數(shù)據(jù)挖掘探究肝-腎-肺纖維化的關(guān)鍵基因

閆慧芳

(中國(guó)人民大學(xué) 統(tǒng)計(jì)學(xué)院，北京 100872)

器官纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)的過度積累，從而導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的扭曲及器官功能的喪失。很多慢性病可引起纖維化，包括糖尿病、高血壓、病毒性、慢性肝病等疾病導(dǎo)致的纖維化可因過量的ECM取代和破壞實(shí)質(zhì)組織而致肝、肺、腎、心臟或其他重要器官的衰竭[1]。最近的分析表明，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，接近一半的死亡都與纖維性疾病有關(guān)[2]。解決器官纖維化問題的能力可能因?yàn)橐恍┮蛩囟煌?，包括器官、有害刺激因素的性質(zhì)以及患者的特征(例如年齡和遺傳背景)[3-5]。然而，來自人類和動(dòng)物模型的很多研究表明，纖維化在所研究的大多數(shù)器官或組織中存在被逆轉(zhuǎn)的可能。

計(jì)算生物學(xué)方法在確定人類疾病的潛在遺傳基礎(chǔ)方面起著至關(guān)重要的作用[6]。高通量平臺(tái)例如微陣列技術(shù)和RNA測(cè)序技術(shù)可用于分析轉(zhuǎn)錄層面上基因的改變，越來越被視為在疾病研究中提供重要幫助的工具[7-9]。近年來，結(jié)合生物信息學(xué)分析的微陣列技術(shù)能夠快速處理大量的數(shù)據(jù)集，使人們能夠全面識(shí)別數(shù)百個(gè)與某些疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的差異表達(dá)基因(Differential Expressed Genes，DEGs)。

針對(duì)器官纖維化也有許多研究工作，它們從不同的角度闡釋了不同組織間纖維化的共同特征。雖然組織成纖維細(xì)胞通常是異質(zhì)性的，但病理性肌成纖維細(xì)胞在肺、腎或肝纖維化中表現(xiàn)出類似的組織學(xué)表型和分子特征，這表明基本的致病途徑在不同纖維化器官存在共性[10-12]。Zhu Z.等整合了3個(gè)微陣列公共數(shù)據(jù)集，利用生物信息分析識(shí)別了肝纖維化相關(guān)的基因和通路，此外還對(duì)潛在的治療藥物進(jìn)行了初步篩選[13]。Chau-Chyun S.等針對(duì)特發(fā)性肺纖維化利用二代測(cè)序(Next Generation Sequencing, NGS)平臺(tái)獲取纖維化肺和健康肺的mRNA數(shù)據(jù)，利用逐步的生物信息學(xué)手段分析獲得與之相關(guān)的差異基因，他們也利用了Gene Expression Omnibus (GEO)公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行了驗(yàn)證[14]。Wang S.等識(shí)別出CXCL14 是一個(gè)由不同疾病引發(fā)的肝纖維化的共有差異基因，它可能會(huì)成為治療多因素肝纖維化的潛在靶點(diǎn)[15]。Mira P.等利用實(shí)驗(yàn)收集了腎纖維化相關(guān)的多組學(xué)數(shù)據(jù)(包括DNA，miRNA和蛋白)，利用計(jì)算生物學(xué)方法進(jìn)行了整合分析，并將這些數(shù)據(jù)和分析結(jié)果生成了在線工具，以供研究人員查找腎纖維化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組信息[16]。Zhao J.Q.等對(duì)纖維化的心血管疾病進(jìn)行了差異基因分析和功能富集，最終識(shí)別出11個(gè)關(guān)鍵基因[17]。Eugene M.等利用計(jì)算方法分析了肝纖維化和肺纖維化的共有代謝通路，為探究纖維化治療方法提供了新思路[18]。雖然近年來研究人員已經(jīng)利用生物信息學(xué)對(duì)纖維化進(jìn)行了一系列研究，仍有以下幾方面需要進(jìn)一步探究：1)不同器官纖維化的共有關(guān)鍵基因尚不完全明確；2)肝纖維化的特有關(guān)鍵基因信息鮮有研究；3)此外，為了發(fā)現(xiàn)潛在藥物靶點(diǎn)，針對(duì)關(guān)鍵基因及蛋白的成藥性分析是十分必要的[19]。

