巴西橡膠樹YABBY基因家族鑒定及表達(dá)分析

張鴻韜，肖小虎，陽江華，秦云霞，龍翔宇，殷紅彥，方永軍*

巴西橡膠樹YABBY基因家族鑒定及表達(dá)分析

張鴻韜1,2，肖小虎2，陽江華2，秦云霞2，龍翔宇2，殷紅彥1，方永軍2*

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南海口 570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海南?？?571101

YABBY基因家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物葉片和花器官的發(fā)育以及非生物脅迫應(yīng)答中起重要的調(diào)控作用。本研究從橡膠樹基因組中鑒定得到11個HbYABBY家族成員，并從基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化及基因表達(dá)等方面進(jìn)行分析。結(jié)果顯示11個橡膠樹HbYABBY基因分布在9條染色體上，編碼蛋白的長度在132～241個氨基酸，分子量在14.75～26.41 kDa，啟動子區(qū)域含有豐富的光響應(yīng)元件。該基因家族具有顯著的組織表達(dá)特異性，葉片和花中高表達(dá)，而在膠乳和根中基本不表達(dá)。葉片的發(fā)育過程中，除上調(diào)表達(dá)，另外9個HbYABBY基因均顯著持續(xù)下調(diào)表達(dá)，表明深度參與橡膠樹葉片發(fā)育調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組測序和熒光定量檢測均發(fā)現(xiàn)所有成員受高溫誘導(dǎo)持續(xù)下調(diào)表達(dá)，但不受低溫脅迫誘導(dǎo)，暗示了HbYABBY在橡膠樹的高溫脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用。本研究以熱帶經(jīng)濟林木巴西橡膠樹為研究對象，對YABBY轉(zhuǎn)錄因子基因家族的理化特征、表達(dá)及功能進(jìn)行了初步分析，為該基因家族功能的深度研究提供了理論依據(jù)和參考。

巴西橡膠樹；YABBY基因家族；轉(zhuǎn)錄因子；基因表達(dá)分析

YABBY基因家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指蛋白超家族的亞族，該亞家族成員蛋白序列在N端具有保守的C2C2的鋅指結(jié)構(gòu)域，C端具有螺旋-環(huán)-螺旋狀的結(jié)構(gòu)域（稱為YABBY結(jié)構(gòu)域）[1-2]。YABBY基因家族的表達(dá)和功能在植物中獲得廣泛研究，它們不僅參與植物葉片極性建立、花器官生長發(fā)育調(diào)控、植物遠(yuǎn)軸極性形成[3]，還參與干旱、鹽等非生物脅迫應(yīng)答和脫落酸（ABA）等激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。擬南芥中YABBY家族成員通過異位表達(dá)參與側(cè)生器官和遠(yuǎn)軸細(xì)胞的形成發(fā)育[5]，白菜中參與葉球的發(fā)育[6]，棉花中GhYABBY家族成員參與胚珠、花、蕾和頂端分生組織發(fā)育調(diào)控[7-8]。此外，在玉米、水稻、草莓等植物中也發(fā)現(xiàn)YABBY基因家族參與分生組織、葉片及果實等的發(fā)育調(diào)控[9-11]。除了調(diào)控生長發(fā)育，還參與激素信號傳導(dǎo)和脅迫應(yīng)答，水稻反饋調(diào)節(jié)赤霉素的合成[12-13]，小麥的可能通過對脫落酸與茉莉酸甲酯信號應(yīng)答對抗逆性發(fā)揮重要作用[14]。大豆的YABBY家族成員、和參與干旱、鹽和脫落酸（ABA）脅迫等非生物脅迫[15]。草莓中與茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白互作參與鹽脅迫反應(yīng)[16]。YABBY轉(zhuǎn)錄因子可以通過光響應(yīng)元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，如過表達(dá)能提高兩頭毛（）花青素的含量與葉片光合作用的能力[17]，甘蔗參與糖運輸和光合作用的調(diào)控[18]。

