• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接研究丹參治療漿細胞性乳腺炎的作用機制

    2022-12-19 10:49:00潘伍亮張姜宇許春燕曾熠潘宗宇游元元
    山東科學 2022年6期
    關(guān)鍵詞:丹參靶點通路

    潘伍亮,張姜宇,許春燕,曾熠,潘宗宇,游元元

    (成都醫(yī)學院 藥學院,四川成都 610500)

    漿細胞性乳腺炎(plasma cell mastitis,PCM)亦稱乳腺導管擴張癥,是以導管擴張、導管周圍炎癥及漿細胞浸潤為基礎(chǔ)的一種乳腺慢性非細菌性炎癥,臨床表現(xiàn)為乳頭溢液,乳暈下腫塊、乳房局部疼痛不適,化膿潰破后易反復發(fā)作形成瘺管, 經(jīng)久難愈[1-2]。目前西醫(yī)治療以藥物和手術(shù)為主,但藥物治療效果不盡如人意,而手術(shù)切除則不僅會影響乳房外觀,還有較高的復發(fā)率[3-4]。中醫(yī)將PCM歸于乳癰的范疇之內(nèi),認為該病為肝氣郁結(jié)、血瘀凝聚所致[5],治療手段有以中藥復方為主的內(nèi)治法,也有包括引流法、墊棉法、箍圍法等的外治法[6]。

    在PCM的內(nèi)治法中丹參使用頻率較高[7]。國家級名中醫(yī)周玉朱教授的經(jīng)驗方——丹參化瘀湯對此病有良好的治療效果[8],消乳散結(jié)湯、蒲公英柴胡湯、柴芩消癰湯等臨床治療PCM的方劑中亦含有丹參。五代時期典籍《日華子本草》記載丹參具排膿止痛、生肌長肉之功效,后世本草對該功效多有記載;宋代劉明之在《圖經(jīng)本草藥性總論》中記載了丹參具有排膿止痛、治惡瘡疥蘚的功效;明代李中梓在《醫(yī)案必讀》《頤生微論》《本草通玄》等多部著作中均強調(diào)了丹參散結(jié)的作用;《本草綱目》丹參項下則記載了以丹參為君藥治療婦人乳癖的方劑。

    丹參所含化合物甚多[9],但治療PCM的物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。目前對于丹參的研究多集中在心腦血管疾病的治療或預(yù)防方面,對PCM 的治療機制研究甚少?;诖?,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接分析丹參中有效成分對PCM的作用機制,以期為丹參治療PCM的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 獲取丹參的藥物活性成分及其潛在作用靶點

    以“丹參”為關(guān)鍵詞,在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ,TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)中搜尋丹參的有效化學成分[10-11],根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫得到的篩選結(jié)果,設(shè)置篩選條件藥物口服生物利用度(oral relative bioavailability,OB)≥30%,設(shè)置類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18[12-15]。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中找到并下載藥物活性成分潛在靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫( https://www.uniprot.org/)對查詢到的藥物活性成分靶點進行靶點蛋白和基因信息校正,得到丹參有效成分的預(yù)測靶點。

    1.2 構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

    將1.1篩選得到的丹參的所有有效活性化合物及其對應(yīng)的靶點導入Cytoscape3.7.2軟件中,構(gòu)建得到中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò),確定合適的分析條件,分析得到丹參的主要活性化合物及主要作用靶點。

    1.3 篩選PCM的疾病靶點并構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

    利用GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫( https://www.disgenet.org/),搜集PCM的相關(guān)靶點基因,對GeneCard數(shù)據(jù)庫取 Score值大于中位數(shù)的靶點作為PCM的潛在靶點[16],對DisGeNET數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選條件為相關(guān)系數(shù)(Relevance score)≥1,限定研究物種為人類,對兩數(shù)據(jù)庫篩選出的疾病靶點進行整合去重,并剔除潛在致病靶點中在人體乳腺細胞內(nèi)不表達的基因靶點,得到PCM的高關(guān)聯(lián)性靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將查詢到的疾病靶點轉(zhuǎn)換為UniProt ID,通過BioinfoGP數(shù)據(jù)庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools.html)的在線工具Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關(guān)靶點基因取交集,得到丹參治療PCM關(guān)鍵靶點[17]。并使用1.2得到的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)與PCM的高關(guān)聯(lián)性靶點相映射,利用Cytoscape3.7.2軟件將結(jié)果可視化,構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