本文利用計(jì)算生物學(xué)方法對(duì)GEO公共數(shù)據(jù)集 (GSE36066, GSE97546, GSE55747) 進(jìn)行了整合分析和數(shù)據(jù)挖掘。其中GSE36066和 GSE97546包含 肝、腎、肺各一組數(shù)據(jù)，先基于它們進(jìn)行了第一輪分析。之后另外引入一個(gè)肝纖維化數(shù)據(jù)集GSE55747做進(jìn)一步的驗(yàn)證。最后針對(duì)驗(yàn)證后的纖維化關(guān)鍵基因，進(jìn)行了成藥性的評(píng)估。這些研究將有助于進(jìn)一步理解纖維化過程的內(nèi)在機(jī)理，也可為纖維化生物標(biāo)志物和潛在藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載3個(gè)基于小鼠的mRNA數(shù)據(jù)集，其中GSE36066和GSE97546用于差異表達(dá)基因和相關(guān)功能富集等的分析，GSE55747用于結(jié)果的驗(yàn)證。3個(gè)數(shù)據(jù)集的基本信息(見表1)。其中GSE36066為膽管結(jié)扎誘發(fā)的肝纖維化樣本與非纖維化樣本，GSE97546包含單側(cè)輸尿管梗阻誘發(fā)的腎纖維化和博來霉素誘發(fā)的肺纖維化樣本及相應(yīng)的對(duì)照樣本，驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE55747則是四氯化碳誘發(fā)的肝纖維化樣本與非纖維化肝樣本。3個(gè)數(shù)據(jù)集的采集基于不同的微陣列平臺(tái)，數(shù)據(jù)樣本的對(duì)照組和處理組樣本均有生物學(xué)重復(fù)。

表1 數(shù)據(jù)集的基本信息Table 1 Basic information of datasets

1.2 差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes, DEG)的分析及選擇

GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)提供了友好用戶界面，能夠?qū)EO數(shù)據(jù)進(jìn)行基于R的統(tǒng)計(jì)分析。 GEO2R是一種智能的在線分析工具，可以在相同的實(shí)驗(yàn)條件下既能整合分析兩個(gè)數(shù)據(jù)集，也可以拆分任何GEO數(shù)據(jù)[20]。本研究應(yīng)用GEO2R工具分析纖維化器官與正常器官之間差異表達(dá)基因。調(diào)整p值 < 0.01，log2FC(Fold Change)的絕對(duì)值 > 1.0的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因DEGs。獲取差異表達(dá)基因后利用在線Venn分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)獲得肝、腎、肺纖維化的DEG交集及肝纖維化特有DEG。

1.3 GO(Gene Ontology)功能富集及KEGG信號(hào)通路分析

基因本體論(Gene Ontology, GO)是一種常用的生物信息學(xué)工具，可根據(jù)定義的特征提供有關(guān)單個(gè)基因組產(chǎn)品的基因功能的全面信息。GO富集分析能從三方面更好地解釋基因的功能：分子功能(Molecular Function, MF)，生物過程(Biological Process, BP)和細(xì)胞成分(Cellular Component, CC)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究中，使用Webgestalt(http://www.webgestalt.org)進(jìn)行了GO和KEGG分析[21]。

1.4 驗(yàn)證分析

利用數(shù)據(jù)集GSE55747對(duì)以上分析獲取的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。首先使用GEO2R在線平臺(tái)分析獲得該數(shù)據(jù)集中肝纖維化樣本與對(duì)照樣本的差異表達(dá)基因。調(diào)整p值<0.01，log2FC(Fold Change)的絕對(duì)值>1.0的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因DEGs。然后利用Venn分析工具對(duì)GSE55747的DEGs與先前識(shí)別出的三種器官纖維化共有差異基因和肝纖維化特有差異基因進(jìn)行比較分析，取兩者的交集，從而得到進(jìn)一步驗(yàn)證的差異表達(dá)基因列表。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (Protein-Protein Interaction, PPI)及關(guān)鍵基因識(shí)別

STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes , STRING)[22]數(shù)據(jù)庫(kù)提供了實(shí)驗(yàn)和預(yù)測(cè)的相互作用信息。在本研究中，STRING在線工具用于分析DEG綜合得分 > 0.4的PPI。然后通過Cytoscape可視化PPI網(wǎng)絡(luò)[23]，利用其中的CytoHubba插件[24]分別計(jì)算得到3種器官纖維化共差異基因和肝纖維化特有差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)中前10個(gè)具有最高連接度的基因(蛋白)，將其視為關(guān)鍵基因(蛋白)。