天然橡膠作為四大工業(yè)原料之一，在國民經(jīng)濟發(fā)展和國防建設(shè)中有著不可替代的重要作用[19]。巴西橡膠樹（）是天然橡膠的幾乎唯一來源[20-21]，是我國及世界熱區(qū)的重要經(jīng)濟作物。我國為非傳統(tǒng)植膠區(qū)[22]，是世界上最大的天然橡膠消費國和天然橡膠進(jìn)口國。開展橡膠樹的分子生物學(xué)研究對于產(chǎn)業(yè)發(fā)展和保障戰(zhàn)略安全均具有重要意義。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子YABBY基因家族在植物中廣泛存在且具有重要作用，但橡膠樹中尚未見相關(guān)的研究報道，本課題基于‘熱研7-33-97’全基因組圖譜結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，鑒定到橡膠樹11個YABBY家族成員，并對其從基因結(jié)構(gòu)、啟動子調(diào)控元件、染色體定位與共線性、系統(tǒng)進(jìn)化及基因表達(dá)等方面進(jìn)行分析，研究結(jié)果初步闡明橡膠樹YABBY基因家族特性，為該基因家族功能的深入解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的試驗材料為定植于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場的橡膠樹品系‘熱研7-33-97’，試驗用樹正常開割3年，不同組織（膠乳、樹皮、葉片、雄花、雌花、種子和根）均取自于該材料。

1.2 方法

1.2.1 HbYABBY基因家族成員鑒定及其理化性質(zhì)分析 利用PlantTFdb數(shù)據(jù)庫中的擬南芥YABBY蛋白序列進(jìn)行BLAST比對搜索和PFAM數(shù)據(jù)的YABBY隱馬科夫模型文件進(jìn)行HMMER檢索，分別篩選橡膠樹YABBY蛋白，候選蛋白去除冗余后通過NCBI數(shù)據(jù)庫的CDD進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域檢測，最終得到11個HbYABBY家族成員。分別利用在線工具網(wǎng)站Plant-mPLoc（http://www. csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）和ExPASy Prot Param（https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位、等電點和分子量計算。

1.2.2 HbYABBY染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、啟動子及家族進(jìn)化分析 根據(jù)橡膠樹基因組注釋信息文件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、染色體定位以及共線性關(guān)系分析；分別利用NCBI Batch CD-search與MEME （https://meme-suite.org/meme/）網(wǎng)站在線進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和motif預(yù)測[23]；通過Perl腳本截取基因上游2000 bp作為啟動子區(qū)域，利用PlantCARE在線進(jìn)行順式作用元件分析；從PlantTFdb數(shù)據(jù)庫下載模式植物擬南芥，以及大戟科植物蓖麻、木薯、麻風(fēng)樹的YABBY蛋白序列，通過DNAMAN進(jìn)行蛋白序列聯(lián)配，再用MEGA11的neighbor-joinin法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[24]，Bootstrap method設(shè)置為1000；最后通過TBtools軟件將結(jié)果進(jìn)行圖示化[25]，并用AI軟件進(jìn)行編輯美化。

1.2.3 橡膠樹基因差異表達(dá)分析 分別對橡膠樹基因不同組織、葉片發(fā)育時期、胚發(fā)育時期以及高低溫處理葉片樣品進(jìn)行RNA提取，送公司采用Hiseq平臺進(jìn)行雙末端測序，數(shù)據(jù)前處理后進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組分析，計算每個轉(zhuǎn)錄本的FPKM值表示表達(dá)量，并將結(jié)果以熱圖形式展示。

熒光定量試驗中，利用在線網(wǎng)站NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi. nlm.nih. gov/ tools/primer-blast/index.cgi）設(shè)計特異性引物（表1）。用RNA Easy Fast分別提取橡膠樹‘熱研7-33-97’葉片發(fā)育4個時期（古銅期、變色期、淡綠期、亮綠期）的總RNA，再用大連寶生物公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。以葉片4個時期cDNA為模板，采用TB Green? Premix Ex Taq?進(jìn)行RT-qPCR。選擇18S rRNA為表達(dá)內(nèi)參基因，使用2–ΔΔCT法對熒光定量結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹HbYABBY基因家族成員鑒定與理化特性分析

利用模式植物擬南芥的YABBY蛋白序列和橡膠樹蛋白序列集，分別進(jìn)行同源比對和隱馬科夫模型檢索預(yù)測橡膠樹基因，在去除冗余及結(jié)構(gòu)域分析后最終得到11個HbYABBY基因家族成員，根據(jù)擬南芥YABBY亞組成員，分別命名為、、、、、、、、、和。分析結(jié)果顯示，HbYABBY內(nèi)含子數(shù)量保守在5～6個不等，蛋白序列長度在132～241（aa）之間，分子量分布在14.75～26.41（kDa），等電點在6.25～9.38之間，除HbYAB1d親水系數(shù)大于0，其余成員在–0.934～ –0.161之間，說明大部分成員為親水蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，YABBY定位在細(xì)胞核且不存在信號肽（表2）。

