富含黃酮苷元沙棘葉發(fā)酵茶的制備及其生物活性

顧秋亞，李姝瑤，楊文華，余曉斌

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

沙棘（Hippophae rhumnoides L），屬于薔薇目胡頹子科沙棘屬，是一種具有較多用途的高緯度植物，在醫(yī)藥保健、綠色食品開發(fā)及環(huán)境保護(hù)中應(yīng)用廣泛[1-2]。我國沙棘資源豐富，沙棘葉天然、無毒，而且含有多種對人體有益的活性化合物，其中黃酮類化合物是其最重要的功能活性成分之一[3-4]。沙棘葉中黃酮類化合物大都以糖苷形式存在，經(jīng)研究[5-6]，黃酮糖苷的抗氧化等生物活性和生物利用率均低于苷元。利用微生物轉(zhuǎn)化對沙棘黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，將黃酮糖苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)苷元，可提高其生理活性，促進(jìn)其進(jìn)一步的開發(fā)和利用。

金花菌是黑茶茯磚茶加工工序中的優(yōu)勢菌，該類菌具有耐熱、抗逆性好的特點(diǎn)[7]。金花菌酶系豐富，現(xiàn)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)多種酶如多聚半乳糖轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶、單寧酶、纖維素酶、果膠酶等[8]。這些酶在制茶過程中作為生化動(dòng)力推動(dòng)茶葉生化成分的轉(zhuǎn)變，并使發(fā)酵茶具備更好的保健功效和飲用價(jià)值。將傳統(tǒng)發(fā)酵茶中的有益菌引入沙棘葉進(jìn)行制茶，不僅能賦予沙棘葉發(fā)酵茶的風(fēng)味和口感，其次由于微生物的參與可改變沙棘葉化學(xué)組成、提升其生理活性。合理利用沙棘葉，將其制成發(fā)酵型沙棘葉茶，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株：金花菌Eurotium amstelodami BSX001，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵健康食品實(shí)驗(yàn)室分離并保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，編號ACCC32729。

沙棘葉采集地點(diǎn)是寧夏固原市原州區(qū)張易鎮(zhèn)；甲醇、乙腈（均為色譜純）：Tedia公司（美國）；水溶性維生素 E （Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）、2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]二銨鹽：阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素、異鼠李素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品、胰脂肪酶（牛胰腺，15 U/mg～35 U/mg）：美國sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；Synergy H4酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；7GI-16M高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；6CST-50殺青機(jī)、6CRL-65揉捻機(jī)：浙江武義萬達(dá)干燥設(shè)備制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金花菌孢子懸液的制備與計(jì)數(shù)

稱取300 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加入1 000 mL蒸餾水，煮沸約30 min，雙層紗布過濾后，取濾液加入20 g黑毛茶，煮沸5 min，再次雙層紗布過濾，加入20 g葡萄糖與20 g瓊脂，蒸餾水定容至1 000 mL，即為改良PDA培養(yǎng)基。將E.amstelodami BSX001接種在改良PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，至菌落覆蓋平板較大面積時(shí)（7 d～10 d），在超凈工作臺下倒入少量無菌水，用接種環(huán)小心將黃色閉囊殼刮下，再將懸浮液轉(zhuǎn)入裝有150 mL無菌水的三角瓶內(nèi)（內(nèi)含玻璃珠），150 r/min振搖20 min成分散均勻的孢子懸液，平板菌落計(jì)數(shù)法測得孢子濃度。

1.3.2 沙棘發(fā)酵茶的制備

預(yù)處理：取一定質(zhì)量的沙棘鮮葉，清水沖洗去除葉片泥沙，晾曬；殺青：將沙棘葉放在殺青機(jī)內(nèi)，翻動(dòng)，完成殺青；揉捻：用揉捻機(jī)輕度搓揉3 min～5 min，溫度維持在30℃；發(fā)花：將Eurotium amstelodami BSX001孢子懸浮液按每千克沙棘葉9×109個(gè)孢子的比例接種揉捻后的沙棘葉，含水量控制在45%～50%。32℃持續(xù)發(fā)酵4 d，通風(fēng)換氣6次，25℃繼續(xù)發(fā)酵2 d～6 d；干燥：將完成發(fā)酵的沙棘葉在60℃下干燥4 h，即得沙棘發(fā)酵茶。