1.6 關(guān)鍵基因/蛋白的成藥性(Druggability)評(píng)估

本研究主要基于3個(gè)維度的信息評(píng)估關(guān)鍵基因/蛋白的成藥性。以往的研究表明藥物-蛋白相互作用的發(fā)生區(qū)域?qū)τ谒幬锏暮侠磉f送是十分重要的[25]，因此我們將基因/蛋白的分布區(qū)域作為評(píng)估的第1個(gè)維度，如果蛋白分布于胞外或細(xì)胞膜，則賦分2分，其他分布區(qū)域賦分為0分。通常分泌蛋白的性質(zhì)會(huì)利于該蛋白的成藥性[26]。因此是否有證據(jù)表明蛋白為分泌蛋白，是評(píng)估的第2個(gè)維度，分泌蛋白賦分1分，非分泌蛋白賦分0分。此外有些蛋白并沒有直接的證據(jù)表明它們分布于胞外或?yàn)榉置诘鞍?，但是曾有研究在血漿中檢測(cè)到它們的存在，這一信息也是成藥性的因素之一。本研究將血漿中曾檢測(cè)到濃度的蛋白賦分1分，其余賦分0分。最后對(duì)各關(guān)鍵蛋白/基因的三項(xiàng)賦分加和得到最終的成藥性評(píng)分，0-4分代表成藥性由低到高。所獲取的蛋白分布、是否為分泌蛋白等信息均來自于HPA(The Human Protein Atlas) 數(shù)據(jù)庫(kù)[27]。

2 結(jié)果分析

2.1 多器官纖維化共有差異表達(dá)基因(DEGs)及肝纖維化特有差異表達(dá)基因

利用GSE36066和GSE97546數(shù)據(jù)集，識(shí)別了肝、腎、肺三種器官纖維化的各自的差異表達(dá)基因。adj.p值 < 0.01,log2FC(Fold Change) > 1.0作為界定差異基因的標(biāo)準(zhǔn)。通過GEO2R分析，GSE36066肝纖維化DEG 2 382個(gè)，GSE97546腎纖維化 DEG 2 632個(gè)，GSE97546肺纖維化DEG 2 897個(gè) (見圖1)。隨后對(duì)三種器官纖維化的DEG進(jìn)行韋恩分析，得到多器官纖維化的共有DEGs 196個(gè)和肝纖維化特有DEGs 1 562個(gè)(見圖2)。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖Fig. 1 Volcano diagram of DEGs

圖2 差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of DEGs

2.2 GO功能富集和KEGG通路

為了進(jìn)一步理解差異表達(dá)基因參與的生物過程和信號(hào)通路，利用Webgestalt在線工具對(duì)多器官纖維化共有DEG進(jìn)行了GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析，另外對(duì)肝纖維化DEG進(jìn)行了生物過程的功能富集分析。

2.2.1 三種器官纖維化共有差異基因的功能富集和信號(hào)通路分析

對(duì)肝、肺、腎三種器官纖維化共有的196個(gè)差異基因進(jìn)行的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果(見圖3)。采用有向無環(huán)圖(DAG)展示GO功能富集的分析結(jié)果，其中生物過程(BP)富集最顯著的包括炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等(見圖3a)。分子功能(MF)富集顯著的為脂磷酸結(jié)合、趨化因子活性、信號(hào)受體結(jié)合等(見圖3c)。而細(xì)胞組成(CC)分析顯示，這些基因表達(dá)的蛋白大部分為細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞表面或細(xì)胞外壁的組分，這也一定程度上為蛋白/基因的成藥性提供了證據(jù)(見圖3b)。此外，KEGG通路分析的火山圖(見圖3d) 顯示差異表達(dá)基因在TNF信號(hào)，Toll受體信號(hào)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等通路中有較顯著的富集。

圖3 GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析Fig. 3 GO functional enrichment and KEGG signaling pathway analyses

2.2.2 肝纖維化特有差異基因的生物過程(BP)功能富集

對(duì)肝纖維化特有的1 562個(gè)差異基因進(jìn)行的生物過程(BP)富集分析結(jié)果(見圖4)。BP富集分析中滿足p值和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate, FDR)均 < 0.05的生物過程被視為顯著，然后按照富集比率(Enrichment Ratio, ER)由大到小排列取前10項(xiàng)。結(jié)果表明這些差異基因的生物功能主要集中在脂肪酸代謝、羧酸代謝、脂質(zhì)代謝、氧化還原等過程。

