杜邦嗜熱菌脂肪酶在黑曲霉中的異源表達

黎小軍,蔡禮年,鄭建永

(1.新余學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室,江西 新余 338004;2.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310027;3.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310032)

0 引言

熱穩(wěn)定酶因其良好的熱穩(wěn)定性和溶劑穩(wěn)定性而具有很好的生物技術(shù)和工業(yè)應(yīng)用潛力[1-3],備受學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的關(guān)注.嗜熱菌是熱穩(wěn)定酶的重要來源[1],不斷有新的熱穩(wěn)定酶基因從嗜熱菌中被克隆表達.杜邦嗜熱菌(Thermomycesdupontii)是近年來被研究較多的一種嗜熱真菌，過去其命名比較混亂，曾用名有Talaromycesthermophilus、Thermomycesthermophilus和Talaromycesdupontii等，現(xiàn)被統(tǒng)一命名為Thermomycesdupontii[4-5].

在筆者的前期研究[6]中，通過基因挖掘的策略結(jié)合RACE技術(shù)，從T.dupontiiATCC 16461菌株中克隆到脂肪酶TDL2，在大腸桿菌和畢赤酵母中異源表達后發(fā)現(xiàn)其對2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)表現(xiàn)出優(yōu)良的立體選擇性，生成普瑞巴林手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸.筆者前期研究還發(fā)現(xiàn):TDL2在大腸桿菌中異源表達活力非常低，其主要原因是大部分酶蛋白形成了包涵體.黑曲霉被FDA劃分為“通常是安全的”微生物;作為一種常見的絲狀真菌，黑曲霉具有極強的蛋白分泌能力和較為完善的蛋白修飾能力，加上其培養(yǎng)成本低，已被廣泛用于食品和工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)中[7].與異源表達常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，雖然黑曲霉表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化難度更大，但它能有效地解決外源蛋白在大腸桿菌中形成包涵體的問題.

本文擬將杜邦嗜熱菌脂肪酶TDL2在黑曲霉系統(tǒng)中異源表達，并考察TDL2自帶信號肽和pCAMBIA0380質(zhì)粒信號肽對脂肪酶TDL2表達的影響，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 以A.nigerCICC 2213作為黑曲霉表達宿主菌，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，E.coliDH5α用于質(zhì)粒的構(gòu)建，攜帶一個輔助 Ti 質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensAGL-1用于介導(dǎo)黑曲霉轉(zhuǎn)化；黑曲霉表達實驗所用質(zhì)粒為pCAMBIA0380[8],含有黑曲霉的β-葡萄糖苷酶bgl2的信號肽；攜帶脂肪酶TDL2完整ORF序列(GenBank no. MN782511.1,876 bp)的質(zhì)粒pGEM-T-TDL2為筆者前期研究[6]構(gòu)建,用于TDL2基因的克隆.

1.1.2 試劑 ClonExpress?II One Step Cloning Kit購自Vazyme,KOD-Plus-Neo DNA聚合酶購自TOYOBO,DpnI購自TaKaRa;卡那霉素、利福霉素和潮霉素B為Sigma公司產(chǎn)品;引物由常州基宇生物科技有限公司合成.

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基用于E.coliDH5α和A.tumefaciensAGL-1的培養(yǎng)與篩選;PDA培養(yǎng)基用于黑曲霉的培養(yǎng);AM培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基用于黑曲霉的轉(zhuǎn)化和篩選實驗.

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1)利用載體bgl2信號肽的重組質(zhì)粒構(gòu)建.以pGEM-T-TDL2為模板，利用引物L(fēng)3P-S(tggctccctccgtgggtgccGAAGTCTCGCAGGA-TCTGCTCG)(在引物中的小寫部分為設(shè)計用于無縫克隆的序列,下同)和L3-N(caggctttcgccacggagctTTAATCACACTCTGCAATGGCTCC)進行PCR擴增，獲得不含信號肽的TDL2編碼序列；同時以pCAMBIA0380為模板，利用引物p-S(AGCTCCGTGGCGA-AAGCCTG)和pP-N(GGCACCCACGGAGGGAGCC)進行擴增包含bgl2信號肽的質(zhì)粒序列，擴增完成后立即加入1 μLDpnI,在37 ℃下處理1 h,去除質(zhì)粒模板.PCR體系均為50.0 μL，包含質(zhì)粒模板0.5 μL、正反引物(5 mmol·L-1)各1.0μL、KOD-Plus-Neo DNA聚合酶1.0 μL.PCR程序:94 ℃ 3min，98 ℃ 10 s，68 ℃ 1 min(在擴增pCAMBIA0380質(zhì)粒時延伸時間改為6 min),30個循環(huán),68 ℃ 10 min,16 ℃ 5 min.1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因擴增產(chǎn)物和DpnI處理的質(zhì)粒載體擴增產(chǎn)物.回收的質(zhì)粒DNA片段和基因片段利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit進行拼接，使用方法參照試劑盒說明.拼接液熱擊法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布含Kan的LB平板，于37 ℃下培養(yǎng)過夜.挑取Kan平板上的菌落,利用引物YZ-S/YZ-A進行菌落PCR驗證，其中正向驗證引物YZ-S(TCGACCTGCTGAGGTCCCTCAGTCC)設(shè)計在質(zhì)粒信號肽的上游中，反向驗證引物YZ-A(TGAAGGAATGTCCGGGATATTCGGC)設(shè)計在目的基因的3′端處.陽性克隆保存并進行測序驗證，構(gòu)建黑曲霉表達質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1,用于后續(xù)試驗.