1.3.3 沙棘茶總酚及總黃酮含量的檢測

茶葉中總酚（以沒食子酸計(jì)）含量的測定[9]：用每克提取物中所含沒食子酸毫克數(shù)來表示茶葉中所含總酚的量。將樣品稀釋至不同濃度，依次吸取0.5 mL樣品，1.0 mL福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑（稀釋 10倍），1.0 mL 87.56 g/L的碳酸鈉溶液，搖勻后放置60 min，于750 nm下測定吸度。以沒食子酸濃度對吸光度進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.026 8x+0.014 1，R2=0.999 0。

茶葉中總黃酮（以蘆丁計(jì)）含量的測定[10]：吸取2 mL樣品溶液兩份，分別置于25 mL具塞刻度試管中，加水到10 mL，加入1 mL亞硝酸鈉溶液（50 mg/mL），混勻后室溫反應(yīng)6 min，加1 mL硝酸鋁溶液（100 mg/mL），另一份不加硝酸鋁溶液作為空白液，混勻后室溫放置6 min，加 4 mL氫氧化鈉溶液（200 mg/mL），加水至刻度，混勻后室溫放置15 min，于510 nm處測定吸光度。以蘆丁對照品使用液濃度對吸光度進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.026 8x+0.014 1，R2=0.999 5。

1.3.4 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時(shí)測定黃酮苷元的含量

色譜條件：液相色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸（50∶50，體積比），流速 0.8 mL/min，檢測波長 370 nm，柱溫 35℃，進(jìn)樣量 10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：分別精密稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL棕色容量瓶，用無水甲醇溶解并定容，制成0.1 mg/mL對照品儲(chǔ)備液（4℃貯藏）。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液（4℃貯藏）。

供試樣品的制備：將茶樣粉碎，過80目篩，稱取1.00 g，加10 mL甲醇，超聲輔助提取30 min，稀釋，過0.45 μm 濾膜，待測。

1.3.5 沙棘茶抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力的測定[11]：分別取50 μL適當(dāng)稀釋后的樣品與150 μL的DPPH甲醇溶液（75 μmol/L）混合。在室溫黑暗中培養(yǎng)30 min后，在517 nm處測量紫色自由基DPPH溶液的脫色情況。所有測試均做3個(gè)復(fù)孔，取其平均值，陰性對照以樣品溶劑代替樣品溶液。Trolox是一種維生素E的類似物，具有和維生素E相近的抗氧化能力，將其作為沙棘茶總抗氧化能力的參考。樣品的抗氧化能力用其對DPPH自由基的清除率表示，抗氧化活性越強(qiáng)則清除率越大。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

DPPH 自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100

式中：A0為陰性對照吸光度；A1為樣品組吸光度。

ABTS法測定抗氧化活性[12]：首先，將7 mmol/L ABTS二銨鹽和2.4 mmol/L硫酸鉀等體積混合，在室溫下黑暗放置12 h，產(chǎn)生新鮮的ABTS+自由基。將1 mL ABTS溶液與60 mL甲醇混合，在734 nm吸光度為1.10±0.02。然后，將 50 μL 適當(dāng)稀釋的樣品與 150 μL的ABTS溶液反應(yīng)，2 h后在734 nm處測量吸光度。所有測試均做3個(gè)復(fù)孔，取平均值，陰性對照以樣品溶劑代替樣品溶液。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

ABTS+自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100

式中：A0為陰性對照吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.6 沙棘茶降脂活性的測定

參考陳永麗等[13]的方法測定沙棘葉茶樣品的胰脂肪酶活性抑制能力。胰脂肪酶可將脂肪水解成游離脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。通過抑制胰脂肪酶的活性可以減少脂質(zhì)的吸收。將胰脂肪酶溶于50 mmol/L磷酸緩沖液（pH8.0），-20℃保存。稱取0.016 1 g月桂酸4-硝基苯酯溶于100 mL 5 mmol/L乙酸鈉溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的Trition X-100）中，在沸水中加熱以加速溶解，配制得0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯底物溶液，冷卻至室溫備用。分別配制不同質(zhì)量濃度（1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL）的沙棘葉茶甲醇超聲提取液。空白對照為發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后不接菌，其他處理與發(fā)酵組保持一致。

