纖維素降解細菌的分離篩選及鑒定

劉佳莉 舒菲

(河北環(huán)境工程學院生態(tài)學系，河北 秦皇島 066102)

緒論

我國目前還是一個重要的農(nóng)業(yè)發(fā)展大國，作物的播種規(guī)模居全球第一[1]。長期以來，秸稈作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物以焚燒的形式處理，浪費資源，破壞環(huán)境，危害人畜健康，目前，東北三省地區(qū)已經(jīng)成為我國秸稈焚燒問題最為嚴重的地區(qū)[2]。國家也出臺了許多有關(guān)秸稈禁焚的政策，禁止秸稈焚燒主要依靠政府出臺的相關(guān)政策及監(jiān)管力度，這在一定程度上降低了焚燒秸稈的頻率，秸稈不焚燒，勢必造成大量秸稈堆積，而解決秸稈堆積這一難點的關(guān)鍵之處在于如何加強秸稈的綜合利用[3]。采取何種恰當?shù)募夹g(shù)路線和方案，用科學的技術(shù)手段將農(nóng)業(yè)廢棄物資源化，是當前我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需要解決的問題之一[4]。

我國對于農(nóng)作物秸稈資源的綜合利用方式以秸稈肥料化、秸稈飼料化為主，其次是秸稈的燃料化利用，除此之外還有秸稈基料化與原料化利用，其中秸稈肥料化的利用量占秸稈總量的47.3%[5]，對秸稈進行堆肥處理，添加腐熟劑，腐熟完成后形成有機肥再還田，可有效解決秸稈直接還田所引發(fā)的問題。

在自然界中存在大量產(chǎn)纖維素酶的細菌菌株，經(jīng)過對產(chǎn)纖維素酶細菌的分離、篩選和馴化，一般對人類和動物無害，還可以進一步提高纖維素資源再利用的效率[6]。本研究篩選具有解纖維素能力的細菌，確定各株細菌的產(chǎn)纖維素酶活力，利用產(chǎn)纖維素酶菌株制備微生物菌劑、腐熟劑，秸稈腐熟后可以作為有機肥還田，能夠改善農(nóng)田土壤肥力，減少化肥的施用，講求環(huán)境效益的同時也兼顧了經(jīng)濟效益。因此，從生境中篩選并培育產(chǎn)纖維素酶的菌株，對更加有效地利用纖維素這一可再生資源具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗土樣

土樣取于遼寧省沈陽市渾南區(qū)祝家街道秸稈還田土壤。

1.2 樣品預處理與菌株的分離純化

將土壤樣品中的草根、小石子揀出，后過1mm土壤篩。稱量5g土壤樣品加入到45mL無菌水中，置于恒溫搖床中震蕩30min。采用稀釋涂布平板法篩出土樣中的細菌菌株并進行分離純化。

1.3 纖維素降解菌的初篩

將純化后的菌株采用點接種法接種于CMC-Na培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d，待菌株長出后，用剛果紅染色法與濾紙崩解測試[7]進一步篩選分離菌株。

1.4 纖維素降解菌的復篩

參考薛潘[8]測定CMC-Na酶活力與FPA酶活力的方法，測定各菌株的2種酶活力的大小。

1.5 菌株拮抗試驗

取4個牛津杯小心放置在指示菌平板上，向1號牛津杯中注入80μL的無菌水作對照，另外3個牛津杯中分別注入已過濾的受試菌菌液80μL。37℃培養(yǎng)24h，若牛津杯周圍出現(xiàn)抑菌圈(透明圈)，說明菌株拮抗。測定抑菌圈大小來判斷其拮抗效應的大小。

1.6 細菌生長曲線的測定

提前制備種子菌液，后按照1∶100的比例接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并設置一個不接種菌液的空白樣。從接種開始計時，每1h取1次樣，分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，共15次取樣，測定菌液的OD600值，以取樣時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制細菌的生長曲線。

1.7 細菌生理生化特征測定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]進行菌株生理生化鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016對菌株各項實驗所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計、計算并制作圖表。使用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行差異性Duncan分析。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的初篩

將分離出的菌株接種到CMC-Na平板上，篩選出4株具有解纖維素能力的細菌菌株AX-9、AY-15、AZ-18、AZ-19。將4株細菌置于28℃環(huán)境下，36h內(nèi)均有菌株生長。測定每株細菌透明圈與菌落的直徑比值，見表1，AX-9的透明圈比值最大，為1.78，說明該菌株在4株細菌中解纖維素的能力最強，有較好的產(chǎn)纖維素酶的能力；其次是AZ-18，透明圈比值為1.55；AY-15的透明圈比值最小，為1.13，說明其解纖維素的能力最弱。

表1 不同菌株的菌落與透明圈大小

對于初篩得到的4株細菌，在濾紙條作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，各菌株均能將濾紙條崩解，但崩解速率略有差異，失重率結(jié)果各不相同，見表2，濾紙崩解失重率與菌株降解濾紙纖維素的能力大小成正比。其中AX-9生長速度較快，培養(yǎng)至6h時，培養(yǎng)基可見渾濁，說明菌株已經(jīng)開始繁殖生長；培養(yǎng)至36h時，培養(yǎng)液中出現(xiàn)了粘稠物質(zhì)，菌株逐漸開始利用濾紙纖維素生長；培養(yǎng)至72h時，長方形濾紙條開始變薄，呈現(xiàn)圓角，中間出現(xiàn)裂痕，可見不規(guī)則的濾紙小碎片；培養(yǎng)至96h時，濾紙條已被打斷，成若干圓形碎片；培養(yǎng)至120h時，培養(yǎng)基中部分濾紙片已成絮狀，培養(yǎng)基已非常渾濁，見圖1。研究發(fā)現(xiàn)，菌株在前72h濾紙崩解效果不明顯，從第72小時開始，濾紙崩解速度明顯增快。分析其原因，可以認為菌株在剛接種于濾紙纖維素作為唯一的碳源的培養(yǎng)基中時，無法利用濾紙這一碳源進行生長繁殖代謝。但隨著時間的延長，菌株不斷適應濾紙作為唯一碳源的生長環(huán)境，因此在培養(yǎng)的第72小時開始，濾紙的崩解速度明顯增快。根據(jù)公式計算得到各菌株培養(yǎng)5d后的濾紙失重率，AX-9濾紙失重率是4株細菌中最大的，見圖1a，為18.96%，說明其降解濾紙纖維素的能力在4株細菌中是最強的；其次是AZ-19，濾紙失重率為16.82%，見圖1b；AY-15的濾紙失重率最小，為13.78%。初步認為AX-9與AZ-19具有較好的產(chǎn)纖維素酶能力。

