HNTs-NaClO2復(fù)合材料的制備及抑菌效果

谷娜，趙東亞，高金龍，林翠，任偉杰，王田田，劉欣偉

（1 河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北 石家莊 050018；2 河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

細(xì)菌是借助人體皮膚黏膜表面的一些特殊成分和結(jié)構(gòu)附著在人體皮膚黏膜表面，然后以不同的方式引起疾病[1]。雖然細(xì)菌和其他微生物可以促進(jìn)自然界物質(zhì)的代謝循環(huán)，但不受控制地生長(zhǎng)會(huì)損害人類健康，甚至阻礙經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]?？股匾蚱鋬?yōu)異的殺菌能力而成為最被接受的治療方法。然而，隨著多重耐藥菌的進(jìn)化，傳統(tǒng)抗生素的藥效逐漸下降，可能會(huì)產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的后果[3]。開發(fā)新的抗生素費(fèi)時(shí)費(fèi)力，導(dǎo)致新抗生素持續(xù)缺失。更糟糕的是，現(xiàn)有抗生素耐藥性的流行率在不斷增加。因此，開發(fā)抗細(xì)菌感染的新型抗菌材料是最關(guān)鍵的問題[4]。隨著科技的不斷發(fā)展，新型抗菌劑逐漸走進(jìn)了人們的視野。目前，抗菌劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化妝品[5]、食品包裝[6]、塑料[7]、醫(yī)療衛(wèi)生[8]、紡織品[9]等各個(gè)方面。

抗菌劑載體能通過(guò)不同方式對(duì)抗菌劑進(jìn)行負(fù)載，可以實(shí)現(xiàn)抗菌藥物緩釋，且載體具有較大的孔徑以及比表面積，能夠擴(kuò)大抗菌劑的負(fù)載效率[10-11]。埃洛石納米管（HNTs） 化學(xué)式為Al2Si2O5(OH)4·2H2O，呈天然的中空管狀結(jié)構(gòu)，管內(nèi)徑為10～150nm，管長(zhǎng)1～15μm。它的外表面含有和Si—O基團(tuán)，內(nèi)表面含有Al-OH基團(tuán)，分別帶有正負(fù)電荷，有利于其與各種不同電性粒子的結(jié)合[12]。HNTs 具有獨(dú)特的納米管狀結(jié)構(gòu)以及較大的比表面積，無(wú)細(xì)胞毒性，且具有良好的生物相容性[13]。Barman等[14]采用真空操作和超聲技術(shù)將諾氟沙星作為模型藥物負(fù)載到HNTs中并觀察其抗菌活性。結(jié)果表明，該材料具有柔韌性，可以持續(xù)釋放諾氟沙星，且有一定的抗菌性，細(xì)胞毒性研究表明HNTs本質(zhì)上是生物相容的。因此，該復(fù)合材料能夠維持藥物輸送，可以用于傷口愈合或其他醫(yī)學(xué)應(yīng)用。Lisuzzo等[15]利用殼聚糖和埃洛石納米管之間的靜電相互作用來(lái)制備具有向khellin 受控釋放特性的雜化納米結(jié)構(gòu)，研究表明殼聚糖層包裹的埃洛石納米管可以有效地用作藥物輸送系統(tǒng)。亞氯酸鈉（NaClO2）可作為殺菌劑、漂白劑使用，可應(yīng)用在空氣凈化[16]、食品安全[17]、消毒[18]等領(lǐng)域。由于亞氯酸鈉自身沒有緩釋性，本文利用HNTs 作為抗菌劑載體，制備HNTs-NaClO2抑菌材料，對(duì)其釋放以及抑菌性能進(jìn)行探索，圖1 為制備HNTs-NaClO2復(fù)合材料的實(shí)驗(yàn)流程。

