基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討半夏瀉心湯治療胃食管反流病的作用機(jī)制*

羅安，胡佳

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一種食管動(dòng)力障礙性疾病[1]，以燒心和反流為主要臨床表現(xiàn)，其不典型癥狀包括胸痛、上腹部燒灼感、咽中梗阻感等，臨床上常常容易被誤診漏診。一項(xiàng)Meta分析指出，我國部分社區(qū)人群胃食管反流病的患病率為7.69%[2]，但由于現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏和飲食結(jié)構(gòu)的變化，中國GERD的發(fā)生率正逐漸增高。當(dāng)前，西醫(yī)治療GERD主要以質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)或鉀離子競(jìng)爭(zhēng)性酸阻滯劑(potassium-competitive acid blocker，P-CAB)為主，同時(shí)還有促胃動(dòng)力藥、H2受體拮抗劑以及外科手術(shù)治療等[3-5]，但是長(zhǎng)期服用PPI有很多不良反應(yīng)[6-7]。中醫(yī)藥在提高GERD療效、減少不良反應(yīng)以及降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)上有明顯優(yōu)勢(shì)[8-10]。

GERD在古代并無中醫(yī)病名，根據(jù)其癥狀可歸屬“吐酸”“食管癉”“嘈雜”等范疇[11]，半夏瀉心湯是《傷寒論》中的經(jīng)典名方，由半夏、大棗、甘草、干姜、黃芩、黃連、人參等7味中藥組成。方中半夏既能降逆和胃，又能散結(jié)消痞，故為君藥；黃芩、黃連苦寒降胃，干姜溫中散寒，三者合為臣藥；人參、大棗既能防黃芩、黃連苦寒傷陽，又能制約半夏、干姜之辛熱，共為佐藥；甘草補(bǔ)中健脾，調(diào)和諸藥為使藥，全方配伍寒熱并用，辛苦并進(jìn)，補(bǔ)瀉兼施，是治療寒熱錯(cuò)雜型胃食管反流病的代表方[12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，半夏瀉心湯在臨床上治療消化系統(tǒng)疾病十分廣泛，療效顯著，能夠保護(hù)胃黏膜[13]，在治療GERD時(shí)發(fā)揮抗炎、促食管動(dòng)力等作用[14-17]。本研究基于中藥及復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究半夏瀉心湯治療胃食管反流病的分子作用機(jī)制，為后續(xù)的臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 半夏瀉心湯組方中藥活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)分別以半夏瀉心湯組方中藥半夏、大棗、甘草、干姜、黃芩、黃連、人參為檢索詞進(jìn)行檢索，獲得其化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得半夏瀉心湯組方中藥活性成分及其對(duì)應(yīng)的CID號(hào)，并通過PubChem數(shù)據(jù)庫利用CID號(hào)檢索出相對(duì)應(yīng)活性成分的Canonical SMILES碼。將活性成分的Canonical SMILES碼輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(https：//www.swisstargetprediction.ch/)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，篩選出每個(gè)活性成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，將所有標(biāo)準(zhǔn)基因名稱匯總，刪除重復(fù)項(xiàng)，即得到半夏瀉心湯組方中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 GERD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/search)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)中以“gastroesophageal reflux disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，匯總得到的疾病基因名稱，刪除重復(fù)項(xiàng)后獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)的獲取將半夏瀉心湯組方中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與GERD疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖繪制平臺(tái)(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進(jìn)行映射，取交集并將交集結(jié)果導(dǎo)出，即為半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)與所有中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的基因名稱進(jìn)行匹對(duì)，將匹對(duì)結(jié)果匯編成txt文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建“半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選半夏瀉心湯治療GERD的核心活性成分。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)將半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，下載txt文件，處理后導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件，通過軟件中的CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)度中心性(degree centrality，DC)將分析結(jié)果前10%的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)導(dǎo)出，再將其重新導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫得到關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，拓?fù)浞治龊Y選出半夏瀉心湯治療GERD的核心靶點(diǎn)。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，選擇OFFICIAL_GENE_SYMBOL，列表類型選擇Gene List，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。設(shè)定P值<0.01，并根據(jù)P值進(jìn)行排序，通過微生信繪圖平臺(tái)(www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)GO功能富集分析的前20條結(jié)果和KEGG信號(hào)通路富集分析的前10條結(jié)果進(jìn)行繪圖。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證將“半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前且OB值、DL值遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)值的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，通過pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性成分2D結(jié)構(gòu)，通過PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org)獲取靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，利用Chem 3D對(duì)活性成分進(jìn)行優(yōu)化，并在PyMOL軟件中刪除蛋白受體的水分子，運(yùn)用Autodock Vina和Pymol將活性成分受體和靶點(diǎn)蛋白配體進(jìn)行對(duì)接及優(yōu)化制圖。

