荊防合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

莊會芳 ，徐 麗 ，袁曉梅 ，孫曉蘭 ，劉思延 ，金 鳳 ，范建偉 △

（1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006； 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司·中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 臨沂 276006）

荊防合劑基于荊防敗毒散，經(jīng)現(xiàn)代中藥制藥工藝提取濃縮而成，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡等11 味中藥組方，具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕功效，主治感冒風(fēng)寒諸癥［1］。荊防合劑在新冠肺炎疫情防控中發(fā)揮了積極作用，四川、云南、廣東、新疆等地將荊防敗毒散及其成方制劑列入防治推薦用藥［2］。目前，荊防合劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍為原衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1377-93，僅規(guī)定了制劑的性狀、相對密度及其他通則項檢驗項目，缺乏薄層色譜定性鑒別項和液相色譜含量測定項，難以全面控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。且國內(nèi)荊防合劑的批準(zhǔn)文號較多，市售產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。為確保荊防合劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性和臨床用藥的安全、有效，本研究中采用薄層色譜法對方中川芎、荊芥、羌活、防風(fēng)、柴胡、甘草6 味中藥進(jìn)行定性鑒別，采用雙波長高效液相色譜法對紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷3個指標(biāo)性成分進(jìn)行定量檢測，為提升荊防合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters 公司），配有光電二極管陣列檢測器（PDA）、Empower色譜工作站；TLC Visualizer 2型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；XS105DU 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司，精度為萬分之一）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為450 W，頻率為40 kHz）；H1650 - W 型臺式微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Milli - Q 型超純水儀（美國Millipore 公司）；硅膠G60 薄層板、硅膠G60 F254薄層板（德國Merck公司）。

1.2 試藥

胡薄荷酮對照品（批號為111706 - 201907），升麻素苷對照品（批號為111522-201913），柴胡皂苷d對照品（批號為110778-201912），甘草酸銨對照品（批號為110731-201720），紫花前胡苷對照品（批號為111821-201604，含量以99.6%計），柚皮苷對照品（批號為110722 - 201815，含量以91.7%計），新橙皮苷對照品（批號為111857-201804，含量以99.4%計），川芎對照藥材（批號為120918 - 201813），均購自中國食品藥品檢定研究院；荊防合劑（魯南厚普制藥有限公司，規(guī)格為每支 10 mL，批號分別為 245210081，245210091，245210101，24521012，24521013，24521014，24521015，24521016，24521017，24521018，依次編號為S1-S10）；聚酰胺30-60目（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為F20070411）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

川芎、荊芥：取樣品30 mL，置250 mL 燒瓶中，加水70 mL 和沸石數(shù)粒，連接揮發(fā)油測定器，從測定器上端加水至溢流入燒瓶時為止，再用移液管加入1 mL 乙酸乙酯，連接回流冷凝管［3］，加熱至沸，并保持微沸30 min，放冷，分取乙酸乙酯層，作為供試品溶液。取胡薄荷酮對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。取川芎對照藥材0.5 g，加20 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。再按荊防合劑處方工藝分別制備缺川芎和缺荊芥的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備缺川芎陰性對照品溶液和缺荊芥陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述5種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與川芎對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。再噴以5%香草醛硫酸溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與胡薄荷酮對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

羌活：取樣品10 mL，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，下層水液備用，蒸干乙酸乙酯，殘渣加5 mL 水，上聚酰胺柱（3 g，干法上柱，內(nèi)徑10 mm），以50 mL水洗脫，棄去洗脫液，再以40 mL乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL 使溶解，作為供試品溶液。取紫花前胡苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。再按荊防合劑處方工藝制備缺羌活的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（6∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

防風(fēng)：取羌活項下下層水液，加80 mL 正丁醇，搖勻，用氨試液洗滌3次，每次30 mL，棄去上清液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL 使溶解，作為供試品溶液。取升麻素苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。再按荊防合劑處方工藝制備缺防風(fēng)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）通則0502 項下薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、陰性對照品溶液各20 μL 和對照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇（5∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