表1 本研究所使用RT-qPCR引物

2.2 橡膠樹HbYABBY染色體定位及共線性分析

利用本實驗室完成的橡膠樹染色體基因組序列和注釋結(jié)果進(jìn)行HbYABBY家族成員的染色體定位和共線性分析。如圖1所示，11個HbYABBY家族成員分別分布在LG01、LG03、LG05、LG07、LG08、LG09、LG14、LG15和LG18共9條染色體上，除14號染色體含有、和三個基因外，其他8條染色體均只有1個家族成員。其中3號、9號以及14號染色體該基因區(qū)段具有共線性關(guān)系，推測在基因組進(jìn)化過程中可能發(fā)生了2次大片段重復(fù)且插入不同染色體區(qū)域。14號染色體上的和的共線性關(guān)系暗示了該染色體內(nèi)部曾經(jīng)發(fā)生大片段重復(fù)和插入事件。此外，15號和18號染色體上的和也為共線性關(guān)系。以上結(jié)果表明，橡膠樹基因主要伴隨染色體大片段復(fù)制而擴張。

表2 HbYABBY基因理化性質(zhì)分析

圖1 HbYABBY基因家族染色體定位及共線性分析

2.3 橡膠樹HbYABBY蛋白結(jié)構(gòu)分析

擬南芥AtYABBY蛋白序列含有2個保守結(jié)構(gòu)，即在N端的鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger-like）和C端的YABBY（Helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域[26]。通過與擬南芥AtYABBY基因家族成員的氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbYABBY基因家族與擬南芥結(jié)構(gòu)域基本一致，同樣存在N端的鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的YABBY結(jié)構(gòu)域（圖2A）。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，橡膠樹YABBY基因家族成員均成對出現(xiàn)（HbYAB1a與HbYAB1b；HbYAB1c與HbYAB1d；HbYAB5a與HbYAB5b；HbCRC1與HbCRC2；HbYAB2a與HbYAB2b），具有共線性關(guān)系的基因聚為一類（圖2B）。通過橡膠樹基因組注釋文件和HbYABBY蛋白序列進(jìn)行的基因結(jié)構(gòu)（外顯子、內(nèi)含子）分析表明，HbYABBY家族成員的內(nèi)含子數(shù)量較保守均在5～6個之間，成對基因的基因大小和結(jié)構(gòu)更為一致（圖2C）。利用NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫掃描顯示橡膠樹所有家族成員均含有YABBY家族或超家族保守結(jié)構(gòu)域（圖2D）。通過MEME鑒定到3個motif，不同成員motif數(shù)量在1～3個不等，相同進(jìn)化分支成員的motif種類和數(shù)量更為接近，但也存在motif缺失情況，如HbYAB1d相對于HbYAB1a、HbYAB1b和HbYAB1c少了motif1，HbYAB5b相對于HbYAB5a也少了motif1，說明基因復(fù)制后又發(fā)生了獨立的進(jìn)化（圖2E）。

圖2 橡膠樹HbYABBY蛋白序列結(jié)構(gòu)特征

2.4 橡膠樹HbYABBY基因啟動子分析

分別截取11個基因起始位點上游的2000 bp序列作為基因啟動子區(qū)，利用在線工具PlantCARE預(yù)測啟動子區(qū)可能存在的順式作用元件，鑒定到光響應(yīng)元件65個、茉莉酸甲酯響應(yīng)16個、赤霉素響應(yīng)10個、厭氧誘導(dǎo)21個、低溫響應(yīng)5個、脫落酸響應(yīng)12個、水楊酸響應(yīng)7個、逆境應(yīng)答響應(yīng)7個、分生組織響應(yīng)3個、愈傷響應(yīng)2個（圖3），表明可能參與多種植物激素和環(huán)境脅迫應(yīng)答，并在植物生長發(fā)育中起作用。特別是光響應(yīng)元件，存在于全部11個基因的啟動子區(qū)且數(shù)量眾多在2～8個不等，預(yù)示著該基因家族在光應(yīng)答和光形態(tài)建成中發(fā)揮重要的作用。此外有9個成員（除和外的）啟動子區(qū)含有赤霉素響應(yīng)元件，8個成員啟動子區(qū)含有厭氧誘導(dǎo)元件，7個成員含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件水楊酸響應(yīng)元件，6個成員含有脫落酸響應(yīng)元件和逆境應(yīng)答響應(yīng)元件，4個成員含有低溫響應(yīng)元件，2個成員含有愈傷響應(yīng)元件和分生組織響應(yīng)元件（圖3）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蛋白序列高度同源的基因?qū)Φ膯幼訁^(qū)作用元件種類和數(shù)量存在較大差異，預(yù)示了基因擴增后的功能分化。

