基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討蛇床子治療乳腺癌的作用機制

柯昌虎，潘長江，嚴慧，劉佳玲，陳苗，李志浩*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

乳腺癌(breast cancer)多發(fā)生于女性人群中，是由乳腺上皮組織中細胞增殖失控而引起的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與遺傳、炎癥、激素、環(huán)境等諸多作用因素密切相關(guān)。2020年全球乳腺癌新發(fā)病例226萬，占新增癌癥患者的11.7%，躍居全球第一大癌癥[1]。乳腺癌在病變過程中易向全身重要臟器轉(zhuǎn)移，嚴重威脅著女性的生存質(zhì)量和生命安全?，F(xiàn)階段乳腺癌的治療多以手術(shù)切除、放化療、內(nèi)分泌治療等手段為主，免疫治療正在不斷地探索與優(yōu)化[2]，但均存在一定的副作用，產(chǎn)生的抗藥性成為有效治療的主要障礙[3]，加之乳腺癌發(fā)病機制較為復(fù)雜，治療療效方面尚無根本性的突破，情況不容樂觀。

中藥蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實，性溫，味辛、苦[4]，含有香豆素、黃酮、揮發(fā)油等多種成分[5-7]。蛇床子在治療乳腺癌方面具有較好的臨床應(yīng)用前景，多年來，由蛇床子、補骨脂和制附子組成的溫腎壯骨方對轉(zhuǎn)移性乳腺癌具有良好的治療作用[8]；顧氏外科臨證習(xí)用乳寧II號方配伍蛇床子等中藥治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者[9]；劉勝教授認為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移當(dāng)扶正祛邪，溫腎壯骨，多用蛇床子等中藥組方補腎生髓、壯骨通陽[10]。研究發(fā)現(xiàn)，香豆素類成分蛇床子素是蛇床子抗乳腺癌的作用成分之一[11-13]。由于蛇床子成分多樣，加之實驗研究的局限性，目前其抗乳腺癌的分子機制尚無系統(tǒng)報道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以揭示中藥治療相關(guān)疾病的生物活性成分及分子機制，反映出中藥多成分、多靶點的作用關(guān)系，從整體水平解釋中藥的有效性和科學(xué)性[14-15]，與分子對接相結(jié)合有助于藥效物質(zhì)的明確以及藥物功效的闡釋[16]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討蛇床子防治乳腺癌的相關(guān)靶點及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 蛇床子活性成分及作用靶點的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/index.php)和文獻查閱，收集蛇床子的活性成分及靶點，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[17-18]，并結(jié)合文獻記載補充活性成分[11-13]。將活性成分的靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)，去掉非來自“Homo sapiens”物種的靶點并進行基因名稱轉(zhuǎn)換。

1.2 乳腺癌疾病相關(guān)靶點的篩選

以乳腺癌“breast cancer”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)中篩選乳腺癌相關(guān)靶點，將GeneCards中相關(guān)性評分大于15的基因與OMIM中的基因合并去重，得到乳腺癌的靶點。

1.3 活性成分-疾病共有靶點的篩選

在Venn在線平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)upload lists項下分別錄入蛇床子與乳腺癌的靶點，在Provide name for list項下分別命名“蛇床子靶點”和“乳腺癌靶點”，點擊“Submit”，導(dǎo)出維恩圖，并獲取藥物與疾病的共有靶點。

1.4 藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.7.2軟件，上傳蛇床子-成分-乳腺癌-靶點相關(guān)數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer工具以節(jié)點度值(degree)為拓撲指標對網(wǎng)絡(luò)進行分析。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(不同的形狀)代表藥物、有效成分、乳腺癌、靶點等，邊代表藥物-有效成分、有效成分-靶點、乳腺癌-靶點等兩兩之間的相互作用。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING在線平臺數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)中上傳共有靶點，限定物種為“Homo sapiens”進行分析，選擇交互作用大于0.4的靶點，保存TSV格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction， PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析及可視化

在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中上傳靶點，選擇物種為“Homo sapiens”，進行基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。以P<0.05進行篩選，探討蛇床子抗乳腺癌的生物學(xué)過程和信號途徑。

1.7 分子對接

從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載化合物分子(配體)的2D結(jié)構(gòu)sdf格式，PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取核心靶點(受體)對應(yīng)的蛋白三維結(jié)構(gòu)pdb格式。使用AutoDock軟件對配體進行調(diào)整電荷、判斷root等，對受體進行加氫、計算電荷、設(shè)定原子類型等，分別將配體及受體格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，再進行對接并獲取結(jié)合能計算結(jié)果，使用PyMOL軟件對成分-蛋白對接結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子主要活性成分及作用靶點

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到蛇床子化學(xué)成分114個，經(jīng)篩選獲取活性成分19個。盡管蛇床子素(DL=0.13)低于篩選標準，但多篇文獻指出蛇床子素對乳腺癌具有顯著的防治效果[19-20]，因此將其納入活性成分列表中，20個成分數(shù)據(jù)信息見表1。再通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取成分的作用靶點，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫篩選處理，共得到80個對應(yīng)靶點。

