超高效液相色譜法測定奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜的含量

馮數(shù)橙， 蔡啟梅， 王濤， 申遼， 高春生

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所， 北京 100850)

奧沙利鉑(化學(xué)名為(1R-反式)-(1，2-環(huán)己二胺-N，N′)[草酸(2-)-O,O′]合鉑，Oxaliplatin)是第三代鉑類抗腫瘤藥物[1]。奧沙利鉑屬細(xì)胞增殖周期非特異性抑制劑，能夠在體內(nèi)水解產(chǎn)生鉑陽離子，鉑陽離子與DNA分子交聯(lián)形成復(fù)合物，從而抑制轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)而抑制腫瘤增殖[2-4]。相對于順鉑而言，奧沙利鉑具有二氨基環(huán)己烷(DACH)基團(tuán)，此基團(tuán)空間位阻較大，使得奧沙利鉑在具有更強(qiáng)抗癌活性的同時(shí)和順鉑沒有交叉耐藥性，并且對機(jī)體的毒副作用更低、安全性更高[5-7]。作為一類廣譜抗腫瘤藥，奧沙利鉑對結(jié)(直)腸癌、非小細(xì)胞癌、卵巢癌、肝癌等均有較顯著作用，是臨床上用于腫瘤治療或腫瘤切除術(shù)后全身化療的一線藥物[8-10]。目前國內(nèi)外已上市多款奧沙利鉑產(chǎn)品，包括Eloxatin、ELPLAT、佳樂同泰、奧正南、艾克博康等，其主要劑型為注射液。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是由乳酸(Lacticacid,LA)以及羥基乙酸(glycolicacid,GA)兩種單體按照一定的比例聚合而成的共聚物，由于其在體內(nèi)能夠被水解，且最終產(chǎn)物為水和二氧化碳，因此PLGA具有良好生物相容性和生物可降解性，是目前應(yīng)用較為廣泛的藥用輔料之一[11-13]。由于PLGA具有良好的藥物控釋性能，被廣泛應(yīng)用于緩釋制劑[14-15]。目前以PLGA作為藥物載體上市的劑型主要包括微球、微粒以及原位凝膠[16]。同時(shí)PLGA在脂質(zhì)體、納米粒等劑型上仍有廣闊的發(fā)展前景[17-19]。

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)為經(jīng)典藥物含量分析方法，但在新藥研發(fā)過程中涉及樣本量極大，使用HPLC進(jìn)行分析時(shí)普遍存在分析耗時(shí)長、通量低以及資源浪費(fèi)的問題[20-21]。目前，奧沙利鉑制劑中的藥物含量測定方法仍以HPLC分析為主。Sun等[22]利用HPLC技術(shù)測定聚合物中奧沙利鉑的含量，主藥出峰時(shí)間在6 min左右分析總時(shí)長在15 min左右。Cevenini等[23]利用HPLC技術(shù)建立了梯度洗脫法測定了奧沙利鉑含量，主藥出峰時(shí)間在6 min左右，分析總時(shí)長在16 min左右。因此，開發(fā)一種簡單、高效、準(zhǔn)確的奧沙利鉑含量測定方法，能夠顯著減少新藥研發(fā)中奧沙利鉑的含量分析時(shí)間，提高研究、分析效率。

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)技術(shù)是在傳統(tǒng)的高效液相色譜基礎(chǔ)上，采用了粒徑更小的顆粒作為填料，使得柱效有了顯著的提升，能夠有效降低藥物檢測時(shí)間，減少耗材成本[24-25]。唐莉華等[26]利用HPLC技術(shù)測定橙皮苷的含量，其出峰時(shí)間在10 min左右。而張丹等[27]利用UPLC技術(shù)測定橙皮苷的含量，出峰時(shí)間僅需5 min左右，檢測時(shí)長縮短一倍。劉荷英等[28]利用HPLC技術(shù)測定了奧美拉唑鈉及其有關(guān)物質(zhì)的含量，其中奧美拉唑鈉的出峰時(shí)間在30 min左右。而Abdel-Gawad等[29]建立了奧美拉唑鈉的UPLC檢測方法，其出峰時(shí)間在15 min左右。相對于HPLC方法，使用UPLC分析能大大縮短藥物檢測時(shí)間，提高藥物檢測的效率。作為一種高效的分析手段，UPLC技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、農(nóng)學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科的分析[30-32]。然而關(guān)于奧沙利鉑的UPLC分析方法，各國標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)中報(bào)道較少，且HPLC方法無法簡單轉(zhuǎn)換以適配UPLC設(shè)備，相關(guān)研究數(shù)據(jù)基礎(chǔ)仍待補(bǔ)充。