圖4 肝纖維化特有差異基因的生物過程富集Fig.4 Biological process enrichment for liver fibrosis specific DEGs

2.3 數(shù)據(jù)驗(yàn)證獲得最終的差異表達(dá)基因

本研究除了探究三種器官纖維化共有關(guān)鍵基因以外，還研究了肝纖維化的特有關(guān)鍵基因，故引入一個(gè)肝纖維化數(shù)據(jù)集GSE55747做進(jìn)一步的驗(yàn)證。利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE55747進(jìn)行差異基因分析，同時(shí)滿足adj.pvalue<0.01 和log2FC>1.0被認(rèn)為是顯著的差異表達(dá)基因DEG。然后利用Venn分析工具與先前得到的肝腎肺三器官纖維化共有差異基因(196個(gè))和肝纖維化特有差異基因(1 562個(gè))分別取交集。最終得到驗(yàn)證后的肝-腎-肺三器官纖維化共有差異基因58個(gè)，肝纖維化特有差異基因85個(gè)(見表2)。

表2 驗(yàn)證后的三器官纖維化共有差異基因和肝纖維化特有差異基因Table 2 Common DEGs of fibrosis in three organs and liver fibrosis specific DEGs after validation

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)及關(guān)鍵基因

為了更好地理解識(shí)別得到的共有差異基因和特有差異基因中哪些起到關(guān)鍵作用，利用STRING工具進(jìn)行了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的分析，得到了包含58個(gè)nodes、145個(gè)edges的共有差異基因網(wǎng)絡(luò)和包含82個(gè)nodes、53個(gè)edges的肝纖維化特有差異基因網(wǎng)絡(luò)(見圖5)。然后利用Cotoscape中Cytohubba計(jì)算插件分別對(duì)這2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)得到基于MCC (Maximal Clique Centrality) 法排序前10的基因。本研究中將這些基因作為與纖維化過程相關(guān)的肝腎肺共有關(guān)鍵基因和肝特有關(guān)鍵基因(見表3)。將這20個(gè)小鼠基因與人類基因進(jìn)行匹配，得到14個(gè)匹配成功的對(duì)應(yīng)人類基因。

表3 多器官纖維化和肝纖維化特有的關(guān)鍵基因 (各取前10個(gè))Table 3 Hub genes for multi-organ fibrosis and liver fibrosis only (ten for each)

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction network

2.5 關(guān)鍵基因的成藥性

蛋白分布區(qū)域、是否為分泌蛋白以及是否有研究在血漿中檢測(cè)到為3個(gè)考慮的關(guān)鍵指標(biāo)，這些指標(biāo)對(duì)應(yīng)的信息全部來自于公共數(shù)據(jù)庫(kù)。針對(duì)這些信息，進(jìn)行相應(yīng)的賦分，其中分布區(qū)域?yàn)槌伤幮宰钪匾囊蛩兀虼朔植加诎饣蚣?xì)胞膜則賦2分。如果為分泌蛋白或有血漿中濃度信息各賦1分。將這三項(xiàng)的賦分加和，即得到最終的成藥性評(píng)分。經(jīng)過分析計(jì)算，在這14個(gè)關(guān)鍵基因中，有3個(gè)具有較高的成藥性(4分)，6個(gè)有中等的成藥性(2～3分)， 5個(gè)具有較弱的成藥性(0～1分)，具體結(jié)果(見表4)。