在96孔板中依次加入50 mmol/L磷酸緩沖液（pH8.0）50 μL、不同濃度樣品溶液 50 μL 和胰脂肪酶溶液（100 mg/mL）50 μL；樣品對照組以等體積磷酸緩沖液代替胰脂肪酶溶液；空白組加入磷酸緩沖液50μL、甲醇50 μL和胰脂肪酶溶液50 μL；空白對照組以等體積磷酸緩沖液代替胰脂肪酶溶液；混勻后于37℃下預(yù)熱10 min，然后加入0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯溶液50 μL，混勻后37℃孵育20 min，在405 nm波長下測定反應(yīng)液的吸光度。以奧利司他作為陽性對照，每一樣品平行測定3次。按照以下公式計(jì)算樣品對胰脂肪酶的抑制率。

胰脂肪酶抑制率/%=[1-（Aa-Ab）/（Ac-Ad）]×100

式中：Aa為樣品組在405 nm處的OD值；Ab為樣品對照組在405 nm處的OD值；Ac為空白組在405 nm處的OD值；Ad為空白對照組在405 nm處的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 25進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。所有結(jié)果均表示為至少3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采摘期對沙棘葉中水分及營養(yǎng)成分含量的影響

原料是影響茶葉品質(zhì)的基礎(chǔ)物質(zhì)條件。茶樹品種、栽培方法和管理技術(shù)影響著鮮葉的品質(zhì)，但在相同的條件下，鮮葉的品質(zhì)很大程度取決于采摘時(shí)機(jī)[14]。選用采摘期分別為6月、7月、8月、9月、10月的寧夏沙棘鮮葉為試驗(yàn)原料，測定不同采摘期鮮葉的含水量及總酚、總黃酮的含量，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同采摘期沙棘葉的含水量Fig.1 Water content of seabuckthorn leaves in different picking periods

圖2 采摘期對沙棘葉總黃酮和總酚含量的影響Fig.2 The effect of seabuckthorn leaf picking on contents of flavonoids and phenols

由圖1可知，6月至10月沙棘葉的含水量為在54.28%～68.35%，其中6月的沙棘葉鮮嫩，含水量最高，隨著氣溫慢慢提升，葉片的蒸騰作用加強(qiáng)，葉片開始失水，到10月沙棘葉已成熟，部分葉子開始枯萎、脫落，此時(shí)含水量最低，僅為54.28%，因此選用7月～9月的沙棘鮮葉制茶較為合適。

酚類化合物除了受品種遺傳因子影響外，環(huán)境對其影響也很大，其中光的影響尤其重要。凡在光照強(qiáng)度和日照量大的環(huán)境下，沙棘葉中兒茶素含量明顯增加，光質(zhì)方面黃色光有利茶樹生育[15]。

由圖2可知，在6月～9月隨著葉片成熟度的增加，沙棘葉中總酚含量基本呈上升趨勢，含量變化在42.61 mg GAE/g～50.34 mg GAE/g，9 月總酚含量達(dá)到最高值50.34 mg GAE/g；沙棘葉總黃酮含量變化在15.35 mg RT/g～23.12 mg RT/g，在 9 月達(dá)到最高值。10月總酚和總黃酮含量又有所下降。所以綜合各因素，制備沙棘葉茶應(yīng)以9月采摘沙棘葉較好。

以9月份采摘沙棘鮮葉為原料，將金花菌E.amstelodami BSX001孢子懸浮液按每kg沙棘葉1×109個(gè)孢子的比例接種于揉捻后的沙棘葉，按茯茶“發(fā)花”工藝制得沙棘發(fā)酵茶。沙棘葉發(fā)酵茶的感官品析結(jié)果見圖3。

圖3 沙棘葉發(fā)酵茶的感官品析Fig.3 Sensory analysis of fermented tea with seabuckthorn leaves

由圖3可知，沙棘葉經(jīng)“發(fā)花”工藝后，葉底呈暗褐色，葉片附著大量金花菌的金黃色閉囊殼。當(dāng)茶水比為 1∶50（g/mL），水溫 100℃，浸泡 15 min 時(shí)茶湯紅黃明亮，香氣純正，滋味醇和尚濃。