現(xiàn)以自制奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜為研究對象，旨在建立以UPLC法為基礎(chǔ)的奧沙利鉑制劑含量測定方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，減少藥物分析的時(shí)間、耗材成本，提升藥物研發(fā)過程中的檢測通量，提高研究效率。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1.2 試劑

自制奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜；奧沙利鉑對照品(上海源葉生物技術(shù)有限公司)；乙酸乙酯(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)；磷酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；1-庚烷磺酸鈉(分析純，安耐吉化學(xué))；娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pad GIST-HP-C18 色譜柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)、流動相：乙腈∶磷酸水溶液=1∶99，其中磷酸水溶液是在1 000 mL中加入0.6 mL 10%的磷酸溶液，每升流動相加入5 mmol的1-庚烷磺酸鈉，并使用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0；柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL，檢測波長：254 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱定奧沙利鉑對照品適量，使用流動相溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取上述對照品儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻線，翻轉(zhuǎn)振蕩均勻，過濾，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制

將自制的奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜溶于1 mL乙酸乙酯中，用流動相定容至100 mL，翻轉(zhuǎn)振蕩均勻，14 000 r/min離心過濾后取上清液，得到奧沙利鉑供試品溶液。

SSD(Single Shot Multi-Box Detector)[7]算法屬于基于回歸類的目標(biāo)檢測算法,區(qū)別于區(qū)域候選類的目標(biāo)檢測算法。SSD算法采用回歸思想,利用不同卷積的特征圖進(jìn)行綜合,直接預(yù)測邊界框的類別和位置;該目標(biāo)檢測算法準(zhǔn)確率較高,檢測速度較快,可滿足實(shí)時(shí)的障礙物檢測需求,但在障礙物目標(biāo)較小時(shí),檢測效果較差。

2.2.3 空白輔料溶液的配制

按照奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜的處方工藝組成，取處方比例的中鏈甘油三酯(MCT)、甘油、PLGA粉末，制備不含奧沙利鉑的緩釋薄膜的空白樣品，按“2.2.2”節(jié)方法制備空白對照溶液。

2.2.4 草酸溶液的配制

精密稱定草酸(奧沙利鉑已知雜質(zhì))對照品適量，使用流動相溶解，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的草酸溶液。使用流動相稀釋10倍，翻轉(zhuǎn)振蕩均勻，過濾，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的草酸溶液。

2.2.5 乙酸乙酯溶液的配制

精密吸取100 μL乙酸乙酯溶液，使用流動相配制，使乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)為1%，翻轉(zhuǎn)振蕩混勻，過濾，得到體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸乙酯溶液。

2.2.6 混合溶液的配制

分別精密稱量草酸和奧沙利鉑適量，精密吸取乙酸乙酯適量，使用流動相溶解，配制成草酸和奧沙利鉑的質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的混合溶液，其中乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)為1%，翻轉(zhuǎn)振蕩均勻，過濾，得到混合溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性

將“2.2.2”節(jié)供試品溶液，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，理論塔板數(shù)按奧沙利鉑計(jì)算為773，拖尾因子為1.267。

2.4 專屬性

將“2.2”節(jié)溶液，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果如圖1所示，PLGA不出峰，并且奧沙利鉑色譜峰能和乙酸乙酯、草酸色譜峰完全分離，說明溶劑以及輔料對奧沙利鉑測定無干擾，并且奧沙利鉑在該色譜條件下能與雜質(zhì)草酸分離開，本方法專屬性強(qiáng)。

圖1 超高效液相色譜圖結(jié)果Fig.1 Graphs of UPLC results

2.5 線性關(guān)系

精密吸取“2.2.1”節(jié)對照品儲備液，依次配制質(zhì)量濃度為1.25、2.5、5、10、50、100 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1”節(jié)色譜條件注入液相色譜儀，重復(fù)測定3次，記錄奧沙利鉑色譜峰的峰面積并計(jì)算其平均值。以對照品質(zhì)量濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，奧沙利鉑質(zhì)量濃度在1.25～100 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，A=6 158.7C+2 199.4，R2=0.999 8。

圖2 奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard linearity of Oxaliplatin