表4 關(guān)鍵基因的成藥性信息Table 4 Druggability information for hub genes

3 討 論

纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚，通常是由于重復(fù)或慢性組織損傷的傷口愈合反應(yīng)，并可能導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能的喪失。雖然纖維化在以前被認(rèn)為不可逆，最新的證據(jù)表明某些情況下纖維化疾病是可以被逆轉(zhuǎn)的，纖維化消退的機(jī)制包括降解纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)以及消除相關(guān)的成纖維細(xì)胞。已有研究表明不同器官的纖維化機(jī)制存在共性，因此為了探究與纖維化過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，本研究通過對(duì)公共數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)挖掘，識(shí)別了肝臟、腎臟及肺臟三種器官纖維化的共有關(guān)鍵基因和相關(guān)生物通路。此外，也對(duì)肝纖維化的特有差異基因進(jìn)行了分析。研究人員做了大量基于動(dòng)物模型的纖維化研究，雖然動(dòng)物模型并不能完全描述相應(yīng)的人類疾病，但是相比于人的試驗(yàn)，動(dòng)物試驗(yàn)具有更加可控可比的樣本組和對(duì)照組，也利于采集噪音更小的數(shù)據(jù)。已經(jīng)有許多具有代表性的纖維化動(dòng)物模型。其中膽總管結(jié)扎和四氯化碳誘導(dǎo)作為代表性的肝纖維化動(dòng)物模型構(gòu)建方法。膽管結(jié)扎動(dòng)物模型在全世界數(shù)百個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用于誘發(fā)肝膽汁淤積和纖維化。它誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞增生，使增殖的膽管上皮細(xì)胞周圍的門脈成纖維細(xì)胞發(fā)生肌纖維母細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致ECM的高度復(fù)制，大量表達(dá)和沉積。因此，該模型在大鼠和小鼠中的應(yīng)用在研究肝炎癥和纖維化發(fā)病機(jī)理的十分流行。四氯化碳誘導(dǎo)的動(dòng)物模型主要機(jī)制為四氯化碳在肝臟中被細(xì)胞色素P450代謝，轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性三氯甲基(CCl3)自由基，最終導(dǎo)致肝毒性損害、炎癥和纖維化。CCl4誘導(dǎo)的肝損傷構(gòu)成了人類病理學(xué)的可靠模型，在生理和細(xì)胞水平上都模仿了其關(guān)鍵特征。對(duì)于腎纖維化，單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)會(huì)在阻塞的腎臟中引發(fā)一系列事件，導(dǎo)致腎血流量和腎小球?yàn)V過率在24 h內(nèi)急速下降。隨后的間質(zhì)反應(yīng)包括間質(zhì)炎癥，腎小管擴(kuò)張和腎小管凋亡，并從7 d開始導(dǎo)致腎小管萎縮和纖維化。盡管完全的輸尿管梗阻不是人類腎臟疾病的最常見原因，但由于UUO具有產(chǎn)生進(jìn)行性腎纖維化的能力，它已成為慢性腎臟疾病的最受歡迎模型之一。完整的梗阻模型的優(yōu)點(diǎn)是可重復(fù)性好(因此動(dòng)物間的差異不成問題)，時(shí)程短，性能容易，并且有對(duì)側(cè)腎臟作為對(duì)照。此外，該模型在大鼠和小鼠中都很容易誘導(dǎo)。而博來霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是最具代表性的肺纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀２﹣砻顾厥且环N治療用的抗生素。當(dāng)淋巴瘤患者靜脈注射BLM后出現(xiàn)肺纖維化時(shí)，已被確定為促纖維化藥物。它已被用于多種物種的模型構(gòu)建，包括小鼠，大鼠，豚鼠，倉(cāng)鼠，狗和靈長(zhǎng)類動(dòng)物。本研究中選用基于以上動(dòng)物模型收集的數(shù)據(jù)集，利用GSE36066(肝纖維化)和GSE97546(腎纖維化和肺纖維化)識(shí)別出肝-腎-肺纖維化共有差異表達(dá)基因196個(gè)，肝纖維化特有差異表達(dá)基因1 562個(gè)。然后引入數(shù)據(jù)集GSE55747進(jìn)行了驗(yàn)證分析，得到驗(yàn)證后的共有DEG 58個(gè)，肝纖維化特有DEG 85個(gè)。肝-腎-肺纖維化共有DEG主要富集于炎癥反應(yīng)(Inflammatory Response)和免疫反應(yīng)(Immune Response)過程。以往的很多研究表明，化學(xué)物質(zhì)、微生物或生理組織損傷引起的慢性炎癥通常會(huì)導(dǎo)致纖維化病變[28-30]，本研究的富集結(jié)果與這一結(jié)論相吻合。尚未有研究表明存在未發(fā)生炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生的纖維化，而不同原因和不同器官中發(fā)生的纖維化通路可能十分相似[31]。生物過程(BP)富集結(jié)果顯示196 個(gè)肝腎肺共有DEG中約50個(gè)被歸類于免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)過程。其中CCL5、CCL6、CCL12、CXCL1、CXCL14和CX3CL1屬于趨化因子(Chemokines)超家族，趨化因子是一類參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程的蛋白[32]。研究表明趨化因子參與所有的傷口愈合反應(yīng)且在纖維化過程中起到通用的及器官特異性的作用[33]。CD14、CD44和CD84基因編碼的蛋白都屬于表面抗體，優(yōu)先在巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞上表達(dá)。CD14與其他蛋白質(zhì)協(xié)同介導(dǎo)免疫應(yīng)答[34]。CD44編碼的蛋白質(zhì)是一種細(xì)胞表面糖蛋白，參與細(xì)胞間相互作用，細(xì)胞粘附和遷移。已被證實(shí)CD44與其配體HA與許多炎癥性疾病有關(guān)[35]。CD84編碼一種膜糖蛋白，該蛋白是信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子(SLAM)家族的成員。研究顯示CD84介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)多種免疫過程[36]。C1qa和C1qb分別編碼血清補(bǔ)體亞成分C1q的A鏈和B鏈多肽，而C1q與自身免疫和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[37]。

