí)間60 min為宜。

2.4 酶解溫度對不同前處理玉米漿可溶性固形物含量和原料利用率的影響

酶解溫度對可溶性固形物含量和原料利用率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對可溶性固形物含量和原料利用率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the soluble solid content and raw material utilization rate

酶解溫度影響酶的活性，對酶解效率有重要的影響。由圖4可知，隨著酶解溫度的提高，可溶性固形物含量和原料利用率均呈現(xiàn)先上升然后逐漸降低的趨勢。可溶性固形物含量和原料利用率在70℃時(shí)達(dá)到最大。這主要是因?yàn)樘砑拥摩?淀粉酶最適作用溫度約在70℃左右，此時(shí)淀粉的酶解程度較大。酶在較低溫度下催化活力會(huì)降低，而溫度過高時(shí)有會(huì)抑制酶的活性。因此，選擇酶解溫度70℃為宜。

綜上，在相同的酶解工藝條件下，相比于經(jīng)過烘烤處理的樣品組，經(jīng)過膨化處理的樣品組，可溶性固形物含量和原料的利用率均顯著提高（p<0.05），更利于玉米漿的酶解。主要原因：采用膨化處理的谷物，處理過程中經(jīng)歷了高溫高壓，內(nèi)部水分急劇汽化，形成了疏松酥脆的多孔結(jié)構(gòu)，使得原料特征發(fā)生了改變[22]。淀粉是玉米中最主要的成分，在膨化過程中淀粉分子之間的氫鍵和糖苷鍵發(fā)生破壞，促進(jìn)了淀粉的糊化作用。有研究表明，膨化中的高溫和高壓使谷物中的淀粉具有較高的糊化度，而且較高的糊化度能夠?yàn)榈矸勖柑峁└嗯c淀粉接觸的機(jī)會(huì)，因而更利于淀粉的酶解[23-24]。同時(shí)膨化還能夠使淀粉粒解體，淀粉含量減少，糊精和還原糖如葡萄糖、麥芽糖等含量增加，還原能力增強(qiáng)，碘值升高，淀粉α化度升高。膨化也使蛋白質(zhì)變性，并趨于降解，使得氨基酸增加。這些變化的發(fā)生使得物料中水溶性成分的溶出能力也得到了增強(qiáng)[25-26]。

2.5 膨化前處理玉米漿酶解工藝響應(yīng)面結(jié)果分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2?；貧w與方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The scheme and result of response surface optimization experiment

通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸方程：Y=58.57+0.66A-2.14B+0.43C+0.18AB-0.12AC-0.28BC-0.98A2-7.04B2-0.039C2。

從表3中可以看出，回歸模型p<0.000 1，說明回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)p>0.05，說明該模型是合適的。相關(guān)系數(shù)R2=0.992 7，說明該二次方程能夠很好地?cái)M合各因素與DE值之間的關(guān)系，可利用該回歸方程確定兩步酶解玉米漿的最佳工藝。對各項(xiàng)F值檢驗(yàn)可知，3個(gè)因素的貢獻(xiàn)率順序?yàn)槊附鉁囟?酶添加量>酶解時(shí)間。通過回歸模型預(yù)測的最優(yōu)條件：酶添加量0.45%，酶解溫度68.31℃，酶解時(shí)間80 min，DE值預(yù)測59.24%。校正試驗(yàn)條件選擇酶添加量0.45%，酶解溫度70℃，酶解時(shí)間80 min，經(jīng)過3次驗(yàn)證試驗(yàn)DE值為58.73%，實(shí)際值和預(yù)測值相差較小，因此應(yīng)用該模型進(jìn)行預(yù)測是可行的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Results of regression and variance analysis

2.5.2 交互項(xiàng)擬合響應(yīng)值分析

不同因素之間的交互作用如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對DE值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors on the DE

由圖5可知，酶解溫度和酶解時(shí)間以及酶添加量和酶解時(shí)間的等高線圖為橢圓形，表明兩因素之間的相互作用更明顯一些。而酶添加量和酶解時(shí)間的等高線圖更接近于圓形，表明這兩者之間的交互作用不明顯。

3 結(jié)論

對玉米糝原料進(jìn)行了的前處理，使之熟化、香味及香氣增強(qiáng)，同時(shí)鈍化內(nèi)源酶。比較了烘烤及膨化2種不同前處理工藝對后續(xù)酶解效果的影響，并對中溫淀粉酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳工藝條件：富硒玉米前處理方法為膨化處理，選擇中溫淀粉酶Ban480進(jìn)行酶解，酶解條件為pH6，酶添加量0.4%，酶解溫度70℃，酶解時(shí)間60 min，升溫至95℃保持30 min終止酶解反應(yīng)。再調(diào)節(jié)酶解液pH值至4，溫度為70℃，添加0.2%的葡萄糖淀粉酶AMG300L酶解60 min，升溫至95℃保持15 min終止酶解反應(yīng)。此條件下制得的玉米酶解物可溶性固形物含量可達(dá)13 g/100 mL以上，原料的利用率大于40%。對中溫淀粉酶的酶解條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，當(dāng)膨化處理玉米糝的料液比為1∶5（g/mL）時(shí)，中溫淀粉酶的最佳酶解條件：酶解溫度70℃、酶添加量0.45%、酶解時(shí)間80 min，所得玉米酶解物的DE值高于58%。本研究為玉米原料的精深加工及其產(chǎn)品開發(fā)和品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。