小檗堿對(duì)被動(dòng)吸煙大鼠血清血管炎性因子影響的研究*

于曉明 卿力東

1 江西中醫(yī)藥大學(xué),江西省南昌市 330006; 2 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院

吸煙是最為常見(jiàn)的個(gè)人不良嗜好之一，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，目前國(guó)內(nèi)吸煙人數(shù)已經(jīng)超過(guò)3億，15歲及以上人群吸煙率為26.6%，其中男性成年人口吸煙比率更是高達(dá)50.5%，吸煙導(dǎo)致我國(guó)每年有100多萬(wàn)人失去生命[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化重要危險(xiǎn)因素[2]，吸煙所導(dǎo)致的血管炎性反應(yīng)可能是動(dòng)脈硬化的啟動(dòng)因素并且其可參與動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)進(jìn)程[3]。血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的重要血管炎性因子，本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)分組大鼠進(jìn)行持續(xù)不同時(shí)間的被動(dòng)吸煙，與對(duì)照組比較，觀察持續(xù)不同時(shí)間的被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9等血管炎性因子的影響，并觀察灌服小檗堿溶液對(duì)大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9的影響，從而探索吸煙導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制，同時(shí)也為小檗堿防治動(dòng)脈粥樣硬化提供初步實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)一

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料：(1)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠9只，體質(zhì)量(200±20)g，6～8周齡，由江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。(2)主要儀器和試劑：香煙煙霧自動(dòng)發(fā)生器、被動(dòng)吸煙玻璃箱(50cm×50cm×70cm)、無(wú)毒塑料鼠盒、不銹鋼絲籠蓋、香煙(紅雙喜牌卷煙，焦油含量每支11mg，煙堿含量每支1mg)、塑料瓶飲水器、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定hs-CRP、IL-6、MMP-9試劑盒(試劑盒購(gòu)自上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法：按吸煙持續(xù)時(shí)間不同將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)均分為：吸煙長(zhǎng)時(shí)間組(n=3)、吸煙短時(shí)間組(n=3)、非吸煙對(duì)照組(n=3)。大鼠采用同等方式飼養(yǎng)于動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(23±1)℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%，煙霧暴露過(guò)程中箱內(nèi)濃度維持在20%，供給大鼠標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料(購(gòu)買于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)和水, 水可自由取食。吸煙長(zhǎng)時(shí)間組：大鼠于裝置內(nèi)給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙15支，時(shí)間控制在每次1.5h。吸煙短時(shí)間組大鼠于裝置內(nèi)給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙5支，時(shí)間控制在每次0.5h。非吸煙對(duì)照組同時(shí)放至相同裝置內(nèi)給予空氣暴露。共建模6周，之后從腹主動(dòng)脈采血，離心，分裝血清，-80℃凍存。用ELISA法測(cè)定hs-CRP、IL-6、MMP-9濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)二

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料：(1)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量(200±20)g，6～8周齡，由江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為吸煙長(zhǎng)時(shí)間灌藥組(n=9)、吸煙長(zhǎng)時(shí)間組(n=9)。(2)主要儀器和試劑：同實(shí)驗(yàn)一。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)均分為吸煙長(zhǎng)時(shí)間組和吸煙長(zhǎng)時(shí)間灌藥組，分別進(jìn)行如下處理：吸煙長(zhǎng)時(shí)間組：SD大鼠于裝置內(nèi)給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙15支，每支香煙點(diǎn)燃15min后換煙，每次1.5h。吸煙長(zhǎng)時(shí)間灌藥組:SD大鼠于裝置內(nèi)給予煙霧暴露，每周熏煙6d，每天上、下午各1次，每次使用香煙15支，時(shí)間控制在每次1.5h，同時(shí)，每天給大鼠予小檗堿溶液按60mg/(kg·d)的劑量進(jìn)行灌胃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(23±1)℃，相對(duì)濕度控制在40%～70%，供給大鼠標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料(購(gòu)買于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)和自來(lái)水,水可自由取食。共建模6周，之后腹主動(dòng)脈采血，離心，分裝血清，-80℃凍存。用ELISA法測(cè)定hs-CRP、IL-6、MMP-9濃度。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)一結(jié)果 hs-CRP含量在吸煙長(zhǎng)時(shí)間組中的含量低于非吸煙對(duì)照組和吸煙短時(shí)間組(P<0.05)，但在非吸煙對(duì)照組和吸煙短時(shí)間組之間無(wú)差異(P>0.05)；IL-6含量在吸煙長(zhǎng)時(shí)間組中的含量高于非吸煙對(duì)照組和吸煙短時(shí)間組(P<0.05)，但在非吸煙對(duì)照組和吸煙短時(shí)間組之間無(wú)差異(P>0.05)。MMP-9含量在吸煙長(zhǎng)時(shí)間組中的含量高于非吸煙對(duì)照組和吸煙短時(shí)間組(P<0.05)，但在非吸煙對(duì)照組和吸煙短時(shí)間組之間無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9水平影響結(jié)果