肝纖維化特有DEG的富集分析顯示與脂肪酸代謝(Fatty acid metabolic process)和脂質(zhì)代謝(Lipid metabolic process)過程有很強(qiáng)的聯(lián)系。富集分析表明1 562 個(gè)肝纖維化特有DEG中約160個(gè)被歸類于脂質(zhì)代謝或脂肪酸代謝過程。肝臟為脂質(zhì)代謝的重要器官，而數(shù)據(jù)集GSE36066和GSE55747中肝纖維化小鼠模型分別基于膽管結(jié)扎(BDL)和四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)。以往的研究表明，BDL誘導(dǎo)會(huì)降低肝臟中細(xì)胞色素P450含量、過氧化脂肪酸的beta-氧化和催化活性，而這些變化并不會(huì)發(fā)生在腎臟中[38]。也有很多研究表明CCl4會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而造成肝損傷[39-42]。因此相較于腎臟和肺臟纖維化，在肝纖維化中特異性地識(shí)別出脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異基因是合理的。而這些與脂質(zhì)代謝或脂肪酸代謝相關(guān)的基因是否特異性地在肝纖維化中發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證與分析。

利用PPI分析得到肝-腎-肺纖維化共有和肝纖維化特有關(guān)鍵基因各10個(gè)，經(jīng)過小鼠基因與人基因的匹配，成功識(shí)別出肝-腎-肺纖維化共有的人關(guān)鍵基因8個(gè)，肝纖維化特有的人關(guān)鍵基因6個(gè)。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，此前的研究有證據(jù)表明這些關(guān)鍵基因中5個(gè)與纖維化相關(guān)(TYROBP,FCGR3B,ALOX5AP,CD14,CYP1A2)，3個(gè)與肝病相關(guān)(CYP8B1,UGT2A3,CES3)。TYROBP(DAP12)編碼包含基于免疫受體酪氨酸激活模體的跨膜信號(hào)多肽,參與淋巴與非淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的相互作用。Zhang L.等的研究表明在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)中TYROBP基因下調(diào)[43]。Tammaro A.等則發(fā)現(xiàn)TYROBP(DAP12) 參與了UUO誘發(fā)的腎纖維化[44]。FCGR3B編碼的蛋白是針對(duì)γ免疫球蛋白(IgG)Fc區(qū)的低親和力受體。它能夠充當(dāng)單體，與單體或聚集的IgG相結(jié)合，可能在捕獲外周循環(huán)中免疫復(fù)合物過程中起到一定作用。Bournazos S等在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中，使用CD36作為基因復(fù)制對(duì)照，通過實(shí)時(shí)定量PCR比較了142例IPF患者和221例對(duì)照中FCGR3B的拷貝數(shù)。證明了該基因拷貝數(shù)的差異(Copy Number Variation, CNV)與特發(fā)性肺纖維化有關(guān)[45]。ALOX5AP編碼一種是白三烯合成所必需的蛋白，白三烯是花生四烯酸代謝產(chǎn)物，已經(jīng)證實(shí)與哮喘、關(guān)節(jié)炎等多種炎癥反應(yīng)有關(guān)。針對(duì)囊性纖維化疾病，靶向ALOX5AP的藥物Fiboflapon在臨床二期研究中。另外Kowal-Bielecka O等的研究表明ALOX5AP的遺傳變異可能在肺纖維化中起作用[46]。CD14編碼的蛋白屬于表面抗體，優(yōu)先在巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞上表達(dá)，CD14與其他蛋白質(zhì)協(xié)同介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。Zhao SX等人的研究表明CD14陽(yáng)性的單核細(xì)胞與 CD163陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞慢性丙型肝炎患者肝纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)[47]。Fukushima H的研究則表明，在具有纖維化非酒精性脂肪肝炎(NASH)的動(dòng)物模型中，CD14陽(yáng)性的肝巨噬細(xì)胞數(shù)量增加[48]。CYP1A2編碼一種細(xì)胞色素P450酶, 細(xì)胞色素P450是單加氧酶，可催化涉及藥物代謝和膽固醇和其他脂質(zhì)合成的許多反應(yīng)。Wuensch T等在非腫瘤肝組織中，觀察到CYP1A2活性逐漸下降，并伴有纖維化加劇[49]。在肝特異相關(guān)的關(guān)鍵蛋白中，CYP8B1在此前的研究中被證明與非酒精性脂肪肝病NAFLD(Non-alcoholic Fatty Liver Disease)相關(guān)。 Raphael C等通過研究發(fā)現(xiàn)在膽固醇誘導(dǎo)的NAFLD模型中，敲低Cyp8b顯著降低了脂肪變性和肝脂質(zhì)含量[50]。Hardwick RN 等發(fā)現(xiàn)UGT2A3在非脂肪非硬化的非酒精性脂肪肝炎NASH病人中，表達(dá)水平增高，而在脂肪性NASH和肝硬化病人中并未發(fā)現(xiàn)這種差異[51]。Quiroga AD在大鼠早期肝癌中發(fā)現(xiàn)了CES3基因的下調(diào)，證明該基因可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[52]。

