環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫的建立及在溯源分析中的應(yīng)用*

趙麗元，丁紅雨，高洪霞，張敬武，張興哲

（遼寧省大連市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116021）

在無菌藥品的生產(chǎn)中，環(huán)境監(jiān)控是評估生產(chǎn)環(huán)境微生物污染情況的重要手段，我國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）［1］及美國GMP［2］中均有明確要求。環(huán)境監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)中的微生物數(shù)據(jù)，不僅要關(guān)注數(shù)量，更應(yīng)關(guān)注其種類和特點(diǎn)，即對環(huán)境監(jiān)控過程中發(fā)現(xiàn)的污染菌進(jìn)行鑒定，并根據(jù)情況選擇性保存，定期對相應(yīng)數(shù)據(jù)和信息進(jìn)行匯總和分析，這一措施稱為環(huán)境菌數(shù)據(jù)庫建設(shè)［2-3］。建設(shè)環(huán)境菌數(shù)據(jù)庫，有助于建立和健全企業(yè)微生物監(jiān)控方法，完善企業(yè)微生物風(fēng)險(xiǎn)評估和質(zhì)量保證體系，增強(qiáng)微生物污染的溯源分析能力，從源頭上避免微生物污染，保證藥品質(zhì)量［4-9］。本研究中通過收集、鑒定一家無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)環(huán)境菌，建立了覆蓋藥品生產(chǎn)全過程的企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫，形成環(huán)境微生物分布圖，通過分布圖全面客觀地掌握生產(chǎn)環(huán)境。此外，利用數(shù)據(jù)庫為企業(yè)成功進(jìn)行了一次無菌污染事件溯源分析，供更多企業(yè)的溯源分析時(shí)借鑒?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、培養(yǎng)基和試劑、引物

儀器：AC2 - 4S1 型生物安全柜（新加坡Esco 公司）；VITEK 2 COMPACT型全自動微生物藥敏與分析系統(tǒng)，VITEK?MS型MODI-TOF質(zhì)譜儀，均購于法國梅里埃公司；BAXQ7型全自動病原微生物快速檢測系統(tǒng)，全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)均購于杜邦公司；DYCP-31CN 型瓊脂糖凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；BD240型生化培養(yǎng)箱（德國Binder公司）。

培養(yǎng)基和試劑：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，均購于北京陸橋有限公司；裂解液，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）酶Premix Taq，均購于寶生物工程（大連）有限公司。

引物：細(xì)菌用16srRNA 通用擴(kuò)增引物27F 和1492R，霉菌用引物ITS1 和 ITS4，酵母菌用引物 D1 和D2 進(jìn)行測序，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.2 方法

環(huán)境微生物監(jiān)控：與企業(yè)共同制訂環(huán)境監(jiān)控方案，監(jiān)測項(xiàng)目包括原輔料、包裝材料、環(huán)境監(jiān)測、人員、制藥用水、表面消毒、除菌過濾膜、質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室8 個方面，基本覆蓋了生產(chǎn)和檢驗(yàn)的全過程，歷時(shí)10 個月，監(jiān)測頻率以生產(chǎn)情況和已往的風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。

微生物鑒定：將收集到的微生物分離培養(yǎng)、純化后進(jìn)行鑒定，同時(shí)用20%甘油保存菌種，作為環(huán)境微生物菌種實(shí)物庫。鑒定以分子水平鑒定為主，如有疑問可以生化鑒定為補(bǔ)充。1）菌體裂解。取1 接種環(huán)或槍頭尖接種入50 μL 裂解液中，80 ℃裂解15 min（真菌需裂解45 min），離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）2 min，取上清液，作為 PCR 模板。2）PCR 反應(yīng)體系（50 μL）。模板 3 μL；Premix Taq 25 μL；上游引物 1 μL；下游引物1 μL；雙蒸水（ddH2O）20 μL。3）PCR 條件。94 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min（真菌58 ℃退火1 min）；72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；72 ℃再循環(huán)5 min。4）測序。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司以對應(yīng)引物為測序引物進(jìn)行一代測序。

測序結(jié)果分析：將測序結(jié)果拼接核對后，利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 比對分析，獲得菌種的分類信息。經(jīng)聚類分析比對正確后，同時(shí)得到環(huán)境微生物核酸序列庫，用于分析和溯源。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境微生物分布圖建立

生產(chǎn)車間 B 級、C 級、D 級環(huán)境共 31 個房間和走廊中，共收集并鑒定到24 個種屬的171 株微生物。生產(chǎn)車間A級環(huán)境控制良好，未收集到微生物。其中，葡萄球菌屬和微球菌屬是監(jiān)控到的主要菌屬，每個級別環(huán)境微生物鑒定結(jié)果見表2?？梢?，盡管B 級環(huán)境微生物很少，但B級環(huán)境與無菌生產(chǎn)的A級環(huán)境較接近，應(yīng)高度重視B 級環(huán)境出現(xiàn)菌。C級環(huán)境中葡萄球菌屬占比很高，幾乎每個房間均含有；D 級環(huán)境也以葡萄球菌屬（38.89%）、微球菌屬（24.60%）為主，主要污染微生物還是人員污染菌，并以走廊、清洗室、烘干室及男女更衣室的種類較多。D級環(huán)境中126株微生物分布圖見圖1。

圖1 生產(chǎn)車間D級環(huán)境不同區(qū)域微生物分布圖Fig.1 Microbial distribution in different areas of level-D environment in a workshop

表2 生產(chǎn)車間環(huán)境監(jiān)控微生物鑒定結(jié)果（n=171）Tab.2 Results of environmental microorganism identification in a workshop（n=171）