2.2 沙棘葉“發(fā)花”階段微生物及主要生化成分含量的變化

2.2.1 沙棘葉“發(fā)花”階段金花菌數(shù)量的變化

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E.amstelodami BSX001在不另外添加營養(yǎng)成分的條件下，可在沙棘葉上快速“發(fā)花”，分別對“發(fā)花”過程中采集的不同時(shí)間的沙棘葉中金花菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖4。

圖4 沙棘葉“發(fā)花”階段微生物數(shù)量變化Fig.4 Changes in the number of microorganisms during flowering

沙棘葉“發(fā)花”是在相對開放的環(huán)境中完成，因此在發(fā)酵前期會(huì)發(fā)現(xiàn)有少數(shù)的霉菌和酵母菌，然而沙棘葉的低水分活度、營養(yǎng)條件、以及人工對溫濕度的調(diào)節(jié)使得金花菌快速繁殖并成為優(yōu)勢菌，發(fā)花的第3天，可見沙棘葉表面附著大量白色菌絲，部分區(qū)域呈淡黃色，隨后幾天金花菌數(shù)量呈幾何級數(shù)增加，由圖4可知，在發(fā)酵第9天金花菌數(shù)量達(dá)到最多（3.3×107CFU/g），隨后金花菌以閉囊殼形式存在，數(shù)量保持穩(wěn)定。

2.2.2 沙棘葉“發(fā)花”階段的總酚含量的變化

茶多酚是茶葉中主要的呈味物質(zhì)，具有一定的苦澀味并帶有強(qiáng)烈的收斂性[16]，沙棘葉中酚類化合物的組成與含量與其他茶類不同，但是同樣對制茶最終品質(zhì)有著重要影響。沙棘葉“發(fā)花”過程中總酚含量的變化見圖5。

圖5 沙棘葉“發(fā)花”過程中總酚含量的變化Fig.5 Variation of total phenols content of seabuckthorn leaves during flowering

多酚類化合物含量在沙棘葉“發(fā)花”階段呈先增加后減少的趨勢，金花菌的果膠酶、單寧酶、糖苷酶等酶可作用于沙棘葉釋放葉壁中鍵合態(tài)的酚類物質(zhì)，后期酚類物質(zhì)再經(jīng)酶的作用發(fā)生氧化、降解、聚合等一系列反應(yīng)[17-18]。由圖5可知，在“發(fā)花”階段，沙棘葉中總酚含量呈先增加后減少的變化趨勢，發(fā)酵第6天時(shí)沙棘葉總酚含量最高，可達(dá)（58.54±1.32）mg GAE/g，“發(fā)花”后期總酚含量下降明顯。

2.2.3 沙棘葉“發(fā)花”階段的黃酮類化合物的變化

黃酮類化合物是沙棘葉中主要的一類功能性成分，大都呈黃綠色，通常以黃酮苷的形式存在[19-20]。沙棘葉“發(fā)花”過程中總黃酮含量的變化見圖6。

圖6 沙棘葉“發(fā)花”過程中總黃酮含量的變化Fig.6 Variation of total flavonoids content of seabuckthorn leaves during flowering

由圖6可知，在“發(fā)花”階段，沙棘葉中總黃酮含量呈先增加后減少的變化趨勢，發(fā)酵第6天時(shí)沙棘葉總黃酮含量最高，可達(dá)（36.62±1.01）mg RT/g，“發(fā)花”后期總黃酮含量下降明顯，但仍明顯高于未加工的沙棘葉[（19.37±0.67）mg RT/g]。

金花菌分泌的多種胞外酶有利于鍵合態(tài)黃酮類化合物的釋放，隨后黃酮類化合物在金花菌分泌的胞外酶與熱作用下發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，部分與兒茶素、花青素結(jié)合產(chǎn)生輔色素。沙棘葉“發(fā)花”階段總黃酮及黃酮苷元含量的變化如表1所示。

表1 沙棘葉“發(fā)花”階段總黃酮及黃酮苷元含量的變化Table 1 Changes of total flavonoids and flavonoid glycosides in seabuckthorn leaves during flowering