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜，按“2.2.2”節(jié)方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣，記錄奧沙利鉑的峰面積，使用外標(biāo)法計(jì)算奧沙利鉑質(zhì)量濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)(表1)。結(jié)果表明，奧沙利鉑的平均含量為1.00 μg/mL，RSD 為0.87%，表明本方法重復(fù)性良好，滿足測試。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of repeatability test

2.7 中間精密度試驗(yàn)

取同一批奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜，由2名分析人員在不同的日期，按“2.2.2”節(jié)方法各平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”節(jié)色譜條件，分別在安捷倫高效液相色譜儀(型號1200)和島津高效液相色譜儀(LC20AD)上進(jìn)樣，記錄奧沙利鉑峰面積，并以外標(biāo)法計(jì)算其質(zhì)量濃度及其RSD值(表2)。結(jié)果顯示，奧沙利鉑的平均質(zhì)量濃度為98.96%，RSD 為0.70%，表明本方法中間精密度良好。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of intermediate precision test

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜，按“2.2.2”節(jié)下方法制備供試品溶液，室溫下存放，分別于0、2、4、6、8、10 h取樣，按“2.1”節(jié)下色譜條件進(jìn)樣，測定奧沙利鉑的峰面積，計(jì)算其RSD值(表3)。結(jié)果顯示，奧沙利鉑峰面積的RSD為1.18%，表明供試品溶液中奧沙利鉑在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability test

2.8.1 回收率試驗(yàn)

按照奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜處方組成，按配比稱取不含奧沙利鉑的輔料，以標(biāo)示量的80%、100% 和120% 水平添加奧沙利鉑對照品，每個(gè)水平平行添加3 份，按“2.2.2”節(jié)下方法制備試驗(yàn)溶液并使用液相色譜儀測定，記錄奧沙利鉑的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算其質(zhì)量濃度及回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，奧沙利鉑的平均回收率分別為99.93%，RSD為1.29%。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 4 Results of recovery test(n=9)

2.8.2 定量下限和檢測下限

精密稱量奧沙利鉑對照品適量，使用流動相逐級稀釋，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比S/N=3計(jì) 確定檢測下限為22.5 ng/mL，以信噪比S/N=10計(jì)，確定定量下限為112.5 ng/mL。結(jié)果表明方法靈敏，滿足試驗(yàn)需求。

2.8.3 樣品含量測定

選取三批自制奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜(奧沙利鉑標(biāo)示量1 mg)，每批薄膜取3片，每片溶于1 mL乙酸乙酯并以流動相定容至100 mL，振蕩均勻，14 000 r/min離心過濾取上清液，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，并以外標(biāo)法進(jìn)行定量。測定結(jié)果見表5。

3 結(jié)論

超高效液相色譜法相比于高效液相色譜法，其所用的色譜柱使用了更小的硅膠顆粒，比表面積更大，分離能力得到增強(qiáng)，分析時(shí)間明顯縮短，有著更高的分析通量。由于色譜柱填充粒子間隙更為致密，UPLC方法對于儀器設(shè)備的壓力上限及精密度要求也更高。近年來隨著中國研究水平的不斷提升，設(shè)備條件的不斷優(yōu)化，UPLC分析方法逐漸為科研工作者所熟知并應(yīng)用，但目前以UPLC為基礎(chǔ)的藥物分析方法仍然較少，亟待優(yōu)化補(bǔ)充。本文建立了以PLGA為基質(zhì)的緩釋載藥薄膜中奧沙利鉑的UPLC含量測定方法。在樣品前處理過程中，選擇了乙酸乙酯作為溶解劑，其優(yōu)勢是能夠快速溶解PLGA并釋放奧沙利鉑，并且乙酸乙酯的色譜峰與奧沙利鉑色譜峰分離良好，不產(chǎn)生干擾。同時(shí)，本方法也能夠有效分離奧沙利鉑以及其主要雜質(zhì)草酸，為制劑穩(wěn)定性等相關(guān)研究提供依據(jù)。以《中國藥典》(2020年版)中規(guī)定HPLC方法進(jìn)行分析，單個(gè)樣品色譜分析時(shí)間約為35 min，而本文所述UPLC方法單個(gè)樣品色譜分析時(shí)間僅為5 min，分析時(shí)長縮短7倍。綜上所述，本文所述UPLC方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、精密、重復(fù)性好，顯著提升了分析效率，節(jié)約了溶劑和分析時(shí)間，符合奧沙利鉑-PLGA緩釋薄膜的含量測定需求，可以為相關(guān)研究提供依據(jù)。