圖3 橡膠樹HbYABBY基因啟動子區(qū)順式作用元件示意圖

2.5 橡膠樹HbYABBY基因家族進(jìn)化分析

從PlantTFdb中下載模式植物擬南芥（7個）及大戟科植物木薯（15個）、蓖麻（6個）、麻風(fēng)樹（8個）YABBY家族蛋白序列與本研究鑒定得到的11個橡膠樹YABBY家族成員，共計47個蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。分析結(jié)果顯示植物YABBY家族可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四個亞組，橡膠樹HbYABBY家族成員僅存在于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亞組中，其中亞組Ⅰ中包括HbYAB1a、HbYAB1b、HbYAB1c、HbYAB1d和HbCRC2五個成員。亞組Ⅱ中包含HbYAB4a和HbCRC1兩個成員。亞組Ⅲ中包含HbYAB2a、HbYAB2b、HbYAB5a和HbYAB5b四個成員（圖4）。同一分支中橡膠樹與木薯YABBY聚集在一起，反映了橡膠樹和木薯較近的系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系。此外，4個同源基因?qū)Γ℉bYAB1a和HbYAB1b；HbYAB1c和HbYAB1d；HbYAB2a和HbYAB2b；HbYAB5a和HbYAB5b）蛋白在進(jìn)化樹上的位置與基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。

2.6 橡膠樹HbYABBY基因家族表達(dá)分析

橡膠樹不同組織中HbYABBY基因的表達(dá)分析表明該家族成員具有顯著的組織表達(dá)特異性，主要在葉片、雌花和雄花中表達(dá)，而在膠乳、根、樹皮和種子中極低表達(dá)或不表達(dá)，其中在所有組織中均不表達(dá)。葉片中表達(dá)豐度最高的依次是、和，另外有3個基因、和在葉片中不表達(dá)。雌花中表達(dá)豐度最高的依次是、、、、和，其他成員均為中低豐度表達(dá)。雄花中表達(dá)豐度最高的依次是、和，其他成員為低表達(dá)或不表達(dá)（圖5）。以上結(jié)果預(yù)示了HbYABBY基因家族在橡膠樹中主要參與光形態(tài)建成和生長發(fā)育，而對膠乳合成作用不明顯。

在胚中和兩個基因表達(dá)豐度最高，并且在發(fā)育過程中持續(xù)高表達(dá)，但變化趨勢不明顯。、和在胚中低豐度表達(dá)，并且隨胚的發(fā)育表達(dá)上調(diào)，分別在第10天達(dá)到最高峰值。和低豐度表達(dá)，且在發(fā)育過程中變化趨勢不明顯。此外，成員和在胚中不表達(dá)（圖6）。

葉片中除了和不表達(dá)外，其余9個基因均中高表達(dá)。在葉片發(fā)育過程中基因呈略微上調(diào)表達(dá)趨勢，而其余8個基因（、、、、、、和）均呈顯著下調(diào)表達(dá)趨勢，即在古銅期表達(dá)豐度最高，此后遞減，在亮綠期達(dá)到最低值。同源基因?qū)驮诠陪~期葉片中FPKM值分別高達(dá)299.46和167.05，到了成熟的亮綠期幾乎不表達(dá)（圖6），它們參與葉片發(fā)育的調(diào)控機制需要進(jìn)一步的研究。此外，本課題組在分析橡膠樹葉片分別進(jìn)行45℃高溫與4℃低溫脅迫處理的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，高溫處理下HbYABBY整體呈下調(diào)表達(dá)，其中、、和隨處理時間增加表達(dá)下降趨勢明顯，處理前后下調(diào)幅度達(dá)2倍以上。低溫處理中HbYABB所有成員的表達(dá)均沒有明顯變化（圖7）?；騾⑴c高溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)，有助于橡膠樹對熱帶高溫環(huán)境的適應(yīng)。

