• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接研究丹參治療漿細胞性乳腺炎的作用機制

    2022-12-19 10:49:00潘伍亮張姜宇許春燕曾熠潘宗宇游元元
    山東科學 2022年6期
    關(guān)鍵詞:丹參靶點通路

    潘伍亮,張姜宇,許春燕,曾熠,潘宗宇,游元元

    (成都醫(yī)學院 藥學院,四川成都 610500)

    漿細胞性乳腺炎(plasma cell mastitis,PCM)亦稱乳腺導管擴張癥,是以導管擴張、導管周圍炎癥及漿細胞浸潤為基礎(chǔ)的一種乳腺慢性非細菌性炎癥,臨床表現(xiàn)為乳頭溢液,乳暈下腫塊、乳房局部疼痛不適,化膿潰破后易反復發(fā)作形成瘺管, 經(jīng)久難愈[1-2]。目前西醫(yī)治療以藥物和手術(shù)為主,但藥物治療效果不盡如人意,而手術(shù)切除則不僅會影響乳房外觀,還有較高的復發(fā)率[3-4]。中醫(yī)將PCM歸于乳癰的范疇之內(nèi),認為該病為肝氣郁結(jié)、血瘀凝聚所致[5],治療手段有以中藥復方為主的內(nèi)治法,也有包括引流法、墊棉法、箍圍法等的外治法[6]。

    在PCM的內(nèi)治法中丹參使用頻率較高[7]。國家級名中醫(yī)周玉朱教授的經(jīng)驗方——丹參化瘀湯對此病有良好的治療效果[8],消乳散結(jié)湯、蒲公英柴胡湯、柴芩消癰湯等臨床治療PCM的方劑中亦含有丹參。五代時期典籍《日華子本草》記載丹參具排膿止痛、生肌長肉之功效,后世本草對該功效多有記載;宋代劉明之在《圖經(jīng)本草藥性總論》中記載了丹參具有排膿止痛、治惡瘡疥蘚的功效;明代李中梓在《醫(yī)案必讀》《頤生微論》《本草通玄》等多部著作中均強調(diào)了丹參散結(jié)的作用;《本草綱目》丹參項下則記載了以丹參為君藥治療婦人乳癖的方劑。

    丹參所含化合物甚多[9],但治療PCM的物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。目前對于丹參的研究多集中在心腦血管疾病的治療或預(yù)防方面,對PCM 的治療機制研究甚少?;诖?,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接分析丹參中有效成分對PCM的作用機制,以期為丹參治療PCM的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 獲取丹參的藥物活性成分及其潛在作用靶點

    以“丹參”為關(guān)鍵詞,在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ,TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)中搜尋丹參的有效化學成分[10-11],根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫得到的篩選結(jié)果,設(shè)置篩選條件藥物口服生物利用度(oral relative bioavailability,OB)≥30%,設(shè)置類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18[12-15]。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中找到并下載藥物活性成分潛在靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫( https://www.uniprot.org/)對查詢到的藥物活性成分靶點進行靶點蛋白和基因信息校正,得到丹參有效成分的預(yù)測靶點。

    1.2 構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

    將1.1篩選得到的丹參的所有有效活性化合物及其對應(yīng)的靶點導入Cytoscape3.7.2軟件中,構(gòu)建得到中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò),確定合適的分析條件,分析得到丹參的主要活性化合物及主要作用靶點。

    1.3 篩選PCM的疾病靶點并構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

    利用GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫( https://www.disgenet.org/),搜集PCM的相關(guān)靶點基因,對GeneCard數(shù)據(jù)庫取 Score值大于中位數(shù)的靶點作為PCM的潛在靶點[16],對DisGeNET數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選條件為相關(guān)系數(shù)(Relevance score)≥1,限定研究物種為人類,對兩數(shù)據(jù)庫篩選出的疾病靶點進行整合去重,并剔除潛在致病靶點中在人體乳腺細胞內(nèi)不表達的基因靶點,得到PCM的高關(guān)聯(lián)性靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將查詢到的疾病靶點轉(zhuǎn)換為UniProt ID,通過BioinfoGP數(shù)據(jù)庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools.html)的在線工具Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關(guān)靶點基因取交集,得到丹參治療PCM關(guān)鍵靶點[17]。并使用1.2得到的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)與PCM的高關(guān)聯(lián)性靶點相映射,利用Cytoscape3.7.2軟件將結(jié)果可視化,構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