    1.4 交集治療靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

    蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)是指從生物體內(nèi)各種作用角度研究蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。將潛在治療靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),選擇中置信度(minimum required interaction score=0.150)選項,構(gòu)建交集治療靶點的PPI網(wǎng)絡(luò),導出數(shù)據(jù)于Cytoscapoe3.7.2軟件中分析。了解潛在治療靶點的互作信息,以degree值確定其中相對重要的靶點。

    1.5 靶點的基因本體功能富集分析

    將篩選得到的潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),以p≤0.05為篩選條件,選定研究條件限定為人類,進行基因本體( gene ontology, GO)生物過程、細胞組成、分子功能富集,并分析數(shù)據(jù)得到GO功能富集圖。

    1.6 靶點的KEGG通路富集分析

    利用DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8、Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.htm)和KEGG API數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/rest/)進行京都基因與基因組百科全書 ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集,探究丹參作用于PCM可能的生物功能和信號通路。對于每個給定的基因列表,通路和過程富集分析使用以下本體來源進行:KEGG Pathway、Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、CORUM、DisGeNET、PaGenBase、Transcription factor target、TRRUST、PANTHER Access和WikiPathways分析?;蚪M中的所有基因都被用作富集背景,利用KEGG API數(shù)據(jù)庫對所有潛在基因組的表達通路進行篩選。根據(jù)P(P< 0.01)[18]、最小計數(shù)為3 且富集因子> 1.5(富集因子是觀察到的計數(shù)與偶然預(yù)期的計數(shù)之間的比率)收集靶點基因,并根據(jù)其成員相似性將其分組到集群中。使用Cytoscape3.7.2對數(shù)據(jù)進行可視化網(wǎng)絡(luò)分析[19],將其中每個節(jié)點代表一個作用靶點基因,以P大小著色,將Cytoscape3.7.2得到的視圖網(wǎng)絡(luò)與Metascape數(shù)據(jù)庫得到的基因列表分析報告結(jié)果進行對比,得到PCM可能的生物功能和信號通路。

    1.7 分子對接

    為進一步確認潛在疾病治療靶點與丹參有效成分的作用關(guān)系,選擇潛在作用靶點互作程度排名前三的編碼蛋白,在Protein Data Banks(PDB數(shù)據(jù)庫)(https://www.rcsb.org/)上查找其作用三維結(jié)構(gòu),保留為PDB格式,使用autodock4.0軟件(基于Python語言-使用Python3.7軟件)與丹參主要活性化合物進行分子對接。以對接成功的蛋白和分子的結(jié)合自由能作為判斷方式,若結(jié)合自由能最強,則兩者親和力越大,越有可能實現(xiàn)分子與蛋白相互作用。

    2 結(jié)果

    2.1 丹參主要活性成分和相關(guān)靶點

    通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共得到丹參活性化合物丹參65種,其中可結(jié)合靶點的有效成分共計59種,部分丹參有效活性成分見表1(全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1)。同時通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到丹參潛在作用靶點132個。

    表1 部分丹參活性成分

    2.2 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    基于Cytoscape3.7.2軟件分析結(jié)果,得到丹參的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-A), 網(wǎng)絡(luò)共計191個節(jié)點,其中活性成分59個,藥物靶點132個,含有961條邊。以度值(degree)(可體現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中交互能力大小)作為判斷依據(jù)??傻媚鹃夭菟氐亩戎底畲鬄?4,其次依次為丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、丹參酮,其度值分別為40、38、36、34。說明這5種藥物成分為丹參中作用靶點較多的重要活性成分。