鑒于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中HbYABBY基因在橡膠樹葉片形態(tài)建成中的明顯作用，本研究選擇了6個在葉片發(fā)育過程中表達(dá)變化趨勢明顯的家族基因成員設(shè)計引物，以古銅期、變色期、淡綠期和亮綠期葉片RNA為模版進(jìn)行RT-qPCR實驗，驗證它們的表達(dá)特征和趨勢，并與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖8所示，、和三個基因無論在整體表達(dá)趨勢還是各個階段的表達(dá)變化幅度在RNA-seq和熒光定量分析結(jié)果中高度一致。和雖然在不同發(fā)育階段的2種實驗中表達(dá)水平變化幅度不完全一致，但整體下調(diào)表達(dá)趨勢一致，同樣，雖然的亮綠期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)略微上調(diào)但整體趨勢依然高度一致。綜上所述，選擇的6個基因在2種不同實驗方法中結(jié)果高度一致，能彼此驗證，表明了相關(guān)分析結(jié)果的可靠性。

圖4 YABBY蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 HbYABBY基因在橡膠樹不同組織中的表達(dá)分析

圖6 HbYABBYs在胚及葉片的不同發(fā)育時期基因表達(dá)分析

圖7 HbYABBYs在葉片高低溫處理下的表達(dá)分析

3 討論

3.1 植物YABBY功能重要，進(jìn)化保守

作為一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在生長發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答中起著重要的作用，但目前該轉(zhuǎn)錄因子在包括橡膠樹在內(nèi)的具有重要經(jīng)濟價值的大戟科植物中尚無相關(guān)研究和報道。橡膠樹全基因組測序完成[27]，使我們得以全面系統(tǒng)地發(fā)掘和研究在橡膠樹中的特征和功能。

本研究從全基因組水平鑒定得到11個橡膠樹HbYABBY基因家族成員，分布在9條染色體上，其中有5條染色體的該基因區(qū)段存在共線關(guān)系，揭示橡膠樹中該基因家族通過全基因組復(fù)制或大片段重復(fù)進(jìn)行基因擴張。與模式植物擬南芥的AtYABBY蛋白序列比較分析發(fā)現(xiàn)該家族功能域蛋白序列高度相似，在基因結(jié)構(gòu)上內(nèi)含子數(shù)量均在5～6個之間，暗示了植物YABBY家族進(jìn)化過程中保守，在植物中發(fā)揮相似的重要功能[26]。有意思的是，包括大戟科的木薯、蓖麻等植物YABBY的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，該家族分為4個亞組，橡膠樹YABBY成員分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分支，但在Ⅳ中缺失，其中亞組Ⅰ中成員多達(dá)5個，推測大戟科植物在物種分化后該基因家族在橡膠樹中發(fā)生了不同于其他植物的獨立進(jìn)化。

3.2 YABBY在橡膠樹器官發(fā)育及高溫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用

轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子互作激活靶基因的表達(dá)從而發(fā)揮調(diào)控作用，利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)對HbYABBY基因家族的表達(dá)進(jìn)行全面分析揭示它們在橡膠樹中的功能，結(jié)果表明HbYABBY基因家族具有很強的組織和時空表達(dá)特異性。其中在花中顯著高表達(dá)，其次在葉片中較高豐度表達(dá)，而在膠乳、根、樹皮和種子低表達(dá)或不表達(dá)，這與擬南芥YABBY基因家族在側(cè)生器官表達(dá)研究的結(jié)果一致[5]。、、等基因在花中高表達(dá)，其中和同時也在胚中相對高表達(dá)，并且在胚發(fā)育過程中也持續(xù)高豐度表達(dá)，表明它們參與了花器官及胚的形成和生長發(fā)育。葉片是HbYABBY除花之后次高表達(dá)的組織，并且基因家族在葉片發(fā)育過程中呈明顯下調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組測序和RT-qPCR均驗證了這一趨勢，表明該基因家族深度參與葉片的發(fā)育和形態(tài)建成。此外，溫度脅迫實驗顯示葉片中HbYABBY基因受高溫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)但不受低溫誘導(dǎo)，暗示了HbYABBY基因?qū)ο鹉z樹在熱帶地區(qū)生長抗高溫方面具有調(diào)控作用，但在抗寒中作用不明顯。橡膠樹11個HbYABBY家族成員中在所有樣品檢測中不表達(dá)，推測該基因可能在進(jìn)化過程中發(fā)生去功能化或者具有其他特異表達(dá)特性。上述結(jié)果表明了橡膠樹HbYABBY家族成員在不同組織、不同發(fā)育時期以及高低溫處理葉片中的表達(dá)特性，反映了該基因家族的功能多樣性。