表2 不同菌株的濾紙崩解失重率

圖1 菌株濾紙崩解5d結(jié)果

2.2 纖維素降解菌的復篩

在一定范圍內(nèi)，利用葡萄糖含量和吸光度呈線性關(guān)系來確定菌株保溫酶解反應所生成的葡萄糖的含量，獲得線性回歸方程，見圖2。葡萄糖標準曲線方程：

y=0.4403x-0.0156(R2=0.9991)

以CMC-Na為唯一碳源，測定初篩得到的4株細菌的CMC-Na酶活力，見圖3a。AX-9菌株CMC-Na酶活顯著高于其他菌株酶活，為6.18±0.13U·mL-1；其次是AZ-19與AZ-18，酶活力分別為5.37±0.17U·mL-1、5.02±0.17U·mL-1，但二者酶活力差異不顯著；最低的是AY-15，酶活力為4.39±0.09U·mL-1。

以濾紙為唯一碳源，F(xiàn)PA酶活的測定呈現(xiàn)了相同的趨勢，見圖3b，AX-9的FPA酶活力顯著高于其他菌株酶活，為2.94±0.08U·mL-1；其次是AZ-19，酶活力2.42±0.09U·mL-1；而AY-15與AZ-18差異不顯著，且酶活力較低，分別為1.79±0.07U·mL-1、1.88±0.10U·mL-1。

2.3 菌株拮抗試驗

分別將AX-9與AZ-19作指示菌，另一菌株作受試菌，共4組試驗，每組試驗3個平行，對比無菌水空白樣(A)，均未見有牛津杯周圍有抑菌圈的產(chǎn)生，見圖4，說明菌株間無明顯拮抗作用，AX-9與AZ-19可組合培養(yǎng)，可進行復合菌劑的制備。

圖2 葡萄糖標準曲線

注：圖中字母表示在0.05水平上差異顯著，ab表示相同處理間從大到小的顯著差異。

圖4 AX-9與AZ-19菌株拮抗試驗

2.4 細菌生長曲線

菌株AX-9在0～3h生長繁殖緩慢，從第3小時開始大量繁殖，進入生長對數(shù)期，第11小時開始菌株的生長繁殖速度下降，進入生長平緩期；AZ-19相較于AX-9進入生長對數(shù)期時間長，在第4小時進入生長對數(shù)期，在第12小時進入生長平緩期。2株細菌生長對數(shù)期時間均為8h，見圖5。

2.5 細菌形態(tài)學觀察

菌株AX-9為好氧菌，在NB培養(yǎng)基上直接觀察，四區(qū)劃線菌落連續(xù)，凸起呈乳白色，可見表面濕潤且質(zhì)地粘稠，邊緣整齊，對其進行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，AX-9為革蘭氏陽性菌，無動力，細胞桿狀，分散排列。菌株AZ-19為好氧菌，在NB培養(yǎng)基上呈黃色，可見單菌落，菌落凸起，表面較濕潤，周圍較光滑，不透明，通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陰性菌，無動力，細胞短桿狀，分散排列。

圖5 細菌菌株培養(yǎng)14h生長曲線

2.6 生理生化特征測定

將篩選出來產(chǎn)纖維素酶能力較高的細菌菌株AX-9與AZ-19進行生理生化特征測定。糖類分解試驗中，AX-9與AZ-19的杜氏小管中無氣泡生成，說明二者分解葡萄糖時均不產(chǎn)氣，而AZ-19的檢測試管可見添加溴百里香酚藍指示劑的培養(yǎng)基由藍變黃，說明其分解葡萄糖時產(chǎn)酸。V-P試驗中，培養(yǎng)4d后滴加檢測液檢測，AZ-19立即呈現(xiàn)紅色，為陽性反應，說明其分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而AX-19在2h內(nèi)仍無顏色變化，說明其為陰性反應。2株細菌在接觸酶試驗中均有氣泡產(chǎn)生，為陽性反應。在淀粉水解試驗中，2株細菌均為陰性反應，說明菌株不分泌胞外淀粉酶。在明膠液化試驗中，AX-9液化明膠結(jié)果較AZ-19不明顯，為部分液化，但均認定2株細菌為陽性反應，分泌明膠酶，見表3。初步將AX-9鑒定為芽孢桿菌屬，AZ-19為黃色桿菌屬。

表3 細菌菌株生理生化特征總表

3 結(jié)論

本研究篩選出的4株細菌均具有產(chǎn)纖維素酶的能力，其中AX-9與AZ-19有顯著的纖維素降解能力。進行拮抗試驗，研究發(fā)現(xiàn)二者之間可共生。本研究發(fā)現(xiàn)的菌株對充分利用纖維素這一潛在資源，改善自然環(huán)境，緩解不可再生資源大量消耗的現(xiàn)狀，具有潛在的應用前景。