圖1 制備HNTs-NaClO2復(fù)合材料的實(shí)驗(yàn)流程

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：埃洛石，石家莊騰瑞礦產(chǎn)產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；亞氯酸鈉，石家莊市科大綠源發(fā)展有限公司；硫代硫酸鈉、六偏磷酸鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；淀粉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；重鉻酸鉀，萊陽(yáng)市康德化工有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，北京生物保藏生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉，天津市英博生化試劑有限公司。

儀器：X 射線衍射儀（XRD），日本Rigaku 公司D/MAX-2500 型；透射電子顯微鏡（TEM），德國(guó)電子有限公司JEM-2100 型；傅里葉紅外光譜（FTIR），美國(guó)鉑金埃爾默公司FTS-65A1896 型；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），日本HITACHI 公司S-4800-I型。

1.2 HNTs的預(yù)處理

首先使用去離子水洗滌HNTs，除去HNTs 中不溶性雜質(zhì)。稱取HNTs 5.0g，加入到25mL的去離子水中，將其混勻，再向混合后的溶液中加入0.125g分散劑六偏磷酸鈉，攪拌2h。將攪拌后的溶液離心，去除沉淀后，再將懸浮液進(jìn)行離心，用去離子水洗滌3次后，將所得沉淀在60℃下真空干燥24h。將干燥后所得到的固體采用一定濃度的氫氧化鈉溶液進(jìn)行處理。將HNTs分散到氫氧化鈉溶液中，超聲30min，攪拌10h。將攪拌后的溶液離心，去掉上層堿液，過(guò)濾，水洗至中性，將濾餅在80℃真空干燥24h，得到堿處理后的HNTs。

1.3 HNTs-NaClO2的制備

根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《工業(yè)亞氯酸鈉》（HG/T 3250—2010）[19]對(duì)亞氯酸鈉溶液的濃度進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用真空抽吸的方式制備HNTs-NaClO2復(fù)合材料。

稱取一定質(zhì)量的HNTs，置于飽和亞氯酸鈉溶液中，邊攪拌邊抽真空，每隔30min關(guān)閉攪拌并卸下真空，5min 后繼續(xù)抽真空。2h 后將所得溶液過(guò)濾得濾餅，40℃置于真空干燥箱內(nèi)烘干24h，研磨，得樣品備用，濾液用滴定法測(cè)定其含量。NaClO2負(fù)載量的計(jì)算如(1)所示。

式中，m0是溶液中亞氯酸鈉的初始質(zhì)量，g；mf是濾液中亞氯酸鈉的質(zhì)量，g；mads是HNTs 的質(zhì)量，g。

采用單因素考察法探索負(fù)載工藝對(duì)NaClO2負(fù)載量的影響。

（1） 在保持其他條件不變的情況下，設(shè)置不同的攪拌時(shí)間分別為60min、90min、120min、150min、180min。

（2） 在保持其他條件不變的情況下，設(shè)置不同的浸泡時(shí)間分別為0min、 10min、 20min、30min、40min。

（3） 在保持其他條件不變的情況下，設(shè)置不同負(fù)載比例（HNTs∶NaClO2）分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.4 HNTs-NaClO2的釋放

將HNTs-NaClO2復(fù)合材料在中性介質(zhì)中進(jìn)行釋放。稱取一定量的HNTs-NaClO2復(fù)合材料置于試管中，加入10mL 的去離子水，充分混勻后靜置，在一定時(shí)間后，從試管中取一定質(zhì)量的上清液進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)在試管中加入等量的去離子水。采用碘量法測(cè)定溶液中的亞氯酸鈉含量。根據(jù)式(2)計(jì)算亞氯酸鈉的累積釋放率。