圖8 橡膠樹6個HbYABBYs基因在葉片發(fā)育過程中的熒光定量PCR和轉(zhuǎn)錄組分析比較

啟動子控制著基因轉(zhuǎn)錄的時間和轉(zhuǎn)錄表達(dá)的強度，作用因子通過與啟動子區(qū)的順式作用元件發(fā)生特異性互作來激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的[28-29]。對11個HbYABBY基因家族的啟動子區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)光響應(yīng)元件是所有成員都含有且數(shù)量最多的順式作用元件，這與轉(zhuǎn)錄組分析HbYABBY家族在橡膠樹葉片形態(tài)建成中具有非常重要的作用相一致。此外，植物激素應(yīng)答元件在基因啟動子區(qū)的含量比較多，如脫落酸、厭氧誘導(dǎo)等，表明該基因家族參與了諸如干旱等非生物脅迫下代謝調(diào)節(jié)[30-31]。相對于擬南芥，基因在啟動子區(qū)的植物激素元件和非生物脅迫元件更多，意味著基因在調(diào)控橡膠樹逆境非生物脅迫應(yīng)答中具有更重要的作用[31]。

本研究通過生信方法從全基因組水平對橡膠樹YABBY家族進(jìn)行了成員鑒定，從染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守功能域、系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行了全面的分析，對組織、胚和葉片發(fā)育的不同時期以及高低溫處理葉片材料進(jìn)行表達(dá)分析，并通過RT-qPCR做了進(jìn)一步驗證，篩選出主要表達(dá)成員，初步預(yù)測了各成員基因的功能，為深入研究橡膠樹及植物的YABBY基因家族功能提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

[1] CéDRIC F, K F S, J C S, BOJIAN Z, P S C, L B J. Evolution of the YABBY gene family in seed plants[J]. Evolution & Development, 2016, 18(2): 116-126.

[2] PINYOPICH A, DITTA G S, SAVIDGE B, LILJEGREN S J, BAUMANN E, WISMAN E, YANOFSKY M F. Assessing the redundancy of MADS-box genes during carpel and ovule development [J]. Nature, 2003, 424(6944): 85-88.

[3] BOWMAN J L, SMYTH D R. CRABS CLAW, a gene that regulates carpel and nectary development in, encodes a novel protein with zinc finger and helix-loop-helix domains[J]. Development, 1999, 126(11): 2387-2396.

[4] ZHAO S P, LU D, YU T F, JI Y J, ZHENG W J, ZHANG S X, CHAI S C, CHEN Z Y, CUI X Y. Genome-wide analysis of the YABBY family in soybean and functional identification of GmYABBY10 involvement in high salt and drought stresses[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2017, 119: 132-146.

[5] SIEGFRIED K R, ESHED Y, BAUM S F, OTSUGA D, DREWS G N, BOWMAN J L. Members of the YABBY gene family specify abaxial cell fate in[J]. Development, 1999, 126(18): 4117-4128.

[6] 李曉波, 楊翠翠, 邱念偉. 擬南芥和大白菜YABBY蛋白家族的生物信息學(xué)分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 44(12): 1-6.

LI X B, YANG C C, QIU N W. Bioinformatic analysis of YABBY protein family inand Chinese cabbage[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2012, 44(12): 1-6. (in Chinese)

[7] 徐珍珍, 倪萬潮, 張香桂, 郭 琪, 徐 鵬, 沈新蓮. 棉花YABBY基因家族的全基因組分析[J]. 生物技術(shù)通報, 2015, 31(11): 146-152.