2.2 溯源分析

企業(yè)中試試驗(yàn)無菌檢查樣品中發(fā)現(xiàn)了陽性樣品，經(jīng)過16srRNA 分離鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus strain（菌種編號為2019085，2019088），與環(huán)境庫中找到的7 株蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus strain（來源見表3）進(jìn)行菌株水平的鑒定，以找到真正的污染源。

表3 環(huán)境中蠟樣芽孢桿菌的來源Tab.3 Sources of Bacillus cereus strain in the environment

由于16srRNA 測序分析無法將蠟樣芽孢桿菌分析到菌株水平，因此采用核糖體分型技術(shù)進(jìn)行溯源分析。選用2 種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分型結(jié)果見圖2?？梢姡肊coRⅠ酶切后，9株菌聚類分析圖譜很相近，基本都在0.95 以上，故此酶無法將這些污染微生物進(jìn)行溯源分析，區(qū)分能力有限；用PvuⅡ酶切，9 株菌可被較好地聚類，樣品污染菌2019085 和2019088 與數(shù)據(jù)庫中的環(huán)境菌2019261 和2019291 聚類到一起，基本達(dá)到0.95的遺傳距離，可認(rèn)為帶型一致，而其他菌的相似度低于0.7，應(yīng)不是同源。故樣品污染菌與環(huán)境菌2019261 和2019291 親緣關(guān)系較近，中試樣品中的污染微生物很可能來源于生產(chǎn)區(qū)B級脫無菌衣室（2019261）或質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室陽性間（2019291）。質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室陽性間的操作是在檢驗(yàn)結(jié)束后，而無菌試驗(yàn)過程全程監(jiān)控未發(fā)現(xiàn)異常，故在質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室污染的可能性不大。在生產(chǎn)區(qū)B 級脫無菌衣室發(fā)現(xiàn)的蠟樣芽孢桿菌與產(chǎn)品生產(chǎn)非常接近，更可能為真正的污染源。

圖2 蠟樣芽孢桿菌EcoRⅠ和PvuⅡ酶切核糖體分型結(jié)果Fig.2 Results of ribotyping of Bacillus cereus strain by EcoRⅠ and Pvu Ⅱ

3 討論

3.1 環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫的建立

所建立的環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫涵蓋了生產(chǎn)的全過程。生產(chǎn)區(qū)是核心部分，主要對生產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了考察，其中葡萄球菌屬是主要的污染菌，B 級、C 級、D 級分別占70.00%，51.43%，38.89%?？梢姡藛T污染是環(huán)境污染的主要原因，與文獻(xiàn)［5-8，10］結(jié)果相似。D級環(huán)境菌種類別相對較多，可能是采樣時(shí)為了擴(kuò)大采集范圍增加了很多表面微生物的采集，因此收集到較多種類的微生物。質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)控主要為污染調(diào)查時(shí)應(yīng)用，當(dāng)出現(xiàn)污染事件時(shí)，要排除試驗(yàn)誤差，客觀掌握無菌環(huán)境中的微生物，才能很好地判定試驗(yàn)結(jié)果。

3.2 溯源分析方法

環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫的主要作用之一是用于溯源分析，當(dāng)出現(xiàn)污染或有可疑結(jié)果時(shí)，可通過數(shù)據(jù)庫對可疑菌進(jìn)行查詢。環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫一般是以基因庫16srRNA 序列庫為基礎(chǔ)，結(jié)果的準(zhǔn)確性全依靠16srRNA的準(zhǔn)確性，受16srRNA 的局限性影響，部分菌種只能將菌鑒定屬水平，無法進(jìn)一步分析。對于環(huán)境微生物中風(fēng)險(xiǎn)不是很高的區(qū)域的微生物，鑒定到屬水平可滿足相關(guān)的監(jiān)管需求［1-2］。當(dāng)需要進(jìn)行溯源分析時(shí)，再將污染微生物從菌種保藏管中取出，采用其他適宜的方法進(jìn)行菌株水平鑒定［11-15］，如核糖體分型、多位點(diǎn)序列分型（MLST）、脈沖場電泳、看家基因和全基因組測序等。每種溯源分析方法針對不同的菌屬均有不同優(yōu)勢，需通過實(shí)驗(yàn)具體分析。本研究中采用核糖分型方法對蠟樣芽孢菌進(jìn)行溯源分析，以及不同酶進(jìn)行酶切，結(jié)果差異大。因此，溯源分析的實(shí)驗(yàn)人員須具有一定的經(jīng)驗(yàn)和技巧。

3.3 風(fēng)險(xiǎn)評估

環(huán)境監(jiān)控需要更多考慮到風(fēng)險(xiǎn)評估風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查的數(shù)據(jù)，以及潛在的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。本研究中D 級應(yīng)當(dāng)是個相對風(fēng)險(xiǎn)較低的區(qū)域，如果D 級區(qū)有A 級層流，就應(yīng)加強(qiáng)重視，D 級區(qū)的菌是否可通過屏障帶入A 級區(qū)域就需進(jìn)行一定的風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查。

3.4 無菌保障

環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫的建立在企業(yè)生產(chǎn)中有很多應(yīng)用［16］，主要用于為企業(yè)溯源分析提供依據(jù)。藥品生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)步驟多，對于無菌藥品更是對環(huán)境控制要求更高，一旦出現(xiàn)污染事件則調(diào)查難度大。隨著監(jiān)管和數(shù)據(jù)完整性要求的加大，建立環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫將成為無菌保障的重要手段，溯源分析能力將成為企業(yè)風(fēng)險(xiǎn)管理的重要能力。