1.5 HNTs-NaClO2的抑菌

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范第一分冊(cè)》[20]配制Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基和相應(yīng)的菌懸液。采用抑菌圈法對(duì)HNTs-NaClO2進(jìn)行評(píng)價(jià)。稱取不同質(zhì)量的HNTs-NaClO2復(fù)合材料，將其溶于滅菌水中，分別配制濃度為1.25g/L、2.50g/L、3.75g/L、5.00g/L、6.25g/L、7.50g/L 的樣品。將滅菌后的LB固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平板中，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使培養(yǎng)基在平板中厚薄均勻。靜置，待其冷卻凝固后，將菌懸液均勻涂布在含有培養(yǎng)基的平板上。用移液槍吸取20μL 不同濃度的樣品溶液，滴加到滅菌后的濾紙片的表面，對(duì)照濾紙片滴加20μL 濃度為0.9%的生理鹽水作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，然后將濾紙片平放在平板表面，蓋好平板，置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16～18h 后，觀察結(jié)果，記錄抑菌圈直徑的大小。

1.6 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范第一分冊(cè)》對(duì)HNTs-NaClO2進(jìn)行急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)。采用霍恩（Horn’s）法對(duì)HNTs-NaClO2的半數(shù)致死量（median lethal dose, LD50）進(jìn)行測(cè)定。選用18～22g SPF 級(jí)昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。按2.15g/kgBW(BW 指體重)、4.64g/kgBW、10.00g/kgBW、21.50g/kgBW劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃容量為20mL/kgBW。另取SPF 級(jí)昆明種小鼠10 只，雌雄各半，灌入等量的生理鹽水。給藥后觀察小鼠14 天內(nèi)的毒性反應(yīng)和死亡情況，記錄各組動(dòng)物的一般生理狀況、進(jìn)食飲水、活動(dòng)狀態(tài)、有無(wú)中毒狀態(tài)和有無(wú)動(dòng)物死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠用頸椎脫臼致死法處死，進(jìn)行解剖學(xué)檢查。根據(jù)霍恩法LD50值計(jì)算用表計(jì)算小鼠的LD50值，表1為急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與討論

2.1 HNTs-NaClO2復(fù)合材料的表征

2.1.1 XRD分析

圖2 為原始HNTs、HNTs-NaClO2復(fù)合材料和NaClO2的XRD圖譜。從圖中可以看出，HNTs負(fù)載亞氯酸鈉后的XRD 圖與原始HNTs 和亞氯酸鈉的XRD圖譜明顯不同，且HNTs負(fù)載亞氯酸鈉的特征衍射峰較尖銳，結(jié)晶度較好。在12.15°、20.14°、24.94°分別對(duì)應(yīng)原始HNTs 的(001)、(100)、(002)晶面峰，在31.75°、45.55°、54.05°分別對(duì)應(yīng)NaClO2的(200)、(220)、(311)晶面峰。

圖2 原始HNTs、HNTs-NaClO2復(fù)合材料和NaClO2的XRD圖

2.1.2 FTIR分析

圖3 為原始HNTs、HNTs-NaClO2復(fù)合材料和NaClO2的FTIR 圖譜。與原始HNTs 和NaClO2的紅外光譜圖相比，負(fù)載飽和亞氯酸鈉溶液的紅外光譜圖在843cm-1、434cm-1附近出現(xiàn)特征吸收峰，證明在HNTs成功負(fù)載亞氯酸鈉晶體。

圖3 原始HNTs、HNTs-NaClO2復(fù)合材料和NaClO2的FTIR圖譜

2.1.3 TEM分析

圖4 為原始HNTs 和HNTs-NaClO2復(fù)合材料的TEM 圖。由圖中可以看出負(fù)載后的HNTs 呈透明狀，管徑為50～100nm，管長(zhǎng)為400～800nm，部分管體發(fā)生斷裂，與原始HNTs 相比較，負(fù)載后的HNTs 表面有部分結(jié)晶，證明已經(jīng)成功負(fù)載上亞氯酸鈉。