2.2 實(shí)驗(yàn)二結(jié)果 統(tǒng)計(jì)分析得出，與吸煙長(zhǎng)時(shí)間組相比，hs-CRP含量在吸煙長(zhǎng)時(shí)間灌藥組中無(wú)顯著差異(P>0.05)，但I(xiàn)L-6 和MMP-9含量在吸煙長(zhǎng)時(shí)間灌藥組中均有降低，有顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 小檗堿干預(yù)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間吸煙大鼠血清hs-CRP、IL-6、MMP-9水平影響

3 討論

吸煙可以分為主流煙和側(cè)流煙，主流煙是抽吸時(shí)通過(guò)煙柱直接進(jìn)入口腔的氣流，而側(cè)流煙是在沒(méi)有抽吸時(shí)，從燃著的煙絲直接進(jìn)入空氣的氣流，二者成分本質(zhì)相同，只是存在量的差別[4],故而采用被動(dòng)吸煙的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究吸煙的致病作用具有切實(shí)可行性，此外，主動(dòng)吸煙的動(dòng)物模型難以建立，也是本研究采用被動(dòng)吸煙進(jìn)行觀察的一大原因。

吸煙是心腦血管疾病的重要致病因素，研究發(fā)現(xiàn)吸煙對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性可隨著吸煙量增大而增加[5]。尼古丁是煙草中主要有毒物質(zhì)，其可以活化炎性細(xì)胞而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[6]。在體外實(shí)驗(yàn)研究中, 發(fā)現(xiàn)尼古丁可促使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6增多, 從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、炎癥與纖溶活性紊亂。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，是分解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜過(guò)程中的主要物質(zhì)[7]，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解為炎癥細(xì)胞及因子進(jìn)入組織打開(kāi)門徑。MMP-9參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展，且可能成為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)及發(fā)生腦梗死風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)[8]。IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，因其在心腦血管事件中潛在的診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值而越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注。IL-6是引起急性期反應(yīng)的信號(hào)，其不僅能誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞產(chǎn)生CRP，也能誘導(dǎo)促炎因子IL-23、IL-17的釋放，從而進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。在腦梗死急性期時(shí)，血清IL-6表達(dá)也會(huì)顯著升高，加重對(duì)腦組織的損害，從而對(duì)疾病發(fā)展產(chǎn)生不良影響[10]。綜合以上研究可知，MMP-9、IL-6在引起血管壁損傷、促使動(dòng)脈粥樣硬化和腦梗死病變中均具有較為肯定的推動(dòng)作用，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙能夠時(shí)間依賴地使大鼠血清IL-6、MMP-9等血管炎性因子水平升高，提示這可能是吸煙導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要機(jī)制。

隨著對(duì)吸煙致病作用研究的增多，有學(xué)者在研究吸煙對(duì)急性心肌梗死患者的影響時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)吸煙患者的預(yù)后更好，此現(xiàn)象被稱之為“吸煙悖論”[11-12]。中醫(yī)古代醫(yī)家在認(rèn)識(shí)到吸煙危害人體健康的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了煙草煙氣的某些治療作用，如清代醫(yī)家吳儀洛認(rèn)為煙屬辛溫之品，能行能散，可以宣通陽(yáng)氣，避穢殺蟲(chóng)，但如果用之代茶飲，長(zhǎng)期使用，則火氣熏灼、耗傷陰血、損耗壽命[13]。本研究發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙可以降低吸煙長(zhǎng)時(shí)間組大鼠血清中hs-CRP含量，提示煙作為中藥本草，確實(shí)存在一定的藥理作用，但煙草中同時(shí)存在大量有毒物質(zhì)，因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)吸煙中具有藥用價(jià)值成分的研究，此外，本實(shí)驗(yàn)吸煙時(shí)間長(zhǎng)短和臨床中吸煙者時(shí)間比較具有相對(duì)性，且超長(zhǎng)期吸煙者模型難以建立，因此超長(zhǎng)期吸煙對(duì)血清中hs-CRP含量的影響還需做進(jìn)一步的研究和觀察。