    1.4 交集治療靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

    蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)是指從生物體內(nèi)各種作用角度研究蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。將潛在治療靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),選擇中置信度(minimum required interaction score=0.150)選項,構(gòu)建交集治療靶點的PPI網(wǎng)絡(luò),導出數(shù)據(jù)于Cytoscapoe3.7.2軟件中分析。了解潛在治療靶點的互作信息,以degree值確定其中相對重要的靶點。

    1.5 靶點的基因本體功能富集分析

    將篩選得到的潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),以p≤0.05為篩選條件,選定研究條件限定為人類,進行基因本體( gene ontology, GO)生物過程、細胞組成、分子功能富集,并分析數(shù)據(jù)得到GO功能富集圖。

    1.6 靶點的KEGG通路富集分析

    利用DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8、Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.htm)和KEGG API數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/rest/)進行京都基因與基因組百科全書 ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集,探究丹參作用于PCM可能的生物功能和信號通路。對于每個給定的基因列表,通路和過程富集分析使用以下本體來源進行:KEGG Pathway、Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、CORUM、DisGeNET、PaGenBase、Transcription factor target、TRRUST、PANTHER Access和WikiPathways分析?;蚪M中的所有基因都被用作富集背景,利用KEGG API數(shù)據(jù)庫對所有潛在基因組的表達通路進行篩選。根據(jù)P(P< 0.01)[18]、最小計數(shù)為3 且富集因子> 1.5(富集因子是觀察到的計數(shù)與偶然預(yù)期的計數(shù)之間的比率)收集靶點基因,并根據(jù)其成員相似性將其分組到集群中。使用Cytoscape3.7.2對數(shù)據(jù)進行可視化網(wǎng)絡(luò)分析[19],將其中每個節(jié)點代表一個作用靶點基因,以P大小著色,將Cytoscape3.7.2得到的視圖網(wǎng)絡(luò)與Metascape數(shù)據(jù)庫得到的基因列表分析報告結(jié)果進行對比,得到PCM可能的生物功能和信號通路。

    1.7 分子對接

    為進一步確認潛在疾病治療靶點與丹參有效成分的作用關(guān)系,選擇潛在作用靶點互作程度排名前三的編碼蛋白,在Protein Data Banks(PDB數(shù)據(jù)庫)(https://www.rcsb.org/)上查找其作用三維結(jié)構(gòu),保留為PDB格式,使用autodock4.0軟件(基于Python語言-使用Python3.7軟件)與丹參主要活性化合物進行分子對接。以對接成功的蛋白和分子的結(jié)合自由能作為判斷方式,若結(jié)合自由能最強,則兩者親和力越大,越有可能實現(xiàn)分子與蛋白相互作用。

    2 結(jié)果

    2.1 丹參主要活性成分和相關(guān)靶點

    通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共得到丹參活性化合物丹參65種,其中可結(jié)合靶點的有效成分共計59種,部分丹參有效活性成分見表1(全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1)。同時通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到丹參潛在作用靶點132個。

    表1 部分丹參活性成分

    2.2 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    基于Cytoscape3.7.2軟件分析結(jié)果,得到丹參的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-A), 網(wǎng)絡(luò)共計191個節(jié)點,其中活性成分59個,藥物靶點132個,含有961條邊。以度值(degree)(可體現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中交互能力大小)作為判斷依據(jù)??傻媚鹃夭菟氐亩戎底畲鬄?4,其次依次為丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、丹參酮,其度值分別為40、38、36、34。說明這5種藥物成分為丹參中作用靶點較多的重要活性成分。

