作孚連蕊茶的形態(tài)特征觀測(cè)和SNP位點(diǎn)分析

沈 琳, 周 利, 張亞利

(1. 上海上園苗木有限公司, 上海 200083; 2. 南山植物園, 重慶 400060; 3. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所, 上海 201403)

近年來(lái)，山茶屬(CamelliaLinn.)連蕊茶組(Sect.TheopsisCohen-Stuart)植物因其花小而密等觀賞特征受到研究者及應(yīng)用者的關(guān)注與喜愛(ài)[1,2]。作者在野外調(diào)查中觀測(cè)到重慶縉云山作孚連蕊茶(CamelliatsofuiS. S. Chien)的花梗及萼片總長(zhǎng)以及花蕾和花瓣顏色等形態(tài)特征與原始文獻(xiàn)[3]描述存在差異，這些差異在作孚連蕊茶作為景觀應(yīng)用和育種材料開(kāi)發(fā)中具有重要價(jià)值。

Super-GBS技術(shù)是基于GBS進(jìn)一步發(fā)展出的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，因其能夠獲得更多、更準(zhǔn)確的SNP/Indel等優(yōu)勢(shì)，目前已逐步運(yùn)用到分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和進(jìn)化分析等研究中[4]。近年來(lái)，作者先后開(kāi)展山茶屬連蕊茶組和毛蕊茶組(Sect.EriandriaCohen-Stuart)不同物種、同一物種不同居群以及同一物種同一居群不同單株樣本的Super-GBS測(cè)序與分析，其中，兩兩樣本間的相似度比較在進(jìn)行分類鑒定及進(jìn)化分析方面具有一定的參考意義。

本研究對(duì)作孚連蕊茶在原生境及遷地栽培環(huán)境中的形態(tài)特征進(jìn)行觀測(cè)和比較，探索Super-GBS技術(shù)在開(kāi)展形態(tài)特征存在差異材料相似度比較中的應(yīng)用，以期為作孚連蕊茶的景觀應(yīng)用和種質(zhì)創(chuàng)新等提供支撐，同時(shí)也為其今后的分類地位探討提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

供試作孚連蕊茶野生居群主要分布于重慶縉云山(東經(jīng)106°23′、北緯29°49′)海拔約800 m的常綠闊葉林、針闊混交林和毛竹〔Phyllostachysedulis(Carriere) J. Houzeau〕林內(nèi)；遷地栽培材料種植于浙江金華的國(guó)際山茶物種園內(nèi)的連蕊茶組和毛蕊茶組資源種質(zhì)區(qū)。通過(guò)采集標(biāo)本、形態(tài)特征記錄和拍照，比對(duì)作孚連蕊茶原始文獻(xiàn)[3]描述及林祁等[5]指定的后選模式標(biāo)本的形態(tài)特征，鑒定為作孚連蕊茶。憑證標(biāo)本保存于上海辰山植物標(biāo)本館(CSH)。

Super-GBS測(cè)序與分析選取3個(gè)花部形態(tài)特征存在差異的作孚連蕊茶單株。其中，O-1單株(憑證標(biāo)本號(hào)CSH0187825)采自縉云山，其花梗及萼片總長(zhǎng)8～10 mm，花近白色，花柱極淺3裂，裂片長(zhǎng)約1 mm；O-2單株(憑證標(biāo)本號(hào)CSH0187824)采自縉云山，其花梗及萼片總長(zhǎng)6～8 mm，花瓣白色或外輪花瓣被紫紅色，花柱淺3裂，裂片長(zhǎng)約3 mm；E-1單株(憑證標(biāo)本號(hào)CSH0187846)采自國(guó)際山茶物種園，其花梗及萼片總長(zhǎng)10～12 mm，花瓣被紫紅色，花柱極淺3裂，裂片長(zhǎng)約1 mm。

1.2 方法

1.2.1 植物形態(tài)特征觀測(cè) 結(jié)合原始文獻(xiàn)的形態(tài)特征描述，對(duì)生活型、枝干被毛情況、葉片長(zhǎng)、葉片寬、花蕾著生方式、花蕾顏色、花梗及萼片總長(zhǎng)、花瓣顏色、雄蕊被毛情況、花柱裂片長(zhǎng)度、果實(shí)性狀、果實(shí)大小、種子大小等數(shù)量和質(zhì)量性狀進(jìn)行觀測(cè)，數(shù)量性狀隨機(jī)選取15個(gè)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.2.2 Super-GBS測(cè)序與分析 于春季采集幼嫩葉片，用錫箔紙包好后迅速放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由青島歐易生物科技有限公司完成。采用植物基因組DNA試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取DNA，樣品DNA抽提質(zhì)檢合格后，運(yùn)用Super-GBS技術(shù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)[4]。測(cè)序結(jié)果采用Super-GBS的信息分析流程進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、數(shù)據(jù)比對(duì)和基因分型[6-10]。本研究中的3份單株樣本與72份連蕊茶組和毛蕊茶組的樣本一起開(kāi)展測(cè)序與分析。在整體分析SNP位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)O-1、O-2和E-1 3個(gè)樣本進(jìn)行相似度〔相似度=(兩兩分型一致且不缺失/兩兩有分型且不缺失)×100%〕比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 野外觀測(cè)與原始文獻(xiàn)描述的比較