2)利用TDL2自身信號肽的重組質(zhì)粒(pCAMBIA-TDL2-2)構(gòu)建.方法和過程與1)利用載體信號肽的重組質(zhì)粒構(gòu)建完全相同，所不同的是在擴增包含信號肽的TDL2編碼序列時引物為L3-S(ccgcttgagcagacatcacaATGAGAGGTTTTCTCGTGCTGTTC)和L3-N,在擴增不包含bgl2信號肽的質(zhì)粒序列時引物為p-S和p-N(TGTGATGTCTGCTCAAGCGGGG).

1.2.2 黑曲霉工程菌的構(gòu)建 1.2.1節(jié)構(gòu)建并測序驗證的重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2均通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL-1.具體操作如下:向A.tumefaciensAGL-1感受態(tài)細胞中加入重組質(zhì)粒10 μL，冰浴5 min，液氮冷凍5 min，37 ℃熱激5 min，冰浴5 min，然后加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基,28 ℃復(fù)蘇4 h，涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素和 50 μg·mL-1利福霉素的LB培養(yǎng)基中在28 ℃下培養(yǎng)3 d.在利用驗證引物YZ-S和YZ-A進行菌落PCR驗證后，陽性克隆保存并用于黑曲霉轉(zhuǎn)化.

根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉的步驟參照Cai Linian等[8]改良的方法進行，分別將pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2導(dǎo)入宿主細胞A.nigerCICC 2213中.將活化的A.tumefaciensAGL-1和A.nigerCICC 2213孢子懸液混合，并涂布于鋪玻璃紙的AM瓊脂上，于22 ℃條件下共培養(yǎng)48 h.取出玻璃紙，轉(zhuǎn)移至含有100 μg·mL-1潮霉素B的MM平板上篩選.將篩選出的轉(zhuǎn)化子接種到含有 100 μg·mL-1潮霉素B的PDA 平板上，然后傳代至第3代，觀察其生長情況，并提取基因組進行PCR驗證，驗證方法與根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的驗證方法相同.

1.2.3 工程菌的表達 將構(gòu)建的2個黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2分別接種到含有100 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上，在30 ℃下培養(yǎng)5 d，用無菌水制成孢子濃度為107個·mL-1的孢子懸浮液.按1%的接種量接種發(fā)酵搖瓶(在500 mL搖瓶中裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基),在30 ℃下培養(yǎng)6 d.發(fā)酵液取樣，用于SDS-PAGE分析和活力測定.在發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾并離心，獲得粗酶液.

1.2.4 酶活的測定 以對硝基苯月桂酸酯(p-NPL)為底物，通過在405 nm處吸收值的變化快速測定脂肪酶活力，測定方法和酶活定義參照文獻[9-10].

2 結(jié)果與分析

2.1 杜邦嗜熱菌脂肪酶TDL2黑曲霉工程菌的構(gòu)建

根據(jù)筆者前期研究獲得的TDL2序列(GenBank MN782511.1)設(shè)計引物,以保存的質(zhì)粒pGEM-T-TDL2為模板，PCR擴增獲得不含信號肽的TDL2編碼序列(TDL2-1,810 bp)和含信號肽的TDL2編碼序列(TDL2-2,876 bp),兩端各含有20 bp用于拼接的序列;同時以pCAMBIA為模板,PCR擴增含bgl2信號肽序列的質(zhì)粒線性片段(pCAMBIA-1)和不含bgl2信號肽序列的質(zhì)粒線性片段(pCAMBIA-2).利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit,采用無縫克隆技術(shù),將TDL2-1與pCAMBIA-1、TDL2-2與pCAMBIA-2分別拼接,經(jīng)篩選和測序驗證,分別構(gòu)建利用pCAMBIA質(zhì)粒bgl2信號肽的重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1和利用脂肪酶TDL2信號肽的重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-2.質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2的圖譜及構(gòu)建過程如圖1所示.