    2.3 篩選PCM潛在致病靶點構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

    由GeneCard數(shù)據(jù)庫以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜集整合的PCM的相關(guān)靶點基因,經(jīng)過篩選,共有125個靶點與PCM相關(guān)聯(lián)。將所有篩選得到的疾病靶點與丹參有效活性成分作用靶點相映射,得到藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-B)。Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關(guān)靶點基因取交集,得到丹參治療PCM關(guān)鍵靶點分析網(wǎng)絡(luò)并繪制Venn 圖(圖1),分析結(jié)果得到潛在治療靶點共有10個,分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3。其中PGR、NR3C1、BCL2L1等3個基因度值最高,分別為8、7、3,且其發(fā)生作用分子多為丹參的有效成分。

    圖1 丹參成分靶點與PCM疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn Diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma component ingredient targets and PCM disease targets

    2.4 構(gòu)建潛在治療靶點PPI

    根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果(圖2),利用Cytoscape7.2.0分析其數(shù)據(jù),可知此網(wǎng)絡(luò)圖共10個節(jié)點,42條邊,平均節(jié)點度值為8.4。依據(jù)度值排名,前4名分別為BCL2L1、IL-6、ICAM1和PGR,說明這4個靶點具有更強的交互作用,對疾病的影響更大。經(jīng)過進一步文獻[20-23]篩選確定,丹參對PCM治療的作用靶點主要為IL-6、ICAM1和PGR。

    圖2 潛在作用靶點PPIFig.2 PPI network of potential target

    2.5 GO功能富集分析

    利用DAVID數(shù)據(jù)庫對10個潛在治療基因進行富集分析,得到14個生物過程(biological process,BP)、9個細胞組成(cell composition,CC)、6個分子功能(molecular function,MF),具體結(jié)果見分析圖(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-C)。其中生物過程主要涉及細胞對藥物反應(yīng)的調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、趨化因子的正向調(diào)控、MAP激酶活性陽性調(diào)控等;細胞成分主要為細胞質(zhì)、外側(cè)質(zhì)膜,細胞核等;分子功能主要分為細胞因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、 RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)序列特異性 DNA 結(jié)合等。

    2.6 KEGG通路富集分析

    KEGG通路富集分析結(jié)果篩選得到16條信號轉(zhuǎn)導通路,包括乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等,有關(guān)于PCM以及乳腺癌的通路共計兩條;第一條,通過直接影響Her-2或其他間接因素,放大PI3K激活PI3K信號通路,影響細胞增殖、存活、翻譯等生物過程,進而影響細胞分裂周期和細胞生物學過程,誘發(fā)炎癥或癌變;第二條,Jagged或Delta通過影響Notch,使Notch信號通路的Her-2過度表達,Her-2/neu在某些乳腺癌和卵巢癌細胞表面過度表達[24],是乳腺癌變的標志??傮w結(jié)果見圖3。對關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)進行分析[25],通過對富集因子、P值及參與調(diào)控通路上的基因數(shù)進行綜合富集通路分析,得到各潛在靶點對生物生理功能的調(diào)節(jié)過程,結(jié)果按照P值大小著色(-logP>10著深橙色,6<-logP<10著橙色,-logP<6著淡橙色)繪制疾病靶點基因KEGG通路富集分析圖,見圖4。

    注:相關(guān)信號通路采用紫色標記。圖3 丹參有效成分與乳腺癌及炎癥信號通路的相關(guān)靶點示意圖Fig.3 Schematic diagram of the relevant targets of the active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and the breast cancer and inflammation signaling pathways

    注:按照P值大小著色,-log P>10著深橙色,6<-log P<10著橙色,-log P<6著淡橙色。圖4 疾病靶點基因KEGG通路富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of the enrichment analysis of disease target genes KEGG pathway