    2.3 篩選PCM潛在致病靶點構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

    由GeneCard數(shù)據(jù)庫以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜集整合的PCM的相關(guān)靶點基因,經(jīng)過篩選,共有125個靶點與PCM相關(guān)聯(lián)。將所有篩選得到的疾病靶點與丹參有效活性成分作用靶點相映射,得到藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-B)。Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關(guān)靶點基因取交集,得到丹參治療PCM關(guān)鍵靶點分析網(wǎng)絡(luò)并繪制Venn 圖(圖1),分析結(jié)果得到潛在治療靶點共有10個,分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3。其中PGR、NR3C1、BCL2L1等3個基因度值最高,分別為8、7、3,且其發(fā)生作用分子多為丹參的有效成分。

    圖1 丹參成分靶點與PCM疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn Diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma component ingredient targets and PCM disease targets

    2.4 構(gòu)建潛在治療靶點PPI

    根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果(圖2),利用Cytoscape7.2.0分析其數(shù)據(jù),可知此網(wǎng)絡(luò)圖共10個節(jié)點,42條邊,平均節(jié)點度值為8.4。依據(jù)度值排名,前4名分別為BCL2L1、IL-6、ICAM1和PGR,說明這4個靶點具有更強的交互作用,對疾病的影響更大。經(jīng)過進一步文獻[20-23]篩選確定,丹參對PCM治療的作用靶點主要為IL-6、ICAM1和PGR。

    圖2 潛在作用靶點PPIFig.2 PPI network of potential target

    2.5 GO功能富集分析

    利用DAVID數(shù)據(jù)庫對10個潛在治療基因進行富集分析,得到14個生物過程(biological process,BP)、9個細胞組成(cell composition,CC)、6個分子功能(molecular function,MF),具體結(jié)果見分析圖(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-C)。其中生物過程主要涉及細胞對藥物反應(yīng)的調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、趨化因子的正向調(diào)控、MAP激酶活性陽性調(diào)控等;細胞成分主要為細胞質(zhì)、外側(cè)質(zhì)膜,細胞核等;分子功能主要分為細胞因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、 RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)序列特異性 DNA 結(jié)合等。

    2.6 KEGG通路富集分析

    KEGG通路富集分析結(jié)果篩選得到16條信號轉(zhuǎn)導通路,包括乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等,有關(guān)于PCM以及乳腺癌的通路共計兩條;第一條,通過直接影響Her-2或其他間接因素,放大PI3K激活PI3K信號通路,影響細胞增殖、存活、翻譯等生物過程,進而影響細胞分裂周期和細胞生物學過程,誘發(fā)炎癥或癌變;第二條,Jagged或Delta通過影響Notch,使Notch信號通路的Her-2過度表達,Her-2/neu在某些乳腺癌和卵巢癌細胞表面過度表達[24],是乳腺癌變的標志??傮w結(jié)果見圖3。對關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)進行分析[25],通過對富集因子、P值及參與調(diào)控通路上的基因數(shù)進行綜合富集通路分析,得到各潛在靶點對生物生理功能的調(diào)節(jié)過程,結(jié)果按照P值大小著色(-logP>10著深橙色,6<-logP<10著橙色,-logP<6著淡橙色)繪制疾病靶點基因KEGG通路富集分析圖,見圖4。

    注:相關(guān)信號通路采用紫色標記。圖3 丹參有效成分與乳腺癌及炎癥信號通路的相關(guān)靶點示意圖Fig.3 Schematic diagram of the relevant targets of the active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and the breast cancer and inflammation signaling pathways

    注:按照P值大小著色,-log P>10著深橙色,6<-log P<10著橙色,-log P<6著淡橙色。圖4 疾病靶點基因KEGG通路富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of the enrichment analysis of disease target genes KEGG pathway

