地塞米松磷酸鈉注射液仿制制劑與原研制劑有關(guān)物質(zhì)比較*

路愜楠，王 柳，孫 婷，張軼華

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

地塞米松磷酸鈉注射液為人工合成的長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素，是潑尼松龍的氟化衍生物，具有抗炎、抗病毒、抗休克、免疫抑制作用，是搶救危重癥患者不可缺少的急救藥品。由主藥地塞米松磷酸鈉與輔料煙酰胺、無(wú)水亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、依地酸二鈉制成，其中無(wú)水亞硫酸鈉為抗氧劑。目前，已有對(duì)醋酸地塞米松原料藥［1-2］和地塞米松磷酸鈉注射液［3-7］中雜質(zhì)Ⅰ開展的研究。為此，本研究中以原研Aspen公司在英國(guó)上市的地塞米松磷酸鈉注射液為參比制劑，根據(jù)仿制藥一致性評(píng)價(jià)的相關(guān)規(guī)定，采用反向分析技術(shù)，對(duì)標(biāo)原研制劑質(zhì)量。本品變更處方，不再添加抗氧劑亞硫酸鈉，故不存在雜質(zhì)Ⅰ。采用反相高效液相色譜法有效分離主成分與7 個(gè)已知雜質(zhì)A-G，對(duì)仿制制劑和原研制劑的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配有Waters e2695泵、2489型紫外可見光檢測(cè)器、Empower色譜工作站；XPR26/A型電子天平（瑞士梅特勒公司，精度為0.01 g）；KS-7200XDS型超聲儀（昆山潔力美超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

乙酸銨和乙酸均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純，Merck 公司）；試驗(yàn)用水為超純水；地塞米松磷酸酯對(duì)照品（批號(hào)為101116 -201803，含量為99.1%），倍他米松磷酸鈉（雜質(zhì)B）對(duì)照品（批號(hào)為100180-201804，含量為92.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；地塞米松磷酸鈉《歐洲藥典》（EP）系統(tǒng)適用性對(duì)照品［批號(hào)為Y000147（2.0）］，包含地塞米松（雜質(zhì)A）及雜質(zhì)C，D，E，F(xiàn)，G；原研制劑（AspenPharma?TradingLimted，批號(hào)為16083TB23，規(guī)格為3.8 mg∶1 mL）；仿制制劑（批號(hào)分別為2102203，2102204，2102205，規(guī)格為1 mL∶5 mg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C8柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以0.1 mol/L 乙酸銨溶液（用乙酸調(diào)pH 至3.8）-甲醇（65∶35，V/V）為流動(dòng)相A，以0.1 mol/L 乙酸銨溶液（用乙酸調(diào)pH至4.0）-甲醇（30∶70，V/V）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在此色譜條件下的色譜圖見圖1，地塞米松磷酸鈉與各雜質(zhì)分離度良好。理論板數(shù)按地塞米松磷酸鈉峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，雜質(zhì)B 與地塞米松磷酸鈉的分離度應(yīng)不低于1.5。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2 溶液制備

取雜質(zhì)B 對(duì)照品2 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 定容，搖勻，即得雜質(zhì)B 對(duì)照品溶液。取地塞米松磷酸鈉EP系統(tǒng)適用性對(duì)照品（包含雜質(zhì)A，C，D，E，F(xiàn)，G）2 mg，精密稱定，置2 mL 容量瓶中，加上述溶液1 mL，再用流動(dòng)相A 定容，搖勻，即得系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。取樣品適量，加流動(dòng)相A 制成每1 mL 含地塞米松磷酸鈉1 mg 的供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置200 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取雜質(zhì)B 對(duì)照品2.50 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相A 超聲2 min 使溶解并定容，搖勻，作為雜質(zhì)B對(duì)照品貯備液；取地塞米松磷酸酯對(duì)照品2.75 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相A超聲2 min使溶解并定容，搖勻，作為地塞米松磷酸酯對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述對(duì)照品貯備液，用流動(dòng)相分別稀釋制成線性關(guān)系考察溶液。分別精密量取20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果、相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)校正因子Tab.2 Results of the linear relation test，relative retention time and relative correction factors

檢測(cè)限和定量限確定：取對(duì)照品貯備液適量，用流動(dòng)相A逐步稀釋成不同的質(zhì)量濃度，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL。以信噪比（S/N）為3 和10 時(shí)的含量為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果主成分地塞米松磷酸鈉、雜質(zhì)B的檢測(cè)限分別為4 ng和10 ng，定量限分別為12 ng和30 ng。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果地塞米松磷酸鈉、雜質(zhì)B峰面積的RSD分別為0.21%和0.48%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置2，4，8，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣2次，記錄色譜圖。結(jié)果地塞米松磷酸鈉含量的RSD分別為0.33%，0.78%，1.02%，1.13%（n= 2）；雜質(zhì)B 含量的RSD分別為0.53%，0.92%，1.51%，1.63%（n=2），表明供試品溶液室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取地塞米松磷酸酯對(duì)照品及片劑空白輔料，按處方比例制備空白溶液，分別加入高、中、低濃度地塞米松磷酸酯、雜質(zhì)B 對(duì)照品，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法分別計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of the recovery test（n=3）

2.4 仿制制劑和原研制劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)A和B的含量，以自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)C，D，E，F(xiàn)，G 和其他單個(gè)雜質(zhì)。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，以對(duì)照溶液中地塞米松磷酸酯峰面積計(jì)，雜質(zhì)A，B（相對(duì)校正因子1.14），C，D，E，F(xiàn)，G 的含量均不得大于0.5%，其他單個(gè)雜質(zhì)的含量不得過(guò)0.2%，各雜質(zhì)總和不得過(guò)2.0%。仿制制劑和參比制劑高效液相色譜圖見圖2，含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.4 Results of content determination of related substances（%）

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

3 討論

本品主成分為地塞米松磷酸鈉，以地塞米松磷酸酯對(duì)照品進(jìn)行方法學(xué)考察，包括線性關(guān)系考察、檢出限、定量限等，故均以地塞米松酸酯折算為地塞米松磷酸鈉。2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》收載的地塞米松磷酸鈉注射液標(biāo)準(zhǔn)中，將雜質(zhì)Ⅰ作為已知雜質(zhì)控制其含量。也有多篇文獻(xiàn)對(duì)雜質(zhì)Ⅰ的控制方法進(jìn)行研究，且有文獻(xiàn)指出，雜質(zhì)Ⅰ是抗氧劑亞硫酸氫鈉與主成分在高溫下的加成產(chǎn)物［8-9］。經(jīng)與原研制劑比較分析，變更仿制制劑的處方組成后不再添加抗氧劑（亞硫酸鈉），經(jīng)試驗(yàn)分析，未檢出雜質(zhì)Ⅰ，仿制制劑中雜質(zhì)的種類和含量均與原研制劑一致。所建立方法可有效控制仿制制劑中的已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)。

注射劑中除溶劑外，可根據(jù)藥物的理化性質(zhì)加入適宜輔料，如pH 調(diào)節(jié)劑、助溶劑、抗氧劑、抑菌劑等。但地塞米松磷酸鈉注射液中加入抗氧劑后，導(dǎo)致雜質(zhì)Ⅰ的生成，致使主藥藥量減少，嚴(yán)重影響藥物的有效性，且新增雜質(zhì)毒性未知。為保證仿制制劑與原研制劑同等的療效，有必要優(yōu)化處方工藝，并重視藥物與輔料的相容性考察，避免因處方中輔料與主藥配伍不當(dāng)而對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響，甚至對(duì)身體健康造成危害。