    2.7 分子對接結(jié)果

    為了進一步驗證上述篩選的關(guān)鍵成分與重要靶點的準確性,取藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中度值前五的有效活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌與篩選出的潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、PGR、ICAM1的靶點蛋白進行相互結(jié)合實驗,以結(jié)合自由能作為篩選條件,結(jié)果15次對接嘗試均獲得成功,其結(jié)果均小于0,且結(jié)合自由能都在-8.368~-20.627 12 kJ/mol范圍內(nèi),其中木樨草素與3種蛋白分子對接后結(jié)合自由能最小(圖5),分別為-16.275 76 kJ/mol(圖5(a))、-18.325 92 kJ/mol(圖5(b))及-20.627 12 kJ/mol(圖5(c)),由分子對接結(jié)果可知木樨草素與疾病靶點結(jié)合最為容易且穩(wěn)定。說明木樨草素可能是治療PCM疾病過程中一個重要的活性成分,這就為進一步的研究提供了理論依據(jù)。

    圖5 木樨草素與基因的分子對接圖Fig.5 Molecular docking map of luteolin and the gene

    3 討論與結(jié)論

    本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法研究了丹參治療PCM的活性成分,并識別出其中關(guān)鍵的靶點及其調(diào)控的 KEGG 通路和GO生物學過程。

    通過構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)以及分子對接驗證,顯示丹參的活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌與潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、P6GR、ICAM1靶點基因?qū)?yīng)的蛋白確有分子結(jié)合的可能。其中,木樨草素可與6個潛在治療靶點(BCL2L1、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6)產(chǎn)生相互作用,提示木樨草素可能在PCM治療過程中發(fā)揮重要作用。此外,丹參酮ⅡA、隱丹參酮、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌、丹參酮因能與較多的疾病靶點交互,初步推測其可能在治療PCM中發(fā)揮一定作用。

    通過將丹參活性成分靶點與PCM靶點映射后,得到10個潛在治療靶點,分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3,值得后續(xù)深入研究。其中NR3C1、PGR在10個潛在基因靶點中互作的丹參活性成分最多,同時也是degree值最高的兩個基因,提示二者的靶點與丹參有效成分交互作用最強。對潛在治療靶點構(gòu)成的PPI進行分析,可得到互作程度居于前兩位的靶點基因PGR(NR3C3)、IL-6。其中IL-6可介導IL-6產(chǎn)生,IL-6是由活化的單核巨噬細胞、B細胞等細胞分泌產(chǎn)生,是人體內(nèi)促炎細胞因子和抗炎性肌細胞因子[26],IL-6作為抗炎細胞因子的作用是通過其對TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的活化來介導的[27],并通過一系列生物效應(yīng)從而刺激人體免疫應(yīng)答[28],臨床將其作為一個PCM的重要指標[29],也有研究表明外界因素是通過IL-6/JAK2/STAT3途徑誘發(fā)PCM[30],故丹參可能通過抑制此途徑發(fā)揮治療作用。PGR基因是編碼類固醇受體超家族的一個成員,負責編碼蛋白質(zhì)介導孕酮的生理效應(yīng)。孕酮在妊娠有關(guān)的生殖事件中起著核心作用,是否與PCM相關(guān)需要進一步研究[31-34]。

    GO富集分析表明丹參可能的作用機制為調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞對藥物反應(yīng)、增加一氧化氮在體內(nèi)的含量、介導產(chǎn)生趨化因子、激活并加強MAP激酶活性、增強IL-6受體的拮抗等,KEGG富集分析表明丹參也可能是通過乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等對PCM進行治療。而在NF-κB通路中,若藥物能抑制NF-κB活性,便可抑制細胞因子TNF-α,作為PCM另一關(guān)鍵指標TNF-α,藥物若能降低其在病灶的表達水平,則此藥物對PCM就具有良好治療效果[35-36],說明此通路是丹參作用于PCM的一條作用通路。通過對NF-κB通路的分析,側(cè)面反映了丹參也可能通過上述其余通路作用于PCM。

    綜上所述,中藥丹參治療PCM是通過多成分、多靶點、多途徑共同調(diào)控的結(jié)果。本研究初步揭示了其治療PCM的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機制。在的后續(xù)研究中,將對本研究篩選的關(guān)鍵靶點和信號通路進行體內(nèi)外的實驗驗證。