XU Z Z, NI W C, ZHANG X G, GUO Q, XU P, SHEN X L. Genome-wide analysis of the YABBY gene family in cotton[J]. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(11): 146-152. (in Chinese)

[8] YANG Z, QIAN G, WANG L, JIN Y, XIN J , ZHI L, QIN W, YANG Z, LU L, QUANJIA C, CHEN Q. Genome-wide study of YABBY genes in upland cotton and their expression patterns under different stresses[J]. Frontiers in Genetics, 2018, 9: 33

[9] 葛 敏, 呂遠(yuǎn)大, 張體付, 李 坦, 張曉林, 趙 涵. 玉米YABBY基因家族的全基因組鑒定與分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 30(6): 1267-1272.

GE M, LV Y D, ZHANG T F, LI T, ZHANG X L, ZHAO H. Genome-wide identification and analysis of YABBY gene family in maize[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2014, 30(6): 1267-1272. (in Chinese)

[10] LIU H L, XU Y Y, XU Z H, CHONG K. A rice YABBY gene,, preferentially expresses in developing vascular tissue[J]. Development Genes and Evolution, 2007, 217(9): 629-637.

[11] LUO J, ZHOU Y, PAN Q, MU Q, GU T. Characterization of YABBY genes and the correlation between their transcript levels and histone modifications in strawberry[J]. Scientia Horticulturae, 2022, 295: 110815.

[12] JANG S, HUR J, KIM S J, HAN M J, KIM S R, AN G. Ectopic expression ofcauses extra stamens and carpels in rice[J]. Plant Molecular Biology, 2004, 56(1): 133-143.

[13] TORIBA T, HARADA K, TAKAMURA A, NAKAMURA H, ICHIKAWA H, SUZAKI T, HIRANO H Y. Molecular characterization the YABBY gene family inand expression analysis of[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2007, 277(5): 457-468.

[14] 葛 川, 楊 榮, 李劉軍, 張建誠, 鄭興衛(wèi). 小麥全基因組中YABBY基因家族的篩選與特征分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2019, 21(8): 11-18.

GE C, YANG R, LI L J, ZHANG J C, ZHENG X W. Genome-wide identification and characterization of the YABBY family genes of wheat (L.)[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2019, 21(8): 11-18. (in Chinese)

[15] YANG H, SHI G, LI X, HU D, CUI Y, HOU J, YU D, HUANG F. Overexpression of a soybean YABBY gene,, causes leaf curling in[J]. BioMed Central, 2019, 19: 234.

[16] GARRIDO-BIGOTES A, TORREJóN M, SOLANO R, FIGUEROA C R. Interactions of JAZ repressors with anthocyanin biosynthesis-related transcription factors of[J]. Agronomy, 2020, 10(10): 1586.

[17] SUN X, GUAN Y, HU X. Isolation and characterization ofgene from[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32(6): 1219-1227.

[18] SHE Z, HUANG X, ASLAM M, WANG L, YAN M, QIN R, CHEN Y, QIN Y, NIU X. Expression characterization and cross-species complementation uncover the functional conservation of YABBY genes for leaf abaxial polarity and carpel polarity establishment in[J]. BMC Plant Biology, 2022, 22(1): 1-17.

[19] PUSKAS J E, GAUTRIAUD E, DEFFIEUX A, KENNEDY J P. Natural rubber biosynthesis—a living carbocationic polymerization?[J]. Progress in Polymer Science, 2006, 31(6): 533-548.

[20] 張宇航, 潘冉冉, 李 飛, 陶志強, 王 英, 高和瓊, 莊南生. 巴西橡膠樹基因的克隆、物理定位及表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報, 2020, 41(9): 1723-1732.

ZHANG Y H, PAN R R, LI F, TAO Z Q, WANG Y, GAO H Q, ZHUANG N S. Cloning, Physical location and expression analysis ofin[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020, 41(9): 1723-1723. (in Chinese)

[21] 金華斌, 田維敏, 史敏晶. 我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展概況及現(xiàn)狀分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 37(5): 98-104.

JIN H B, TIAN W M, SHI M J. Current situation and industrial development of natural rubber in China[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2017, 37(5): 98-104. (in Chinese)

[22] 王立豐, 王紀(jì)坤, 謝貴水. 巴西橡膠樹抗旱機制研究進(jìn)展[J].熱帶作物學(xué)報, 2015, 36(2): 426-431.