圖1 重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2的構(gòu)建

通過凍融法分別將重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2轉(zhuǎn)化A.tumefaciensAGL-1,驗證后利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化A.nigerCICC 2213,經(jīng)篩選和驗證,成功構(gòu)建黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2.傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):黑曲霉轉(zhuǎn)化子均能在含有100 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上再次生長，且前后生長形態(tài)基本一致(見圖2).

注:1-1、1-2和1-3分別為A. niger/pCAMBIA-TDL2-1傳代至第1、2、3代的結(jié)果,2-1、2-2和2-3分別為A. niger/pCAMBIA-TDL2-2傳代至第1、2、3代的結(jié)果.

2.2 異源表達分析

將構(gòu)建的組成型黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2分別于30 ℃下培養(yǎng)6 d,取發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析(見圖3).工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2在分子量為40 kD附近有明顯的蛋白表達條帶，其大小比預(yù)測的分子量略大，這可能原因是與酶蛋白糖基化有關(guān).作為對照的宿主菌A.niger沒有該條帶,這說明TDL2在A.nigerCICC 2213中被成功表達.從圖3還可以看出:泳道3在分子量為40 kD處的條帶比泳道1和泳道2的更明顯，這說明利用脂肪酶TDL2自身信號肽的A.niger/pCAMBIA-TDL2-2的表達量比利用bgl2信號肽的A.niger/pCAMBIA-TDL2-1的表達量更大.

注:M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),1和2均為A. niger/pCAMBIA-TDL2-1,3為A. niger/pCAMBIA-TDL2-2,4為空白宿主菌A. niger CICC 2213.

2.3 不同信號肽對表達的影響

以pNPL為底物,測定了在發(fā)酵過程中的脂肪酶酶活,在發(fā)酵過程中工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2的酶活如圖4所示.工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-2的發(fā)酵曲線相似，前48 h發(fā)酵單位均比較低，在發(fā)酵120 h后發(fā)酵單位達到最大值，分別為18.5 U·mL-1和38.3 U·mL-1,該結(jié)果均高于筆者前期研究中脂肪酶TDL2在大腸桿菌中異源表達、低于畢赤酵母異源表達的發(fā)酵單位[6].另外,A.niger/pCAMBIA-TDL2-2是A.niger/pCAMBIA-TDL2-1發(fā)酵單位的2.07倍，相差較大，此結(jié)果與SDS-PAGE分析的目的蛋白表達結(jié)果基本吻合，這說明:在構(gòu)建的2個工程菌中，利用脂肪酶TDL2自身信號肽比利用pCAMBIA 質(zhì)粒中bgl2信號肽更有利于脂肪酶TDL2的表達，這導(dǎo)致其表達量更大、發(fā)酵單位更高.該結(jié)果也同時說明來源于T.dupontii的脂肪酶TDL2的信號肽序列能被黑曲霉表達系統(tǒng)識別，這可能原因是與杜邦嗜熱菌和黑曲霉同屬絲狀真菌有關(guān).

圖4 工程菌發(fā)酵曲線

3 結(jié)論

本文通過PCR技術(shù)和無縫克隆技術(shù)，將來源于杜邦嗜熱菌的脂肪酶TDL2的編碼序列與質(zhì)粒pCAMBIA0380線性片段拼接，分別構(gòu)建利用β-葡萄糖苷酶bgl2信號肽的重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-1和利用TDL2自帶信號肽的重組質(zhì)粒pCAMBIA-TDL2-2,用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化宿主細胞A.nigerCICC 2213,成功構(gòu)建組成型黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2,在發(fā)酵120 h后其發(fā)酵單位分別達到18.5 U·mL-1和38.3 U·mL-1,實現(xiàn)了脂肪酶TDL2在黑曲霉中的異源表達.SDS-PAGE分析和發(fā)酵曲線結(jié)果表明:脂肪酶TDL2自身信號肽序列能被黑曲霉識別，且利用脂肪酶TDL2自身信號肽比利用bgl2信號肽更有利于脂肪酶TDL2在黑曲霉中的表達，其表達量更大、發(fā)酵單位更高.研究結(jié)果為杜邦嗜熱菌脂肪酶TDL2的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時也為其他酶的黑曲霉表達提供參考.