    猜你喜歡
    丹參靶點通路
    丹參“收獲神器”效率高
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點
    丹參葉干燥過程中化學成分的動態(tài)變化
    中成藥(2019年12期)2020-01-04 02:02:46
    丹參葉片在快速生長期對短期UV-B輻射的敏感性
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:12
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    心力衰竭的分子重構(gòu)機制及其潛在的治療靶點
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認識
    氯胺酮依賴腦內(nèi)作用靶點的可視化研究
    同位素(2014年2期)2014-04-16 04:57:16
    国产在视频线精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产亚洲精品一区二区www| 1000部很黄的大片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产v大片淫在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品国产亚洲在线| 美女黄网站色视频| 日韩欧美精品免费久久 | 日本熟妇午夜| 99国产极品粉嫩在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲国产欧美网| 免费在线观看影片大全网站| 波多野结衣高清作品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲人成网站在线播| 久久久久久久久中文| 午夜两性在线视频| 一区二区三区激情视频| 婷婷丁香在线五月| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 男女午夜视频在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产黄色小视频在线观看| x7x7x7水蜜桃| 香蕉久久夜色| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av第一区精品v没综合| 美女高潮的动态| 午夜日韩欧美国产| 男女午夜视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产美女午夜福利| 欧美日本视频| 丁香欧美五月| 日本免费a在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人精品一区二区免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 极品教师在线免费播放| 老司机午夜福利在线观看视频| 香蕉久久夜色| 日本 av在线| 免费搜索国产男女视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 日本熟妇午夜| 久久精品国产清高在天天线| 欧美乱妇无乱码| 国产 一区 欧美 日韩| 日本成人三级电影网站| 亚洲av成人av| 午夜激情欧美在线| 99久久成人亚洲精品观看| 99久国产av精品| 久久久久久久午夜电影| 综合色av麻豆| 欧美黑人巨大hd| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产探花在线观看一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 欧美日韩国产亚洲二区| 两个人视频免费观看高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本黄色片子视频| 久久久国产成人精品二区| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲精品成人久久久久久| www.999成人在线观看| 有码 亚洲区| 天美传媒精品一区二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 禁无遮挡网站| 日本黄色片子视频| 亚洲av五月六月丁香网| 免费高清视频大片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产色婷婷99| 手机成人av网站| 国内精品美女久久久久久| 日韩免费av在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 国产欧美日韩一区二区三| 免费看十八禁软件| 中文字幕av在线有码专区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美一区二区亚洲| 精品午夜福利视频在线观看一区| 一级黄色大片毛片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 很黄的视频免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日本一二三区视频观看| 中文字幕高清在线视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 在线播放无遮挡| 成人三级黄色视频| 午夜老司机福利剧场| 黑人欧美特级aaaaaa片| 悠悠久久av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 国内精品一区二区在线观看| 日韩欧美三级三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 又黄又粗又硬又大视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 哪里可以看免费的av片| 99久国产av精品| 国产黄片美女视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲最大成人中文| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产探花极品一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 麻豆成人av在线观看| 国产三级中文精品| 久久久久久久久久黄片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产探花在线观看一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久午夜亚洲精品久久| 国产成人啪精品午夜网站| 国产伦在线观看视频一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 黄片小视频在线播放| а√天堂www在线а√下载| bbb黄色大片| 九色国产91popny在线| 香蕉久久夜色| 午夜福利高清视频| 日韩欧美三级三区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 看免费av毛片| 国产精品亚洲一级av第二区| eeuss影院久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| a在线观看视频网站| 美女高潮的动态| 成人精品一区二区免费| 日本黄色视频三级网站网址| 久9热在线精品视频| 桃红色精品国产亚洲av| 中出人妻视频一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜两性在线视频| 国产高清激情床上av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 好男人在线观看高清免费视频| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲色图av天堂| 91av网一区二区| 综合色av麻豆| 在线观看日韩欧美| 日韩大尺度精品在线看网址| 在线观看免费视频日本深夜| 在线视频色国产色| 亚洲无线在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 丰满的人妻完整版| 日韩av在线大香蕉| 色综合欧美亚洲国产小说| 内射极品少妇av片p| 日韩欧美精品v在线| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 国产综合懂色| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 