柴胡：取樣品10 mL，加乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用氨試液洗滌2 次，每次30 mL，棄去上清液，取乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL 使溶解，再加稀鹽酸2 滴，搖勻，作為供試品溶液。取柴胡皂苷d 對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，再加稀鹽酸2 滴，搖勻，作為對照品溶液。再按荊防合劑的處方工藝制備缺柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2，V/V/V）10 ℃以下靜置的下層溶液為展開劑［4-5］，展開，取出，晾干，噴以5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，于60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 E。

甘草：取樣品10 mL，加5 mL稀鹽酸，超聲處理10 min，離心，棄去上清液，沉淀用10 mL 0.5%碳酸氫銨溶液溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，棄去正丁醇液，下層水液加冰醋酸3 mL，搖勻，再加水飽和的正丁醇溶液振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用0.5 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取甘草酸銨對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。再按荊防合劑的處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯 - 甲酸 - 冰醋酸 - 水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。詳見圖1 F。

2.2 紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

參照2020 年版《中國藥典（四部）通則0512 高效液相色譜法和參考文獻(xiàn)［6 - 9］開展預(yù)試驗，確定如下色譜條件。色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～35 min 時 16%A，35～36 min 時 16%A →90%A，36～44 min 時90%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：336 nm（紫花前胡苷），283 nm（柚皮苷和新橙皮苷）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。在此色譜條件下，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的理論板數(shù)均大于3 000，分離度均大于1.5。

2.2.2 溶液制備

精密吸取荊防合劑2 mL，置50 mL 容量瓶中，用30%甲醇稀釋并定容，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別取紫花前胡苷對照品、柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品16.97，28.59，21.84 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，以50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得各單一成分對照品貯備液。分別精密吸取各單一成分對照品貯備液4，3，3 mL，置同一25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得每1 mL分別含紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷54.08，62.92，52.10 μg 的混合對照品溶液。根據(jù)荊防合劑的處方工藝，分別制備缺羌活的陰性樣品和缺枳殼的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備缺羌活陰性對照品溶液和缺枳殼陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2.2 項下供試品溶液、混合對照品溶液和陰性對照品溶液各5 μL，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，相應(yīng)檢測波長下，供試品溶液、對照品溶液色譜圖中，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷在各自的保留時間處均有吸收峰，且峰形對稱；相應(yīng)陰性對照品溶液色譜圖中，在紫花前胡苷和柚皮苷、新橙皮苷相應(yīng)保留時間處均無吸收峰，表明方法專屬性強(qiáng)，陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2項下單一成分對照品貯備液各適量，依次置相同容量的不同容量瓶中，分別用50%甲醇制備系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。其中，紫花前胡苷的質(zhì)量濃度分別為10.14，20.28，33.80，50.70，67.60，135.20 μg/mL，柚皮苷的質(zhì)量濃度分別為10.49，20.97，52.43，78.64，104.86，157.29 μg/mL，新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為8.68，17.37，34.74，43.42，65.13，86.84 μg/mL。精密吸取上述系列混合對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的回歸方程分別為Y紫=1.319×104X紫-1.773×10（4r=0.999 8），Y柚=9.078 × 103X柚-1.365 × 104（r=0.999 4），Y新=9.719×103X新+8.804×10（3r=0.999 5）。結(jié)果表明，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別在 10.14～135.20 μg/ mL，10.49～157.29 μg/ mL，8.68～86.84 μg/mL范圍內(nèi)與相應(yīng)峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下混合對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.30%，0.31%，0.47%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（編號為S1）供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24 h時按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.50%，0.55%，0.55%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S1）適量，精密稱定，按2.2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為1.48，1.73，1.21 mg/g，結(jié)果的RSD分別為0.71%，0.86%，0.85%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：依次取紫花前胡苷對照品、柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品14.87，18.87，12.13 mg，精密稱定，置同一50 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對照品貯備液（紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的質(zhì)量濃度依次為296.21，346.08，241.14 μg/mL）；精密吸取已知含量的樣品（編號為S1）1 mL，共6份，分別置50 mL 容量瓶中，各精密加入上述混合對照品貯備液5 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取10 批樣品（編號為S1-S10），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，各平行3 份，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算各成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of nodakenin，naringin and neohesperidin in the samples（n = 3）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