中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，吸煙時(shí)煙霧具有火熱之性，火熱可以直接灼傷脈絡(luò)，亦可灼津成痰，熱與痰結(jié)可以形成痰熱，阻塞脈道可形成瘀血，痰熱、瘀血結(jié)于損傷脈道可以導(dǎo)致脈痹，即動(dòng)脈粥樣硬化，病情進(jìn)一步發(fā)展則可以導(dǎo)致中風(fēng)、胸痹等疾病，在此病變過(guò)程中，火熱灼脈是脈痹的病機(jī)關(guān)鍵所在[14-15]。《素問(wèn)·四氣調(diào)神大論》言道：“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂”，積極戒煙，減少生熱之源，或早期使用清熱瀉火的藥物均可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的形成。當(dāng)前對(duì)吸煙促使動(dòng)脈粥樣粥樣硬化和腦梗死的干預(yù)，主要在于勸誡患者戒煙以祛除致病之因，但對(duì)于難以戒煙者或吸煙已然造成病理影響尚無(wú)針對(duì)療法，此方面研究目前也相對(duì)較少。辨證論治是中醫(yī)學(xué)的特色和優(yōu)勢(shì)之一，通過(guò)對(duì)吸煙所致病理改變和臨床癥狀進(jìn)行辨證分析治療，以期干預(yù)吸煙促使動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，有利于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的加重以及腦梗死的發(fā)生，這也是中醫(yī)學(xué)治未病中既病防變、防微杜漸思想的體現(xiàn)。然而，相當(dāng)比例具有吸煙病因的動(dòng)脈粥樣硬化患者可無(wú)臨床癥狀表現(xiàn)或有辨證參數(shù)不足的情況，從而不利于辨證的準(zhǔn)確性，論治時(shí)亦缺乏療效觀察指標(biāo)。根據(jù)吸煙所致的火熱灼脈病機(jī)，從火熱論治動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，可以在宏觀辨證的基礎(chǔ)上結(jié)合微觀辨證，參考血清IL-6、MMP-9水平，有利于發(fā)揮宏觀辨證的整體性優(yōu)勢(shì)和微觀辨證的客觀性優(yōu)勢(shì)，提高辨證治療的準(zhǔn)確性。

黃連始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品，該藥味苦性寒, 歸心、脾、 胃、肝、膽、大腸經(jīng), 具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃連的有效成分為小檗堿，隨著現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有降血脂、降血糖、降血壓、抗心律失常、擴(kuò)張冠狀血管等作用。張金霞等[16]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可能通過(guò)干預(yù)CCL2、HMOX1、MMP-9等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控流體剪切力以及IL-17、TNF等信號(hào)通路發(fā)揮干預(yù)頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用。劉琴等[17]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠減輕高糖及高脂引起的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊沉積并改善斑塊的脆弱性。高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素之一，譚文倩等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)低劑量小檗堿可以促進(jìn)正常飲食小鼠腸道短鏈脂肪酸和膽汁酸產(chǎn)生，降低正常飲食小鼠血清三酰甘油水平。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與吸煙長(zhǎng)時(shí)間組比較，灌服小檗堿的吸煙長(zhǎng)時(shí)間組大鼠血清中IL-6、MMP-9水平均較低，兩組對(duì)比具有顯著性差異。因此，提示灌服小檗堿溶液可以抑制被動(dòng)吸煙大鼠血清IL-6、MMP-9水平的升高，從而可以起到預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙能夠時(shí)間依賴地使大鼠血清IL-6、MMP-9等血管炎性因子水平升高，提示這可能是吸煙導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的具體病理學(xué)機(jī)制之一。灌服小檗堿溶液可以抑制被動(dòng)吸煙大鼠血清IL-6、MMP-9水平的升高，從而可以起到預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用，同時(shí)也為中醫(yī)探討吸煙導(dǎo)致的火熱灼脈理論及清熱瀉火法治療動(dòng)脈硬化提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。后期筆者將以本實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以黃連為主藥的中成藥的藥效學(xué)研究。