基于Nrf2/Keap1信號通路研究黃芩甲苷對糖尿病腎病模型小鼠腎損傷的作用*

彭福梅，尹青橋，李相友

武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430060

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)屬于糖尿病常見并發(fā)癥，隨疾病發(fā)展極易導致慢性腎衰竭，威脅患者生命安全[1]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ech-associated protein 1，Keap1)可在生理狀態(tài)下與核轉(zhuǎn)錄因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)發(fā)生耦聯(lián)，當機體發(fā)生病理性改變時，Keap1水平也會發(fā)生相應變化[2]。Nrf2參與細胞氧化還原平衡調(diào)節(jié)，已有報道指出，激活Nrf2可有效治療DN導致的腎損傷[3]。研究指出，Keap1可被Nrf2激活，進而影響miR-142表達[4]。黃芩甲苷為中藥黃芩中提取的有效成分，具有抗氧化、消炎、抑菌等作用[5]。本次研究通過分析黃芩甲苷對糖尿病小鼠腎損傷以及小鼠腎小球系膜細胞的影響，探究Nrf2/Keap1信號通路在黃芩甲苷治療DN腎損傷中的作用。

1 材料

1.1 實驗動物與細胞60只SPF級雌性C57BL/6小鼠，購買于南京軍科生物工程有限公司，8～10周齡，體質(zhì)量25～30 g，飼養(yǎng)在室溫23 ℃、12 h/12 h光暗周期條件下，自由飲水采食，飼養(yǎng)1周后用于實驗。小鼠腎小球系膜細胞系(SV40-Mes-13)由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所提供，選擇DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，溫度37 ℃，二氧化碳體積分數(shù)5%。

1.2 藥物與試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司，批號：20200516)；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白分析試劑盒(福州飛凈生物科技有限公司，批號：20200317)；細胞溶解緩沖液(武漢純度生物科技有限公司，批號：20200412)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力測定試劑盒(德國Qiagen公司，批號：20190921)；小鼠單克隆Nrf2抗體、Keap1抗體、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)抗體(美國Abcam 公司，貨號：ab89443、ab89563、ab89652)；RNA提取試劑盒(廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司，批號：200423)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上?？撇┤鹕锟萍加邢薰荆枺?10214)；對照組病毒(LV-control)、過表達Keap1慢病毒(LV-Keap1)購于擎科生物科技有限公司；miR-142 mimic、miR-142 inhibitor、si-Keap1、pcDNA-Keap1及對照物pre-NC、NC、si-control、pcDNA購自吉瑪基因公司。

1.3 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：Herocell 180，上海力申儀器公司)；倒置顯微鏡(型號：BX43，日本Olympus公司)；單道手動移液器(型號：Reference?2，德國艾本德公司)；電泳槽(型號：TY-80，南京普陽科學儀器研究所)；低溫離心機(型號：KL05R，湖南凱達科學儀器有限公司)；酶標儀(型號：CA-2000，寰熙醫(yī)療器械有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(型號：BioDoc-It，美國Analytik Jena US LLC公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥60只C57BL/6小鼠中隨機選擇20只，分為對照組、正常+黃芩甲苷組，每組10只，其余40只小鼠制備糖尿病模型，具體如下：小鼠禁食12 h后，以150 mg·kg-1劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，72 h后斷尾取血，檢測血糖水平，當小鼠空腹血糖>16.17 mol·L-1表示糖尿病小鼠模型誘導成功。采用高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病模型小鼠30 d，當小鼠的24 h尿蛋白增加10倍以上，且空腹血糖>16.17 mol·L-1表示DN小鼠模型建立成功。將建模成功的小鼠隨機分為DN組、DN+黃芩甲苷組、DN+ LV-Keap1組、DN+LV-control組，每組10只，對照組和DN組小鼠給予生理鹽水灌胃；正常+黃芩甲苷組、DN+黃芩甲苷組小鼠灌胃給予10 g·L-1黃芩甲苷溶液，DN+ LV-Keap1組、DN+LV-control組先尾靜脈注射0.5 mL LV-Keap1與LV-control，再給予10 g·L-1黃芩甲苷溶液灌胃，給藥體積為10 mL·kg-1，每天2次，持續(xù)干預10周。