研究疾病的機(jī)制和關(guān)鍵基因的主要目的是開發(fā)更有效的藥物或治療手段。而這些關(guān)鍵基因作為潛在藥物靶點(diǎn)的一個(gè)重要前提是較高的成藥性 (Druggability)?；诘鞍追植紖^(qū)域、是否為分泌蛋白以及檢測(cè)到的血漿濃度進(jìn)行的成藥性的分析顯示，7個(gè)共有關(guān)鍵蛋白/基因和2個(gè)特有關(guān)鍵蛋白/基因具有較高的成藥性。綜合富集結(jié)果、蛋白-蛋白相互作用、研究證據(jù)和成藥性信息，結(jié)果顯示TYROBP, FCGR3B, ALOX5AP和CD14或可作為纖維化治療的潛在靶點(diǎn)， 而CYP8B1和UGT2A3可能成為NAFLD或NASH等肝病治療的研究重點(diǎn)。對(duì)于本研究中識(shí)別出的關(guān)鍵基因FCGR1B, C1QB, LY86和CD53，雖然此前未有研究表明與纖維化直接相關(guān)，也可作為全新的靶點(diǎn)進(jìn)行更深入的探究和驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用計(jì)算生物學(xué)方法對(duì)GEO公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行了整合分析和數(shù)據(jù)挖掘，識(shí)別了肝臟、腎臟及肺臟三種器官纖維化的共有關(guān)鍵基因和肝纖維化的特有關(guān)鍵基因。GO功能富集和KEGG通路分析表明，肝-腎-肺纖維化共有DEG主要富集于炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)過程，而肝纖維化特有DEG脂肪酸代謝和脂質(zhì)代謝過程有很強(qiáng)的聯(lián)系。最后還對(duì)這些關(guān)鍵基因進(jìn)行了成藥性的評(píng)估。綜合富集結(jié)果、蛋白-蛋白相互作用、研究證據(jù)和成藥性信息給出了纖維化和肝病的潛在藥物靶點(diǎn)。這些研究將有助于理解纖維化過程的內(nèi)在機(jī)理，也為纖維化疾病的治療提供更多的可能。本研究全部基于動(dòng)物模型公共數(shù)據(jù)集的分析和挖掘，并未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，未來通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)這些基因進(jìn)行更深入的研究將有助于進(jìn)一步明確它們?cè)诶w維化過程中發(fā)揮的作用。

4 結(jié) 論

1)TYROBP，F(xiàn)CGR3B，ALOX5AP和CD14或可成為纖維化治療的潛在靶點(diǎn)；

2)CYP8B1和UGT2A3可能與非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(Non-Alcoholic SteatoHepatitis , NASH)相關(guān)；

3)對(duì)于基因FCGR1B，C1QB，LY86和CD53，目前沒有直接的證據(jù)表明其與纖維化相關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證它們?cè)诶w維化發(fā)生過程中的功能。