整體而言，在原生境和遷地栽培環(huán)境，作孚連蕊茶的葉披針形或長(zhǎng)圓形及游離花絲被毛等主要識(shí)別特征與原始文獻(xiàn)描述基本一致，但其生活型和花部特征等性狀存在差異。原始文獻(xiàn)描述中生活型為灌木，而在原生境中存在灌木和小喬木(圖1-A)2種生活型；原始文獻(xiàn)描述中花1～2朵頂生，白色或初花時(shí)外部花瓣略被紫紅色，而在原生境和遷地栽培環(huán)境中均為頂生和腋生，花蕾白色或紫紅色(圖1-B)；原始文獻(xiàn)描述中花梗長(zhǎng)5～6 mm，萼片長(zhǎng)2 mm，而在原生境和遷地栽培環(huán)境中花梗及萼片總長(zhǎng)6～12 mm，且在遷地栽培環(huán)境中花瓣存在全部被紫紅色的特征(圖1-D1,D2,D3)；原始文獻(xiàn)描述中游離花絲疏被毛，柱頭3裂，裂片長(zhǎng)1 mm，而在原生境和遷地栽培環(huán)境中游離花絲疏被毛或近無(wú)毛，柱頭3裂，裂片長(zhǎng)不足1 mm，或1～3 mm(圖1-D1)。

原始文獻(xiàn)描述對(duì)作孚連蕊茶幼葉顏色、果實(shí)及種子等性狀未做說(shuō)明。原生境和遷地栽培環(huán)境中作孚連蕊茶幼葉綠色或紫紅色；蒴果近球形(圖1-C)，橫徑5～13 mm，1室，種子1粒；種子近球形，深褐色；盛花期為3月至4月，為連蕊茶組中花期較晚的資源。

A. 小喬木Small tree. B. 花蕾Flower bud. C. 果實(shí)Fruit. D1,D2,D3. 花Flower: D1. 花瓣白色White petals; D2. 外輪花瓣被紫紅色Outer petals with purplish red; D3. 花瓣被紫紅色Petals with purplish red.

2.2 SNP位點(diǎn)相似度的比較

基于Super-GBS技術(shù)的SNP位點(diǎn)相似度的比較結(jié)果表明：供試3個(gè)樣本共篩選出兩兩有分型且不缺失的SNP位點(diǎn)163 371個(gè)，3個(gè)樣本共有SNP位點(diǎn)147 436個(gè)，其中，O-1和O-2兩兩分型一致且不缺失的位點(diǎn)4 942個(gè)，共有位點(diǎn)152 378個(gè)，相似度為93.27%；E-1和O-1兩兩分型一致且不缺失的位點(diǎn)4 747個(gè)，共有位點(diǎn)152 183個(gè)，相似度為93.15%；E-1和O-2兩兩分型一致且不缺失的位點(diǎn)4 828個(gè)，共有位點(diǎn)152 264個(gè)，相似度為93.20%；E-1、O-1和O-2特異的位點(diǎn)分別為6 360、6 246和6 165個(gè)。

3 討論和結(jié)論

與原始文獻(xiàn)描述相比，作孚連蕊茶在原生境及遷地栽培環(huán)境的形態(tài)特征差異主要體現(xiàn)在生活型、花蕾著生方式和花瓣顏色等性狀，作孚連蕊茶的主要觀賞特征及典型識(shí)別特征可以概括為：灌木或小喬木；葉披針形或長(zhǎng)圓形，葉長(zhǎng)3.0～5.5 cm，寬1.2～1.7 cm；花頂生和腋生，花蕾白色或紫紅色；花梗及萼片總長(zhǎng)6～12 mm，苞片散生于花梗；花瓣白色，或外輪花瓣被紫紅色，或全部花瓣紫被紅色；游離花絲多疏被毛；子房及花柱無(wú)毛；盛花期3月至4月，為連蕊茶組中花期較晚的種類。作孚連蕊茶在生活型、葉及花等性狀上的特點(diǎn)，可使其成為園林景觀、種質(zhì)創(chuàng)新的優(yōu)秀資源，在后續(xù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用中，可關(guān)注花蕾和花紫紅色等形態(tài)特征。SNP位點(diǎn)相似度分析結(jié)果顯示：供試3個(gè)樣本兩兩之間的相似度均在93%以上，結(jié)合作者對(duì)Super-GBS測(cè)序與分析中同一物種不同單株樣本相似度比較的結(jié)果，初步判斷3個(gè)單株為作孚連蕊茶的種內(nèi)變異。

本研究沿用Sealy[11]和張宏達(dá)[12]將作孚連蕊茶作為獨(dú)立物種的觀點(diǎn)，但閔天祿[13]將作孚連蕊茶作為毛蕊柃葉連蕊茶〔Camelliaeuryoidesvar.nokoensis(Hayata) Ming〕的異名，呂林玲[14]將其處理為Camelliasynapticavar.parviovata(Chang) Ming 的異名，可見(jiàn)該物種的分類地位仍需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝上海辰山植物園杜誠(chéng)高級(jí)工程師和葛斌杰高級(jí)工程師在臘葉標(biāo)本及原始文獻(xiàn)方面給予的幫助和支持！