本研究在川芎、荊芥的鑒別中，采用蒸餾油法制備供試品溶液，并用同一展開劑分別實(shí)現(xiàn)了川芎（顯色前）和荊芥（顯色后）的定性鑒別；在羌活、防風(fēng)的鑒別中，采用“步進(jìn)式”供試品處理方法，簡化了操作，提高了檢測效率；在柴胡的鑒別中，通過滴加稀鹽酸使柴胡皂苷能有效轉(zhuǎn)化為皂苷元，結(jié)果顯色斑點(diǎn)更清晰、穩(wěn)定，特征性更強(qiáng)；在甘草的鑒別中，結(jié)合大量預(yù)試驗結(jié)果，通過調(diào)節(jié)溶液酸堿性實(shí)現(xiàn)對甘草中甘草酸銨的有效鑒別。

在展開系統(tǒng)的選擇方面，針對羌活的鑒別，因紫花前胡苷為羌活主要活性成分［10］，故以紫花前胡苷為對照，確定三氯甲烷 -甲醇（6∶1，V/V）為展開劑；針對防風(fēng)的鑒別，參考了三氯甲烷 - 甲醇（4∶1，V/V）［11］156、二氯甲烷 - 甲醇 - 甲酸（16∶4∶1，V/V/V）［12］等不同展開系統(tǒng)，最終確定以三氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）為展開劑。

3.2 含量測定

分別考察了乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液和甲醇- 0.2%甲酸水溶液、甲醇- 0.1%磷酸水溶液4 組流動相系統(tǒng)，結(jié)果在乙腈- 0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)下，供試品溶液色譜圖基線平穩(wěn)；相應(yīng)檢測波長下，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷色譜峰的對稱性和分離度均較好，故選用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，以梯度洗脫模式進(jìn)行分析。由于羌活中紫花前胡苷在336 nm 波長處有最大紫外吸收，而枳殼中的柚皮苷、新橙皮苷在283 nm 波長處有最大紫外吸收，故在同一液相色譜條件下，采用雙波長法對這3個指標(biāo)性成分進(jìn)行定量分析，且分離效果良好，陰性對照無干擾。此外，同時測定這3 個指標(biāo)性成分的含量，較單一成分檢測更科學(xué)、合理。

本研究中10 批荊防合劑生產(chǎn)投料所用羌活藥材中，紫花前胡苷含量介于18.59～26.78 mg/ g，平均22.68 mg/g，其成分轉(zhuǎn)移率以80%計，暫定羌活中紫花前胡苷含量的最低限度為18.14 mg/g。所用枳殼藥材中，柚皮苷含量介于40.06～52.75 mg/g，平均46.40 mg/g；新橙皮苷含量介于31.22～39.53 mg/g，平均35.38 mg/g，二者均高于2020年版《中國藥典（一部）》中枳殼項下柚皮苷含量的最低限度40.0 mg/g和新橙皮苷含量的最低限度30.0 mg/g［11］257。結(jié)合 2.2.4 項下含量測定結(jié)果，計算得紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷3 個指標(biāo)性成分含量的轉(zhuǎn)移率分別介于60.05%～86.69%（平均73.37%）、38.43%～50.87%（平均44.65%）、35.26%～37.54%（平均36.40%）。按平均轉(zhuǎn)移率的80%計算，則荊防合劑中紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量下限分別為1.07，1.39，0.85 mg/mL。故暫定本品每1 mL 含紫花前胡苷不得少于1.0 mg，含柚皮苷不得少于1.3 mg，含新橙皮苷不得少于0.8 mg。

3.3 方法評價

本研究中建立的方法操作簡單、結(jié)果可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于荊防合劑的質(zhì)量控制。