    2.7 分子對接結(jié)果

    為了進一步驗證上述篩選的關(guān)鍵成分與重要靶點的準確性,取藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中度值前五的有效活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌與篩選出的潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、PGR、ICAM1的靶點蛋白進行相互結(jié)合實驗,以結(jié)合自由能作為篩選條件,結(jié)果15次對接嘗試均獲得成功,其結(jié)果均小于0,且結(jié)合自由能都在-8.368~-20.627 12 kJ/mol范圍內(nèi),其中木樨草素與3種蛋白分子對接后結(jié)合自由能最小(圖5),分別為-16.275 76 kJ/mol(圖5(a))、-18.325 92 kJ/mol(圖5(b))及-20.627 12 kJ/mol(圖5(c)),由分子對接結(jié)果可知木樨草素與疾病靶點結(jié)合最為容易且穩(wěn)定。說明木樨草素可能是治療PCM疾病過程中一個重要的活性成分,這就為進一步的研究提供了理論依據(jù)。

    圖5 木樨草素與基因的分子對接圖Fig.5 Molecular docking map of luteolin and the gene

    3 討論與結(jié)論

    本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法研究了丹參治療PCM的活性成分,并識別出其中關(guān)鍵的靶點及其調(diào)控的 KEGG 通路和GO生物學過程。

    通過構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)以及分子對接驗證,顯示丹參的活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌與潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、P6GR、ICAM1靶點基因?qū)?yīng)的蛋白確有分子結(jié)合的可能。其中,木樨草素可與6個潛在治療靶點(BCL2L1、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6)產(chǎn)生相互作用,提示木樨草素可能在PCM治療過程中發(fā)揮重要作用。此外,丹參酮ⅡA、隱丹參酮、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌、丹參酮因能與較多的疾病靶點交互,初步推測其可能在治療PCM中發(fā)揮一定作用。

    通過將丹參活性成分靶點與PCM靶點映射后,得到10個潛在治療靶點,分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3,值得后續(xù)深入研究。其中NR3C1、PGR在10個潛在基因靶點中互作的丹參活性成分最多,同時也是degree值最高的兩個基因,提示二者的靶點與丹參有效成分交互作用最強。對潛在治療靶點構(gòu)成的PPI進行分析,可得到互作程度居于前兩位的靶點基因PGR(NR3C3)、IL-6。其中IL-6可介導IL-6產(chǎn)生,IL-6是由活化的單核巨噬細胞、B細胞等細胞分泌產(chǎn)生,是人體內(nèi)促炎細胞因子和抗炎性肌細胞因子[26],IL-6作為抗炎細胞因子的作用是通過其對TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的活化來介導的[27],并通過一系列生物效應(yīng)從而刺激人體免疫應(yīng)答[28],臨床將其作為一個PCM的重要指標[29],也有研究表明外界因素是通過IL-6/JAK2/STAT3途徑誘發(fā)PCM[30],故丹參可能通過抑制此途徑發(fā)揮治療作用。PGR基因是編碼類固醇受體超家族的一個成員,負責編碼蛋白質(zhì)介導孕酮的生理效應(yīng)。孕酮在妊娠有關(guān)的生殖事件中起著核心作用,是否與PCM相關(guān)需要進一步研究[31-34]。

    GO富集分析表明丹參可能的作用機制為調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞對藥物反應(yīng)、增加一氧化氮在體內(nèi)的含量、介導產(chǎn)生趨化因子、激活并加強MAP激酶活性、增強IL-6受體的拮抗等,KEGG富集分析表明丹參也可能是通過乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等對PCM進行治療。而在NF-κB通路中,若藥物能抑制NF-κB活性,便可抑制細胞因子TNF-α,作為PCM另一關(guān)鍵指標TNF-α,藥物若能降低其在病灶的表達水平,則此藥物對PCM就具有良好治療效果[35-36],說明此通路是丹參作用于PCM的一條作用通路。通過對NF-κB通路的分析,側(cè)面反映了丹參也可能通過上述其余通路作用于PCM。

    綜上所述,中藥丹參治療PCM是通過多成分、多靶點、多途徑共同調(diào)控的結(jié)果。本研究初步揭示了其治療PCM的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機制。在的后續(xù)研究中,將對本研究篩選的關(guān)鍵靶點和信號通路進行體內(nèi)外的實驗驗證。