2.2 細胞分組及處理取凍存細胞，解凍后將其接種于含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取傳代培養(yǎng)后細胞經(jīng)含25 mmol·L-1葡萄糖的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分為10組，分別為①葡萄糖+NC組(細胞高糖培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染NC)；②葡萄糖+miR-142 inhibitor組(細胞高糖培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染miR-142 inhibitor以抑制miR-142表達)；③葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-control組(細胞高糖培養(yǎng)后進行miR-142 inhibitor和si-control共轉(zhuǎn)染)；④葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-Keap1組[細胞高糖培養(yǎng)后進行miR-142 inhibitor和si-Keap1(抑制Keap1表達)共轉(zhuǎn)染]；⑤葡萄糖組(細胞僅進行高糖培養(yǎng))；⑥葡萄糖+黃芩甲苷組(細胞進行高糖培養(yǎng)后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預)；⑦葡萄糖+黃芩甲苷+pre-NC組(細胞進行高糖培養(yǎng)后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并轉(zhuǎn)染pre-NC)；⑧葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic組(細胞進行高糖培養(yǎng)后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并轉(zhuǎn)染miR-142 mimic使miR-142過表達)；⑨葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA組(細胞進行高糖培養(yǎng)后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并共轉(zhuǎn)染miR-142 mimic和pcDNA)；⑩葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA-Keap1組[細胞進行高糖培養(yǎng)后給予100 μmol·L-1黃芩甲苷干預并共轉(zhuǎn)染miR-142 mimic和pcDNA-Keap1(過表達Keap1)]。

2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測實驗結(jié)束后，取細胞培養(yǎng)上清液，采用SOD檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中SOD的活性，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

2.4 Western Blot檢測小鼠腎組織及細胞中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平取處理后的細胞及腎組織，腎組織研磨后加裂解液，細胞直接加裂解液，12 000 r·min-1離心5 min，分離上清用于蛋白測定，經(jīng)蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜后進行免疫反應，依次加入一抗、二抗，反應結(jié)束后進行顯色曝光，對目的條帶的灰度值進行分析，并根據(jù)測定結(jié)果計算目的蛋白Nrf2、Keap1、HO-1的相對表達量，內(nèi)參選擇β-actin。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明進行細胞凋亡檢測，取對數(shù)生長期細胞，1 000 r·min-1離心5 min，獲得目的細胞，PBS沖洗后再次離心，PBS重懸，乙醇固定，400目篩網(wǎng)過濾1次，1 000 r·min-1離心5 min，加1.0 mL PI染液，4 ℃ 避光30 min，加AnnexinV-FITC避光染色5 min，采用Facsverse流式細胞儀進行上機檢測，每組設置復孔3個，通過熒光激活細胞分選儀檢測細胞凋亡水平。

2.6 RT-qPCR檢測miR-142mRNA的表達取小鼠腎組織滅菌后進行組織研磨，加入裂解液處理，12 000 r·min-1離心5 min，取上清。使用RNA提取試劑盒進行總RNA提取，操作過程嚴格按照RNA提取試劑盒說明進行操作，隨后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)本次實驗所需基因序列測定結(jié)果，選擇保守序列區(qū)作為擴增區(qū)域，利用Primer5.0引物設計軟件和BLAST軟件程序設計出特異性擴增引物，獲得cDNA。PCR擴增反應條件，95 ℃反應15 min，95 ℃反應10 s，60 ℃反應30 s，進行40個循環(huán)，繪制標準曲線，定量分析miR-142mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 黃芩甲苷對DN小鼠腎組織中miR-142mRNA及Keap1、Nrf2蛋白表達水平的影響與對照組比較，DN組miR-142mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，Keap1、Nrf2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與DN組比較，DN+黃芩甲苷組miR-142mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，Keap1、Nrf2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注：A：miR-142 mRNA表達水平比較；B：Keap1、Nrf2蛋白表達水平比較；C：Keap1、Nrf2蛋白表達條帶圖；與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05圖1 黃芩甲苷對DN小鼠腎組織中miR-142 mRNA及Keap1、Nrf2蛋白表達水平的影響

3.2 黃芩甲苷對過表達Keap1的DN小鼠腎組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響與DN+LV-control組比較，DN+LV-Keap1組小鼠腎組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A:Keap1、Nrf2、HO-1蛋白條帶圖；B：Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較；與DN+LV-control組比較，aP<0.05圖2 黃芩甲苷對過表達Keap1的DN小鼠腎組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平的影響

3.3 抑制miR-142表達對腎小球系膜細胞的影響與葡萄糖+NC組比較，葡萄糖+miR-142 inhibitor組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達水平及SOD水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；與葡萄糖+miR-142 inhibitor組比較，葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-Keap1組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達水平及SOD水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡水平顯著升高(P<0.05)。見圖3。

注：與葡萄糖+NC組比較，*P<0.05；與葡糖糖+miR-142 inhibitor組比較，#P<0.05；A：腎小球系膜細胞Keap1、Nrf2蛋白表達條帶圖；B：Keap1、Nrf2蛋白表達水平比較；C：化學比色法檢測SOD水平；D：流式細胞儀檢測細胞凋亡圖3 抑制miR-142表達對腎小球系膜細胞的影響