WANG L K, WANG J K, XIE G S. Research progresses and prospects of drought tolerant mechanism in rubber tree (Müll. Arg.)[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2015, 36(2): 426-431. (in Chinese)

[23] BAILEY T L, BODEN M, BUSKE F A, FRITH M, GRANT C E, CLEMENTI L, REN J, LI W W, NOBLE W S. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 37(suppl_2): W202-W208.

[24] KUMAR S, TAMURA K, NEI M. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers[J]. Bioinformatics, 1994, 10(2): 189-191.

[25] CHEN C, CHEN H, ZHANG Y, THOMAS H R, FRANK M H, HE Y, XIA R. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant, 2020, 13(8): 1194-1202.

[26] 邵紅霞, 陳鴻飛, 張 東, 吳海芹, 趙彩平, 韓明玉. 蘋果YABBY基因家族的鑒定、進(jìn)化及表達(dá)分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2017, 29(7): 1129-1138.

SHAO H X, CHEN H F, ZHANG D, WU H Q, ZHAO C P, HAN M Y. Identification, evolution and expression analysis of the YABBY gene family in apple[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2017, 29(7): 1129-1138. (in Chinese)

[27] TANG C, YANG M, FANG Y, LUO Y, GAO S, XIAO X, AN Z, ZHOU B, ZHANG B, TAN X. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants, 2016, 2(6): 1-10.

[28] RIECHMANN J L, HEARD J, MARTIN G, REUBER L, JIANG C Z, KEDDIE J, ADAM L, PINEDA O, RATCLIFFE O, SAMAHA R.transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes[J]. Science, 2000, 290(5499): 2105-2110.

[29] BURDO B, GRAY J, GOETTING-MINESKY M P, WITTLER B, HUNT M, LI T, GROTEWOLD E. The maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics[J]. The Plant Journal, 2014, 80(2): 356-366.

[30] OSAKABE Y, YAMAGUCHI‐SHINOZAKI K, SHINO ZAKI K, TRAN L S P. ABA control of plant macroelement membrane transport systems in response to water deficit and high salinity[J]. New Phytologist, 2014, 202(1): 35-49.

[31] SIMPSON S D, NAKASHIMA K, NARUSAKA Y, SEKI M, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI‐SHINOZAKI K. Two different novel cis‐acting elements of erd1, a clpA homologousgene function in induction by dehydration stress and dark‐induced senescence[J]. The Plant Journal, 2003, 33(2): 259-70.

Identification and Expression Analysis of YABBY Gene Family in

ZHANG Hongtao1,2, XIAO Xiaohu2, YANG Jianghua2, QIN Yunxia2, LONG Xiangyu2, YIN Hongyan1, FANG Yongjun2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Rubber Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571101, China

YABBY genes family is a plant-specific transcription factor, which plays an important role in the development of plant leaves, floral organs and abiotic stress response, but it has not been reported in rubber tree so far. In this study, elevengenes were identified from the genome of, and the gene structure, promoter regulatory elements, chromosome location and collinearity, phylogeny and gene expression were analyzed. The results showed that thefamily genes were distributed on nine chromosomes. The length of the encoded protein was between 141 and 233 amino acids, and the molecular weight was ranged from 14.75 to 26.41kDa. The promoter regions contained response elements such as stress response, among which the number of light response elements was the largest. Gene transcriptional analysis showed thathad significant tissue-specific expression profile, eight genes were only highly expressed in leaves and flowers but not in latex and roots. During the leaf development, except for HbCRC1, the expression of the other 9were significantly down-regulated, which indicated thatwere deeply involved in the regulation of leaf development of rubber trees. Furthermore, both transcriptional and RT-qPCR experiments showed thatgenes were continuously down-regulated under high temperature treatment, indicating the regulatory roles in high temperature stress responses of rubber trees. In this paper,genes were firstly reported in, the physical and chemical characteristics, expressions and function of the genes were preliminarily studied, which would provide a solid foundation to investigate the functions and evolution ofgenes.

; YABBYgenes family; transcription factor; gene expression analysis

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.002

2022-06-07；

2022-07-14

國家自然科學(xué)基金面上項目（No. 31770711）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所基本科研業(yè)務(wù)費項目（No. 1630022020023）；國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2018YFD1000500）。

張鴻韜（1997—），男，碩士研究生，研究方向：橡膠樹產(chǎn)膠分子生物學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：方永軍（FANG Yongjun），E-mail：fangyj@foxmail.com。