    猜你喜歡
    丹參靶點通路
    丹參“收獲神器”效率高
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點
    丹參葉干燥過程中化學成分的動態(tài)變化
    中成藥(2019年12期)2020-01-04 02:02:46
    丹參葉片在快速生長期對短期UV-B輻射的敏感性
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:12
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    心力衰竭的分子重構(gòu)機制及其潛在的治療靶點
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認識
    氯胺酮依賴腦內(nèi)作用靶點的可視化研究
    同位素(2014年2期)2014-04-16 04:57:16
    xxx大片免费视频| 熟女av电影| 国产不卡av网站在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 九草在线视频观看| 欧美丝袜亚洲另类| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 色5月婷婷丁香| 国产精品99久久99久久久不卡 | 男女无遮挡免费网站观看| 五月天丁香电影| 亚洲精品国产色婷婷电影| av在线观看视频网站免费| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人影院久久| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| av黄色大香蕉| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 只有这里有精品99| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品婷婷| 国产高清不卡午夜福利| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲av免费高清在线观看| 多毛熟女@视频| 草草在线视频免费看| 九九在线视频观看精品| 91成人精品电影| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久久精品性色| 99久久综合免费| 欧美性感艳星| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久国产一区二区| 亚洲av男天堂| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜福利,免费看| 日本欧美视频一区| 欧美丝袜亚洲另类| 国产亚洲精品久久久com| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精品色激情综合| 哪个播放器可以免费观看大片| 男女免费视频国产| 久久久国产精品麻豆| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜影院在线不卡| 亚洲美女搞黄在线观看| 青春草国产在线视频| 五月天丁香电影| a级毛片黄视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 高清av免费在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一区在线观看完整版| 91国产中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品酒店卫生间| 另类亚洲欧美激情| 日本欧美视频一区| 韩国精品一区二区三区 | 精品国产一区二区三区四区第35| 妹子高潮喷水视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 青春草视频在线免费观看| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩一区二区三区影片| 日韩欧美精品免费久久| 人妻人人澡人人爽人人| 丰满少妇做爰视频| 综合色丁香网| 国产精品一区二区在线不卡| 免费av中文字幕在线| 丰满乱子伦码专区| 视频中文字幕在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 大陆偷拍与自拍| 久久久欧美国产精品| 国产淫语在线视频| 一级爰片在线观看| 国产又爽黄色视频| 丁香六月天网| 自线自在国产av| 丝袜在线中文字幕| 9191精品国产免费久久| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 青春草亚洲视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 精品久久久久久电影网| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品,欧美精品| 一级,二级,三级黄色视频| 交换朋友夫妻互换小说| 母亲3免费完整高清在线观看 | 高清不卡的av网站| 国产亚洲最大av| 美女国产视频在线观看| 国产极品天堂在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费观看在线日韩| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲中文av在线| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 十分钟在线观看高清视频www| av片东京热男人的天堂| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本av免费视频播放| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产永久视频网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产av精品麻豆| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99国产综合亚洲精品| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲人成77777在线视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 永久免费av网站大全| 伊人亚洲综合成人网| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 只有这里有精品99| 亚洲精品视频女| 美女大奶头黄色视频| 日本午夜av视频| 国产 一区精品| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久伊人网av| 久久久亚洲精品成人影院| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 女人精品久久久久毛片| 少妇人妻 视频| 亚洲av男天堂| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 久久热在线av| 久久ye,这里只有精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品久久久久久久电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 满18在线观看网站| 久久国产精品大桥未久av| av有码第一页| 黄色一级大片看看| 国产伦理片在线播放av一区| 国产亚洲一区二区精品| 性色avwww在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 免费日韩欧美在线观看| 最近手机中文字幕大全| 国产片内射在线| 大香蕉97超碰在线| 免费观看性生交大片5| 国产欧美亚洲国产| 亚洲,欧美精品.| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品不卡视频一区二区| 精品人妻在线不人妻| 日韩在线高清观看一区二区三区| 大香蕉久久网| 免费大片黄手机在线观看| 尾随美女入室| 久久久欧美国产精品| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av电影在线进入| 最近中文字幕2019免费版| 欧美xxⅹ黑人| 伊人亚洲综合成人网| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲av日韩在线播放| 永久免费av网站大全| 国产一区二区三区av在线| 亚洲综合色惰| 久久综合国产亚洲精品| 免费观看性生交大片5| 久久久久久久精品精品| 欧美另类一区| 婷婷色综合www| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲五月色婷婷综合| 性色av一级| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 激情视频va一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 涩涩av久久男人的天堂| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品456在线播放app| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av免费高清在线观看| 水蜜桃什么品种好| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人二区视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲图色成人| 国内精品宾馆在线| 少妇 在线观看| 久久精品久久久久久久性| 啦啦啦啦在线视频资源| 高清欧美精品videossex| 久久久久久久久久久免费av| 我的女老师完整版在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 在线观看三级黄色| 国产黄色免费在线视频| 久久99精品国语久久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲成人av在线免费| videosex国产| 精品熟女少妇av免费看| 久久久久久久久久久久大奶| 国产极品天堂在线| 五月伊人婷婷丁香| 大码成人一级视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 美女内射精品一级片tv| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 男女无遮挡免费网站观看| 波野结衣二区三区在线| 国产有黄有色有爽视频| 满18在线观看网站| 成人手机av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 夫妻午夜视频| 春色校园在线视频观看| 青春草国产在线视频| 亚洲精品456在线播放app| 国产深夜福利视频在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 尾随美女入室| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲三级黄色毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产淫语在线视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 制服人妻中文乱码| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 香蕉精品网在线| 精品一区二区三卡| 熟女av电影| av.在线天堂| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| www.熟女人妻精品国产 | 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品久久久久久精品古装| 秋霞伦理黄片| 国产成人精品福利久久| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 男男h啪啪无遮挡| 午夜91福利影院| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 老熟女久久久| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久av网站| 最近中文字幕2019免费版| 中文天堂在线官网| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日本av手机在线免费观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产69精品久久久久777片| tube8黄色片| 国产伦理片在线播放av一区| 男的添女的下面高潮视频| 成人国产麻豆网| www.熟女人妻精品国产 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 男女下面插进去视频免费观看 | 午夜91福利影院| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品一二三| 全区人妻精品视频| 国产精品国产三级专区第一集| 成人国产麻豆网| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产在视频线精品| 99热这里只有是精品在线观看| 精品亚洲成国产av| 成年动漫av网址| 亚洲成色77777| 一区二区av电影网| 久久精品久久精品一区二区三区| av不卡在线播放| 三上悠亚av全集在线观看| 精品酒店卫生间| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 99热国产这里只有精品6| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费人成在线观看视频色| 欧美精品一区二区大全| 我的女老师完整版在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲国产精品999| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品日本国产第一区| 国产淫语在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品第一国产精品| 久久精品国产综合久久久 | 免费看不卡的av| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品国产av成人精品| 男人舔女人的私密视频| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美国产精品一级二级三级| 美女内射精品一级片tv| 亚洲精品一区蜜桃| 黄色一级大片看看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 丰满乱子伦码专区| 亚洲熟女精品中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av免费在线看不卡| 亚洲综合色网址| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美国产精品一级二级三级| 高清欧美精品videossex| 99热全是精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 丝袜喷水一区| 免费人成在线观看视频色| 黑丝袜美女国产一区| 美女国产视频在线观看| 夫妻午夜视频| 久久影院123| 麻豆乱淫一区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | xxx大片免费视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| xxx大片免费视频| 一区二区av电影网| 搡老乐熟女国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一二三四中文在线观看免费高清| 美女国产视频在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 男女无遮挡免费网站观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产不卡av网站在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久精品久久精品一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 一个人免费看片子| 欧美日韩综合久久久久久| 成人手机av| 久久青草综合色| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲综合精品二区| 少妇熟女欧美另类| h视频一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 春色校园在线视频观看| 免费黄网站久久成人精品| 丝袜在线中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 99热网站在线观看| 亚洲,欧美精品.| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧洲国产日韩| 大香蕉97超碰在线| 在线观看www视频免费| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产又爽黄色视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一级毛片 在线播放| 一本久久精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成年av动漫网址| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久久国产精品麻豆| 香蕉国产在线看| 国产精品女同一区二区软件| 国产乱来视频区| 蜜桃在线观看..| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 涩涩av久久男人的天堂| 九九在线视频观看精品| av一本久久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久欧美国产精品| 国产av精品麻豆| 亚洲av福利一区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人精品婷婷| 免费黄网站久久成人精品| 全区人妻精品视频| 国产精品三级大全| 下体分泌物呈黄色| 精品少妇黑人巨大在线播放| 搡女人真爽免费视频火全软件| 精品少妇内射三级| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产日韩一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久国产精品人妻一区二区| 午夜福利,免费看| freevideosex欧美| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本91视频免费播放| 国产日韩欧美视频二区| 人妻一区二区av| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩视频在线欧美| 午夜日本视频在线| 又黄又粗又硬又大视频| 人妻 亚洲 视频| 香蕉国产在线看| 久久久精品94久久精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产欧美在线一区| 99热6这里只有精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品久久久久久电影网| www日本在线高清视频| videosex国产| 国产一区亚洲一区在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品酒店卫生间| 伦理电影免费视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲高清免费不卡视频| 成年动漫av网址| 婷婷色综合大香蕉| 99久久精品国产国产毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 五月玫瑰六月丁香| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 青青草视频在线视频观看| 国产高清三级在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久韩国三级中文字幕| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 极品人妻少妇av视频| 国产成人aa在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 成人毛片60女人毛片免费| 国产av国产精品国产| 天天影视国产精品| 精品国产一区二区久久| 下体分泌物呈黄色| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品一区蜜桃| 成人黄色视频免费在线看| 我要看黄色一级片免费的| 午夜福利,免费看| av片东京热男人的天堂| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 边亲边吃奶的免费视频| 国产1区2区3区精品| 午夜福利乱码中文字幕| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲成色77777| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲国产成人一精品久久久| 人成视频在线观看免费观看| 久久精品国产综合久久久 | 这个男人来自地球电影免费观看 | 美女中出高潮动态图| 看非洲黑人一级黄片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产一区二区三区av在线| av电影中文网址| 黄色一级大片看看| 少妇的逼好多水| 中文字幕亚洲精品专区| 只有这里有精品99| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产一区二区三区av在线| 在现免费观看毛片| 99国产综合亚洲精品| 久久热在线av| av在线老鸭窝| 久久99蜜桃精品久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本-黄色视频高清免费观看| 91在线精品国自产拍蜜月| a级片在线免费高清观看视频| 国产麻豆69| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久综合国产亚洲精品| 国产色婷婷99| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 热re99久久国产66热| 国产淫语在线视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级毛片 在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 午夜激情av网站| 男人添女人高潮全过程视频| 1024视频免费在线观看| 国产精品人妻久久久影院| √禁漫天堂资源中文www| 毛片一级片免费看久久久久| 韩国av在线不卡| 天天操日日干夜夜撸| 精品少妇久久久久久888优播| 国产淫语在线视频| 精品久久久久久电影网| 免费黄网站久久成人精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久国内精品自在自线图片| 日本黄色日本黄色录像| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日韩电影二区| 亚洲av男天堂| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本免费在线观看一区| 我要看黄色一级片免费的| 国产探花极品一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲精品一区蜜桃| 成人国产av品久久久| 亚洲av.av天堂| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩一本色道免费dvd| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲av.av天堂| 国产日韩欧美在线精品| 各种免费的搞黄视频| av线在线观看网站| 亚洲伊人久久精品综合| 少妇 在线观看| 日本黄大片高清| a 毛片基地| 国产一区二区激情短视频 | 国产成人av激情在线播放| 97在线人人人人妻| av播播在线观看一区| 丝袜脚勾引网站| 亚洲成人av在线免费| 久久青草综合色| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产精品蜜桃在线观看| 1024视频免费在线观看| 韩国高清视频一区二区三区|