沙棘葉中黃酮主要的存在形式是由槲皮素、山奈酚、異鼠李素等苷元構(gòu)成的糖苷型化合物，而苷元型黃酮更利于吸收且功能性更強(qiáng)[5]。E.amstelodami BSX001與其他金花菌相比有較突出的β-葡萄糖苷酶活性，黃酮苷通過β-葡萄糖苷酶的去糖基作用可獲得相應(yīng)的黃酮苷元等。由表1可知，在E.amstelodami BSX001接入6 d時(shí)，沙棘葉中可檢測的黃酮苷元含量達(dá)到最高，6 d后各苷元含量有所降低。其中異鼠李素（58.37±0.87）mg/100 g，槲皮素（64.14±0.91）mg/100 g，山奈酚（45.24±1.62）mg/100 g。在未加工沙棘葉中僅檢測到微量[（5.68±0.01）mg/100 g]的槲皮素。

2.3 沙棘葉發(fā)酵前后生物活性的變化

2.3.1 沙棘葉發(fā)酵前后的抗氧化活性

沙棘葉發(fā)酵前后自由基清除能力及IC50見表2。

表2 發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物清除自由基能力Table 2 Free radical scavenging capacity of 60%ethanol extract from seabuckthorn leaves before and after fermentation

從表2可以看出，發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物對DPPH、ABTS+自由基均有一定的清除作用，并在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物清除DPPH自由基的IC50分別為12.640 mg/mL和4.690 mg/mL，陽性對照Trolox的IC50為0.028 mg/mL；發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物清除ABTS+自由基的IC50分別2.650 mgmL和2.030 mg/mL，陽性對照Trolox的IC50為0.032 mg/mL。表明沙棘葉經(jīng)E.amstelodami BSX001發(fā)酵后抗氧化能力有所提高。

2.3.2 沙棘葉發(fā)酵前后的體外降脂活性

分別考察了沙棘葉發(fā)酵前后的脂肪酶抑制活性，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到發(fā)酵后沙棘葉對胰脂肪酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.21 mg/mL，低于對照組奧利司他的IC50（0.13 mg/mL）。質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL～10.00 mg/mL時(shí)，發(fā)酵后沙棘葉對胰脂肪酶的抑制率從30.15%增加到78.33%，未發(fā)酵沙棘葉樣品抑制率為3.01%～64.92%，且在各個(gè)質(zhì)量濃度下，發(fā)酵樣品的抑制率均高于未發(fā)酵的樣品，表明沙棘葉對胰脂肪酶具有較好的抑制作用，且經(jīng)金花菌發(fā)酵之后抑制效果有明顯提高。

圖7 發(fā)酵前后沙棘葉和奧利司他對胰脂肪酶的抑制率Fig.7 Inhibitory rate of pancreatic lipase by seabuckthorn leaves before and after fermentation and orlistat

3 結(jié)論

鮮葉的老嫩程度是影響沙棘葉的色澤及營養(yǎng)成分的重要因素。因此選擇適當(dāng)?shù)牟烧谑侵谱魃臣~茶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。均衡水分和各營養(yǎng)成分含量，確定9月為鮮葉最佳采摘期。在茯茶的“發(fā)花”工藝基礎(chǔ)上，采用人工植入的方式將E.amstelodami BSX001孢子懸浮液接種于沙棘葉，試制新型的沙棘葉發(fā)酵茶。分離自茯磚茶的金花菌能在沙棘葉上正常生長，其代謝產(chǎn)生的各種酶類在“發(fā)花”過程中發(fā)生作用，除去了沙棘葉原有的青澀味，使茶葉品質(zhì)得到提升，茶湯色澤紅黃明亮，滋味醇和，菌花香顯著。沙棘葉經(jīng)發(fā)酵后總黃酮含量由原來的（19.37±0.67）mg RT/g提高到（36.62±1.01）mg RT/g，總酚含量由（44.61±0.82）mg GAE/g提高到（58.54±1.32）mg GAE/g。原本含量幾乎檢測不到的黃酮苷元含量明顯提升，槲皮素含量為（64.14±0.91）mg/100 g，山奈酚含量為（45.24±1.62）mg/100 g，異鼠李素含量為（58.37±0.87）mg/100 g，沙棘葉經(jīng)E.amstelodami“發(fā)花”后，抗氧化活性、降脂活性都有明顯提高。