表1 經(jīng)口服生物利用度和類藥性篩選的蛇床子活性成分信息

表1(續(xù))

2.2 疾病靶點及共有靶點的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選與乳腺癌相關(guān)的靶點，取相關(guān)性評分大于15的靶點，與OMIM數(shù)據(jù)庫中篩選的乳腺癌靶點合并去重，共獲取1 530個靶點。將80個成分靶點和1 530個疾病靶點進行匹配分析，共得到19個共有靶點，維恩圖見圖1。

圖1 蛇床子與乳腺癌的維恩圖Fig.1 Venn diagram of the target of Cnidii Fructus and breast cancer

2.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，繪制藥物-成分-靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。網(wǎng)絡(luò)中共有38個節(jié)點，82條邊，平均度值為2.705，大于平均度值的成分有9個，其中排名前4位的是β-谷甾醇(degree=10)、(E)-2,3-bis(2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl)acrolein(degree=6)、豆甾醇(degree=6)、蛇床子素(degree=6)，可能為蛇床子治療乳腺癌的關(guān)鍵活性成分。連接線越多的圖形，越能直觀反映關(guān)鍵節(jié)點信息。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中錄入共有靶點，選取置信度>0.4的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，去掉2個游離靶點，在Cytoscape 3.7.2軟件中制作蛇床子治療乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2。其中排名前4位的靶點依次是HSP90AA1(degree=10)、JUN(degree=10)、PRKACA(degree=9)、KDR(degree=8)，可能在治療乳腺癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.5 GO功能分析結(jié)果

運用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析，以P<0.05為篩選條件，結(jié)果有103條生物學(xué)過程，其中生物過程(biological process，BP)68條、細胞組分(celluar component，CC)16條和分子功能(molecular function，MF)19條，選擇前20個條目進行氣泡圖展示，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3。BP主要涉及ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、線粒體細胞色素C的釋放等，CC主要涉及細胞質(zhì)膜、軸突、細胞表面等，MF主要涉及激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等。結(jié)果表明蛇床子可以通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮抗癌作用。

2.6 KEGG通路分析結(jié)果

進行KEGG分析，取P<0.05，蛇床子抗乳腺癌的靶點涉及的通路共56條，選擇排位靠前的20條信號通路進行氣泡圖展示，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4。主要有癌癥通路、結(jié)腸直腸癌、癌癥的蛋白聚糖、粘著斑、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、安非他明成癮、乙型肝炎、雌激素信號通路等信號通路。由DAVID 6.8平臺富集得到程度較高的PI3K-Akt信號通路，涉及GSK3B、HSP90AA1、BCL2、KDR、PRKCA、MET、PIK3CG等7個靶點，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5。

2.7 分子對接結(jié)果

根據(jù)PPI的分析結(jié)果，從PDB數(shù)據(jù)庫中提取前四位靶點(HSP90AA1、JUN、PRKACA、KDR)的蛋白三維結(jié)構(gòu)，將其分別與配體β-谷甾醇(A)、(E)-2,3-bis(2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl)acrolein(B)、豆甾醇(C)、蛇床子素(D)進行分子對接，結(jié)合能見表2，結(jié)合能小于0，表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能小于-20.92 kJ/mol表示可以形成穩(wěn)定的對接結(jié)構(gòu)[21]。其中HSP90AA1與β-谷甾醇、豆甾醇，PRKACA與β-谷甾醇、(E)-2,3-bis(2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl)acrolein、豆甾醇，KDR與β-谷甾醇、豆甾醇均可以產(chǎn)生較強的結(jié)合。

表2 活性成分與靶點受體蛋白間的結(jié)合能

以4個活性成分與PRKACA的分子對接結(jié)果進行展示，見圖2。靶點PRKACA與成分A可以通過氨基酸殘基LYS-105、GLU-121、TYR-122、GLN-176產(chǎn)生氫鍵相互作用(圖2a)，與成分B可以通過氨基酸殘基HIS158、TRP-211、GLY-193、ASN-216、ILE-163產(chǎn)生氫鍵相互作用(圖2b)，與成分C可以通過氨基酸殘基PHE-100、VAL-123、TYR-122、ALA-124產(chǎn)生氫鍵相互作用(圖2c)，與成分D可以通過氨基酸殘基TYR-122、HIS-68、GLY-66產(chǎn)生氫鍵相互作用(圖2d)。

圖2 分子對接圖Fig.2 Diagrams representing the interaction of molecular docking

3 討論

乳腺癌在中醫(yī)學(xué)上歸屬于“乳巖”“乳石癰”“乳疳”等范疇，“癌毒”貫穿于乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移整個過程，“癌毒”殘存是導(dǎo)致其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要因素[22]。乳腺癌病癥整體屬虛、局部屬實，腎陽虧虛、陰寒凝聚，易于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，治療當(dāng)扶正祛邪，溫腎壯骨[8]。蛇床子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，歸腎經(jīng)，是中醫(yī)常用補腎壯陽藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，蛇床子具有抗乳腺癌及其并發(fā)癥的作用[23-27]。由于蛇床子化學(xué)成分復(fù)雜，對乳腺癌作用的分子機制仍有待明晰。本研究就蛇床子抗乳腺癌的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機制進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