2 結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯組方中藥活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)基于TCMSP分別以半夏瀉心湯方中半夏、大棗、甘草、干姜、黃芩、黃連、人參為檢索詞進(jìn)行檢索，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，刪除無對(duì)應(yīng)CID號(hào)和Canonical SMILES碼的成分，獲得半夏瀉心湯組方中藥活性成分，其中半夏11個(gè)、大棗17個(gè)、甘草64個(gè)、干姜3個(gè)、黃連13個(gè)、黃芩29個(gè)、人參17個(gè)，刪除重復(fù)成分后得到活性成分140個(gè)，部分活性成分見表1。將140個(gè)活性成分的Canonical SMILES碼輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到1 111個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 GERD疾病相關(guān)靶點(diǎn)在DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“gastroesophageal reflux disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)項(xiàng)后獲得4 176個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)將1 111個(gè)半夏瀉心湯組方中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與4 176個(gè)GERD疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖繪制平臺(tái)(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進(jìn)行映射，得到412個(gè)交集靶點(diǎn)，即為半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

表1 半夏瀉心湯組方中藥部分活性成分相關(guān)信息

圖1 半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將半夏瀉心湯治療GERD的潛在作用靶點(diǎn)與所有中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹對(duì)，將成分與靶點(diǎn)映射匯編成txt文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建“半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)共涉及553個(gè)節(jié)點(diǎn)和 5 115 條邊，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲇?jì)算化合物的度值(degree)，列出度值排名前10位的化合物，結(jié)合表1可以看出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、黃芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、表小檗堿(epiberberine)是幾味中藥的共有成分，且OB值及DL值遠(yuǎn)高于篩選標(biāo)準(zhǔn)值，推測(cè)，槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、山柰酚、豆甾醇、表小檗堿等是半夏瀉心湯治療GERD的核心活性成分。見圖2、表2。

圖2 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 “半夏瀉心湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)度值排名前10位的化合物信息表

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)將篩選得到的412個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，將分析后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件，通過軟件中的CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)度中心性將分析結(jié)果前10%的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)導(dǎo)出，得到42個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，再將其重新導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫得到關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過度值賦予靶點(diǎn)顏色，度值越大則靶點(diǎn)顏色越深，由此推測(cè)靠近圓中心的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、熱休克蛋白90AA1(heat shock proteins 90AA1，HSP90AA1)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、缺氧誘導(dǎo)因子1亞基α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等為半夏瀉心湯治療GERD的核心靶點(diǎn)。見圖3。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析GO功能富集分析包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)3個(gè)方面，將42個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析共得到515個(gè)BP條目、63個(gè)CC條目及93個(gè)MF條目，其中BP主要與基因表達(dá)的正/負(fù)向調(diào)控(positive/negative regulation of gene expression)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路(cytokine-mediated signaling pathway)等過程相關(guān)；CC主要涉及大分子復(fù)合物(macromolecular complexe)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、胞質(zhì)溶膠(cytosol)等；MF主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)等功能。設(shè)置P<0.01，根據(jù)P值排序后，選取排名前20的條目繪制條形圖，見圖4。對(duì)42個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析篩選得到150條信號(hào)通路，主要涉及腫瘤相關(guān)通路(pathways in cancer)、腫瘤中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人類巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等通路，推測(cè)半夏瀉心湯可能通過以上通路發(fā)揮治療胃食管反流病的作用。設(shè)置P<0.01，根據(jù)P值排序后選取排名前10位的條目繪制氣泡圖，見圖5。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO功能富集分析