天天添夜夜摸| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲在线自拍视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成人午夜高清在线视频| 国产69精品久久久久777片| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 五月玫瑰六月丁香| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美一级毛片孕妇| 无限看片的www在线观看| 国产三级在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 午夜免费激情av| 欧美国产日韩亚洲一区| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲精品在线观看二区| 有码 亚洲区| 日韩有码中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 女同久久另类99精品国产91| av欧美777| 日本免费a在线| aaaaa片日本免费| 性欧美人与动物交配| a级一级毛片免费在线观看| 悠悠久久av| 国产黄a三级三级三级人| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲人成网站高清观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 黄色女人牲交| 日韩高清综合在线| 国产精品一区二区免费欧美| 全区人妻精品视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲在线观看片| 不卡一级毛片| 少妇的逼好多水| 欧美日韩国产亚洲二区| 我的老师免费观看完整版| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 高清毛片免费观看视频网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产高清三级在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本 av在线| 亚洲黑人精品在线| 桃色一区二区三区在线观看| 免费av观看视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 99riav亚洲国产免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲专区国产一区二区| www.色视频.com| 最近最新免费中文字幕在线| 婷婷丁香在线五月| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 少妇丰满av| 夜夜爽天天搞| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国语自产精品视频在线第100页| 搡老岳熟女国产| 十八禁网站免费在线| 99在线视频只有这里精品首页| 久久国产精品人妻蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| 一区福利在线观看| 亚洲五月天丁香| 精品久久久久久久久久久久久| 国内精品一区二区在线观看| 免费看a级黄色片| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲五月婷婷丁香| 日本在线视频免费播放| 99热只有精品国产| 亚洲黑人精品在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品国产自在天天线| 国产伦人伦偷精品视频| 美女 人体艺术 gogo| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 99热这里只有精品一区| 99久久九九国产精品国产免费| 99久久精品热视频| 一本久久中文字幕| 免费观看精品视频网站| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美精品免费久久 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品国产高清国产av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 嫩草影院入口| av黄色大香蕉| 网址你懂的国产日韩在线| 午夜免费观看网址| 久久性视频一级片| 国产色婷婷99| 午夜福利在线在线| 国产精品三级大全| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 男女午夜视频在线观看| 两个人视频免费观看高清| 高清在线国产一区| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品,欧美在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 制服人妻中文乱码| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久久久大av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 麻豆成人av在线观看| 国产精品三级大全| 久久久久性生活片| 亚洲午夜理论影院| 欧美av亚洲av综合av国产av| 嫩草影院入口| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 偷拍熟女少妇极品色| 婷婷丁香在线五月| 一级黄色大片毛片| 国产一区二区在线av高清观看| 免费在线观看亚洲国产| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 观看免费一级毛片| 在线观看av片永久免费下载| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲av不卡在线观看| 九九在线视频观看精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 伊人久久精品亚洲午夜| 18禁国产床啪视频网站| 久久久国产成人免费| 伊人久久精品亚洲午夜| 在线免费观看的www视频| 久久久久性生活片| h日本视频在线播放| 久久香蕉国产精品| 久久草成人影院| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 露出奶头的视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 真人做人爱边吃奶动态| 五月伊人婷婷丁香| 毛片女人毛片| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费在线观看亚洲国产| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 长腿黑丝高跟| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| a在线观看视频网站| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品影院久久| 99国产综合亚洲精品| 在线播放国产精品三级| 欧美+亚洲+日韩+国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产高清三级在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产成人影院久久av| 成人一区二区视频在线观看| 美女大奶头视频| 国产淫片久久久久久久久 | 美女高潮的动态| 亚洲人成网站高清观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 青草久久国产| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 叶爱在线成人免费视频播放| 99热这里只有是精品50| www日本黄色视频网| 在线观看免费午夜福利视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品国产清高在天天线| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美激情在线99| 精品国内亚洲2022精品成人| 91av网一区二区| 亚洲人与动物交配视频| 欧美日韩综合久久久久久 | www.