圖4 原始HNTs和HNTs-NaClO2復(fù)合材料的TEM圖

2.1.4 EDS分析

表2 為原始HNTs 和HNTs-NaClO2復(fù)合材料元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，圖5為原始HNTs和HNTs-NaClO2復(fù)合材料的EDS 圖。從表2 的數(shù)據(jù)中可以得出在HNTs上有Na 元素和Cl 元素的存在，且比例接近1∶1，表明HNTs已經(jīng)負(fù)載上亞氯酸鈉。

圖5 原始HNTs和HNTs-NaClO2的EDS圖

表2 原始HNTs和HNTs-NaClO2元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 負(fù)載工藝對(duì)NaClO2負(fù)載量的影響

2.3 HNTs-NaClO2復(fù)合材料的釋放結(jié)果

圖6為負(fù)載比例對(duì)HNTs-NaClO2復(fù)合材料釋放結(jié)果的影響。由圖可以看出，在釋放達(dá)到第4 天時(shí)，釋放趨于平穩(wěn)，負(fù)載比例為1∶4 時(shí)，其釋放性能較好，累積釋放量為1.43%。在釋放初期，釋放速率不斷增大，增加到一定值后保持穩(wěn)定持續(xù)釋放，說(shuō)明HNTs-NaClO2具有一定的緩釋性。

表3 不同負(fù)載工藝對(duì)NaClO2的負(fù)載量的影響

圖6 負(fù)載比例對(duì)HNTs-NaClO2復(fù)合材料的釋放結(jié)果的影響

2.4 HNTs-NaClO2復(fù)合材料的抑菌結(jié)果

圖7為HNTs-NaClO2復(fù)合材料負(fù)載比例為1∶4時(shí)的抑菌結(jié)果，表4為濃度對(duì)HNTs-NaClO2復(fù)合材料的抑菌圈直徑的影響（±SDmm）。結(jié)果表明，HNTs-NaClO2復(fù)合材料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用；隨著樣品濃度的增加，抑菌圈直徑也隨之增加，抑菌作用也隨之增強(qiáng)。

表4 濃度對(duì)HNTs-NaClO2復(fù)合材料的抑菌圈直徑的影響（±SD） 單位：mm

圖7 濃度對(duì)HNTs-NaClO2復(fù)合材料抑菌結(jié)果的影響

2.5 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 各組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

度為4.64g/kgBW時(shí)，小鼠部分死亡，給藥濃度為2.15g/kgBW時(shí)，小鼠均未死亡。根據(jù)霍恩法LD50值計(jì)算用表，樣品對(duì)雌性小鼠的LD50為5.84g/kgBW，可信限為4.30～7.94g/kgBW，樣品對(duì)雄性小鼠的LD50為5.01g/kgBW，可信限為3.44～7.30g/kgBW。雌雄小鼠的LD50均大于5.00g/kgBW，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于低毒級(jí)別。解剖后肉眼觀察灌胃后死亡的小鼠內(nèi)臟的顏色與對(duì)照組的內(nèi)臟顏色明顯不同。

3 結(jié)論

（1）通過(guò)XRD、FTIR、TEM、EDS 分析證明HNTs 已經(jīng)成功負(fù)載上了亞氯酸鈉，得到HNTs-NaClO2復(fù)合材料。通過(guò)改變HNTs 在飽和亞氯酸鈉溶液中攪拌時(shí)間和負(fù)載比例可以提高NaClO2的負(fù)載量。

（2）釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HNTs-NaClO2復(fù)合材料在第4 天時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期濃度為1.43%。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HNTs-NaClO2復(fù)合材料對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有抑制作用。此外，急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)表明，HNTs-NaClO2對(duì)雌雄小鼠的LD50均大于5.00g/kgBW。

（3）HNTs-NaClO2復(fù)合材料具有一定的緩釋性和抑菌性。HNTs-NaClO2復(fù)合材料具有潛在應(yīng)用價(jià)值，仍需完善在應(yīng)用方面（如紡織品的抗菌整理）的實(shí)驗(yàn)。