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路富集分析

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證一般認(rèn)為，結(jié)合能越小，受體與配體之間的活性越強(qiáng)，穩(wěn)定性越高。將篩選得到的核心活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素同時(shí)與關(guān)鍵靶點(diǎn)HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53進(jìn)行“多對(duì)一”分子對(duì)接，結(jié)果顯示，核心成分β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53結(jié)合能均小于-7 kcal·mol-1，結(jié)合穩(wěn)定。見表3，圖6。

表3 半夏瀉心湯核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能 (kcal·mol-1)

注：紅色代表槲皮素；青色代表β-谷甾醇；紫色代表豆甾醇；黃色虛線代表氫鍵

3 討論

GERD是由胃酸、胃蛋白酶、膽汁等反流至食管并損傷食管黏膜產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，炎癥因子是其中一個(gè)重要的因素。GERD患者食管活檢樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-6和IL-8等炎性因子參與胃食管反流病的發(fā)生[18]。阿布拉江·米吉提等[19]指出不僅是白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子和部分趨化因子，自由基同樣也參與了GERD患者食管黏膜的損傷，且自由基水平越高，損傷程度越嚴(yán)重。

β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素是半夏瀉心湯組方中藥中幾種中藥的共同成分，且OB值、DL值較篩選標(biāo)準(zhǔn)值高，度值大，故認(rèn)為這三者為半夏瀉心湯治療GERD的核心活性成分。β-谷甾醇具有多種藥理作用，其作用之一就是抗炎。β-谷甾醇可明顯減少胸膜滲出量及中性粒細(xì)胞[20]。Liao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可通過降低細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-8的水平抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活，從而減少炎癥的發(fā)生和細(xì)胞損傷。豆甾醇是一種植物甾醇，可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的 COX-2 升高，COX-2高表達(dá)能加重食管組織損傷[22]。李建軍[23]發(fā)現(xiàn)98例GERD患者食管組織標(biāo)本中 COX-2 的表達(dá)水平增高，尤其以巴雷特食管表達(dá)最高，且隨著血清中炎性因子的表達(dá)水平增高而增高。研究表明，反流性食管炎患者的食管黏膜 COX-2 表達(dá)水平明顯高于正常食管黏膜[24]，證實(shí)高表達(dá)COX-2能夠加重食管黏膜損傷，導(dǎo)致GERD發(fā)生。槲皮素作為一種黃酮類化合物，具有抗感染等作用[25-28]。周霄楠等[29]通過構(gòu)建LSP誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠明顯抑制TNF-α、IL-6等釋放從而起到抗炎作用。

本研究發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯治療胃食管反流病的作用機(jī)制可能是通過參與基因表達(dá)的調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等生物過程，調(diào)節(jié)酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合等分子功能，主要參與腫瘤信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號(hào)通路。分子對(duì)接結(jié)果表明，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53的對(duì)接結(jié)合能均<-7 kcal·mol-1，結(jié)合穩(wěn)定，初步驗(yàn)證半夏瀉心湯中β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素等核心成分可作用于HIF1α、HSP90AA1、STAT3、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過參與相關(guān)通路來治療GERD。STAT3在腫瘤及其微環(huán)境扮演十分重要角色[30-31]，研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-6通過激活STAT3通路導(dǎo)致食管腺癌的形成[32]。HIF1α名為缺氧誘導(dǎo)因子-1的α亞單位，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[33]，趙東梅等[34]將40例RE患者均分為對(duì)照組和治療組，分別給予PPI和PPI+中藥治療后發(fā)現(xiàn)，血清HIF1α表達(dá)水平均下降。孫穎等[35]研究發(fā)現(xiàn)，GERD患者體內(nèi)HIF1α呈高表達(dá)狀態(tài)，這與趙冬梅的研究結(jié)果基本相符。半夏瀉心湯參與腫瘤通路，抑制相關(guān)STAT3通路的激活，減少炎癥因子的釋放，保護(hù)食管黏膜細(xì)胞，從而達(dá)到治療GERD的目的。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討半夏瀉心湯治療GERD的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療GERD，但是本研究未結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用機(jī)制，具有一定的局限性，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步深入研究。