熟女人妻精品国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美日本视频| 久久久久久久久大av| 女人被狂操c到高潮| 成人av一区二区三区在线看| 18美女黄网站色大片免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产主播在线观看一区二区| 日韩有码中文字幕| av天堂中文字幕网| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲五月天丁香| 香蕉久久夜色| www.999成人在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产高清有码在线观看视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜a级毛片| 国产视频内射| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 免费观看人在逋| 色综合婷婷激情| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美黄色淫秽网站| 精品一区二区三区人妻视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 日本一本二区三区精品| 男女午夜视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本成人三级电影网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩有码中文字幕| 免费看光身美女| 一级作爱视频免费观看| 校园春色视频在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 嫩草影院入口| 午夜日韩欧美国产| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一进一出抽搐动态| 国产精品99久久久久久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 天堂影院成人在线观看| 久久精品国产自在天天线| 99热6这里只有精品| 国产一区二区三区视频了| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美乱色亚洲激情| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| xxx96com| av欧美777| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久香蕉精品热| 日本 欧美在线| 757午夜福利合集在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| xxx96com| 丰满的人妻完整版| 在线看三级毛片| www日本在线高清视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲色图av天堂| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品久久久久久成人av| av国产免费在线观看| 很黄的视频免费| 我的老师免费观看完整版| 男人的好看免费观看在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久精品大字幕| 黄片小视频在线播放| 亚洲人成网站在线播| 午夜免费成人在线视频| 一本久久中文字幕| 国语自产精品视频在线第100页| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99久久精品一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产高清三级在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99久久成人亚洲精品观看| 国产一区在线观看成人免费| 国产69精品久久久久777片| 国产精品99久久99久久久不卡| 69人妻影院| 成人永久免费在线观看视频| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲国产欧美网| 九色成人免费人妻av| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩乱码在线| 日本熟妇午夜| 亚洲av熟女| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美 国产精品| av女优亚洲男人天堂| 一区二区三区高清视频在线| 成年人黄色毛片网站| 身体一侧抽搐| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文亚洲av片在线观看爽| 中亚洲国语对白在线视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 757午夜福利合集在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品国产高清国产av| 香蕉av资源在线| svipshipincom国产片| 久久这里只有精品中国| 99久久成人亚洲精品观看| 久久久久久久久大av| 久久人妻av系列| 香蕉av资源在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美大码av| www.999成人在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| avwww免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品日产1卡2卡| 国产不卡一卡二| 亚洲av不卡在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 日本三级黄在线观看| av欧美777| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产高清激情床上av| svipshipincom国产片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成年人精品一区二区| 中文字幕久久专区| 床上黄色一级片| av专区在线播放| 嫩草影院精品99| 欧美+日韩+精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美一区二区亚洲| 国产精品亚洲美女久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99久久综合精品五月天人人| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品456在线播放app | 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产精品999在线| 91麻豆av在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久人妻av系列| 国产成人福利小说| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 我要搜黄色片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 夜夜爽天天搞| 一区二区三区激情视频| tocl精华| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产69精品久久久久777片| eeuss影院久久| 国产高清videossex| 99热只有精品国产| 成人欧美大片| or卡值多少钱| 国产精品国产高清国产av| 男插女下体视频免费在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 又粗又爽又猛毛片免费看| 两人在一起打扑克的视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美色欧美亚洲另类二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 88av欧美| 在线国产一区二区在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久香蕉精品热| 可以在线观看的亚洲视频| 村上凉子中文字幕在线| 欧美中文综合在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 在线国产一区二区在线| 岛国在线免费视频观看| 国产视频一区二区在线看|