以生物利用度和類藥性為考察指標，最終從蛇床子中篩選出β-谷甾醇、(E)-2,3-bis(2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl)acrolein、豆甾醇、蛇床子素等共17個抗乳腺癌活性成分。其中β-谷甾醇、豆甾醇屬于植物甾體固醇類成分，均具有抗乳腺癌的活性，β-谷甾醇對雌激素受體α(ERα)有抑制或誘導(dǎo)作用，可以通過ER介導(dǎo)調(diào)節(jié)Cyclin D1蛋白與mRNA水平的表達，從而影響ER陽性人乳腺癌T47D細胞增殖活性和細胞周期，發(fā)揮植物雌激素樣作用[28]。豆甾醇具有細胞毒性作用，可以抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。透明質(zhì)酸-阿霉素-豆甾醇制成植物脂質(zhì)體(HA-DOX-STS)，對表達不同水平CD44受體的乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞及其異種移植瘤模型具有抗腫瘤活性[29]。蛇床子素能有效抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)啟動子和酶活性，對乳腺癌細胞遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用[30]；還可以激活促凋亡蛋白Bax誘導(dǎo)凋亡，調(diào)節(jié)人乳腺癌細胞信號蛋白Akt和ERK1/2的磷酸化，誘導(dǎo)激活JNK蛋白介導(dǎo)的細胞凋亡[31]。

經(jīng)蛇床子活性成分和乳腺癌靶點交集篩選出HSP90AA1、JUN、PRKACA、KDR等共19個靶點基因。其中熱休克蛋白(HSP)在細胞中作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、轉(zhuǎn)運等過程，成為乳腺癌治療中有價值的潛在分子靶點。HSP90分為HSP90α(HSP90AA1)和HSP90β(HSP90AB1)，兩者同源性高達84%，乳腺腫瘤患者的血漿中HSP90AA1水平較高，血漿HSP90AA1結(jié)合其他標志物可預(yù)測乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，可以作為乳腺癌疾病和轉(zhuǎn)移風(fēng)險評價指標[32]。c-Jun是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(AP-1)的一個組成部分，c-Jun多數(shù)情況下在乳腺癌浸潤侵襲過程活化，并與增殖和血管生成有關(guān)[33]，有望成為乳腺癌治療的潛在靶點[34]。蛋白質(zhì)激酶環(huán)磷酸腺苷激活催化亞基α(PRKACA)是蛋白激酶A(PKA)的催化亞基之一，研究發(fā)現(xiàn)雌激素和抗雌激素藥物可以通過GPER1/PRKACA/CMA通路，使MORC2不被溶酶體分解，從而參與雌激素誘發(fā)乳腺癌細胞繁殖和內(nèi)分泌耐藥，通過靶向藥物阻斷該通路，有可能同時防止乳腺癌生長和內(nèi)分泌耐藥[35]。血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR2，KDR)是蛋白酪氨酸激酶(PTK)家族成員。研究表明VEGFR2蛋白在三陰性乳腺癌中高表達，其陽性表達與患者的組織學(xué)分級、臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，可以作為三陰性乳腺癌新的評價指標[36]。

經(jīng)GO功能分析獲取ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、細胞質(zhì)膜、細胞質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合等103條生物學(xué)過程。經(jīng)KEGG通路分析獲取癌癥途徑、癌癥的蛋白聚糖、粘著斑、PI3K-Akt等56條通路，表明蛇床子可以激活上述通路，并通過多條通路對乳腺癌產(chǎn)生作用。其中PI3K-Akt信號通路在細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、凋亡等方面起著重要的調(diào)節(jié)功能，在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)異常激活，主要表現(xiàn)為PTEN活性缺失、PIK3CA基因激活突變以及AKT失調(diào)，其過度激活還與HER2陽性乳腺癌BT474細胞抗HER2治療耐藥相關(guān)[37]。最后，基于分子對接對活性成分和靶點作用關(guān)系進行驗證，結(jié)果顯示配體與受體可以通過氫鍵作用力進行結(jié)合。

綜上所述，蛇床子的有效成分可以經(jīng)多個途徑對乳腺癌產(chǎn)生作用。本研究對蛇床子抗乳腺癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、關(guān)鍵靶點和信號通路進行預(yù)測分析，建立蛇床子-成分-靶點-乳腺癌網(wǎng)絡(luò)圖，多角度探索蛇床子治療乳腺癌的潛在作用機制，通過調(diào)控相關(guān)生物學(xué)過程和信號通路而發(fā)揮其抗癌功效，并基于分子對接模擬分子與靶點之間可能的作用。本研究為蛇床子抗乳腺癌機制研究提供了理論依據(jù)，其預(yù)測結(jié)果有待于進一步的實驗驗證。