3.4 黃芩甲苷對腎小球系膜細胞的影響與葡萄糖組比較，葡萄糖+黃芩甲苷組Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與葡萄糖+黃芩甲苷+pre-NC組比較，葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic組Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，與葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA組比較，葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA-Keap1組Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：與葡萄糖組比較，*P<0.05；與葡萄糖+黃芩甲苷+pre-NC組比較，#P<0.05；與葡萄糖+黃芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA比較，&P<0.05；A：Nrf2、Keap1蛋白條帶圖；B：Nrf2、Keap1蛋白相對表達量；C：SOD水平比較；D：細胞凋亡率比較圖4 黃芩甲苷對腎小球系膜細胞的影響結(jié)果

4 討論

DN屬于糖尿病常見并發(fā)癥，是造成糖尿病患者死亡的主要并發(fā)癥之一[6]。本次研究通過構(gòu)建DN模型發(fā)現(xiàn)DN小鼠存在miR-142表達升高情況。糖尿病屬“消渴”范疇，氣陰兩虛為該病主要病機，氣能行血，血無氣衰，則血行瘀滯，瘀血不僅作為病理產(chǎn)物，更是致病因素，進而引發(fā)一系列血管并發(fā)癥，其中就包含糖尿病腎病[7]。腎小球具有豐富的毛細血管，回旋迂曲且細長，極易發(fā)生損傷，與中醫(yī)所述脈絡特征類似。已有大量研究證實，中醫(yī)血瘀與炎癥反應、氧化應激反應之間存在密切聯(lián)系，而Nrf2/Keap1信號通路參與機體炎癥反應及氧化過程，因此選取該信號通路作為本次的研究方向，探究其干預機制[8]。

黃芩是臨床上常用的清熱燥濕藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“黃芩，味苦平，主諸熱黃疽，腸澼，泄利，逐水，下血閉，惡創(chuàng)恒蝕，火瘍。”黃芩以根入藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎、止血等功效?，F(xiàn)代研究表明，黃芩具有黃酮類、皂苷類、多糖類等多種活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病及抗病毒等作用[9]。黃芩甲苷是中草藥黃芩的主要有效成分，可有效上調(diào)Keap1蛋白表達，從而對H2O2誘導的細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用[10]。有學者展開動物研究發(fā)現(xiàn)，黃芩甲苷可抑制DN動物腎組織細胞凋亡，降低腎臟損傷，使腎臟抗氧化能力增強，抑制DN進展[11]，且黃芩甲苷可激活Nrf2，對多種疾病導致的組織損傷起到抑制作用[12-15]。本次研究基于Nrf2/Keap1通路探討黃芩甲苷對于DN小鼠的影響。

在細胞增殖、分化、生長以及凋亡過程中均有成熟miRNA參與，miR-142是近幾年醫(yī)學研究的熱門，多數(shù)學者認為其參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展，是導致病變組織纖維化的重要因素[16-17]。研究指出，miR-142與腎纖維化發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系[18]。本次研究通過分析腎組織中miR-142表達水平進一步證實DN小鼠腎組織中存在miR-142表達水平升高的情況，但經(jīng)黃芩甲苷干預后其表達降低。研究指出，激活Nrf2可緩解DN造成的腎臟損傷[19-20]，因此，可通過靶向激活Nrf2的方式緩解糖尿病引起的腎臟損傷[21]。本次研究對小鼠進行黃芩甲苷干預后顯示，黃芩甲苷可有效上調(diào)小鼠腎組織中Nrf2表達。Keap1可在生理狀態(tài)下與Nrf2發(fā)生耦聯(lián)，廣泛存在于機體各種細胞中[22-23]。研究證實，Keap1可通過促進高糖環(huán)境下腎臟細胞能量穩(wěn)態(tài)重建的方式干預DN造成的腎組織損傷，從而抑制腎臟損傷，降低細胞凋亡率[24]。本次研究對小鼠腎臟組織中Keap1表達情況進行分析顯示，黃芩甲苷可有效升高腎組織中Keap1的表達水平，并且注射過表達Keap1慢病毒后，HO-1表達升高，進一步證實Keap1在DN發(fā)生發(fā)展中的腎保護作用，可能是黃芩甲苷對DN小鼠Nrf2/Keap1通路產(chǎn)生影響，從而抑制miR-142表達，該結(jié)果與已有報道一致[25-26]。

本次研究選取高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞系進行體外研究，結(jié)果顯示，腎小球系膜細胞在轉(zhuǎn)染 miR-142inhibitor后，Nrf2、Keap1蛋白表達升高，在對SOD及細胞凋亡情況進行分析時發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡率明顯降低，而SOD水平升高，而共轉(zhuǎn)染si-Keap1細胞出現(xiàn)miR-142inhibitor轉(zhuǎn)染作用逆轉(zhuǎn)情況，Nrf2、Keap1蛋白表達降低，細胞凋亡升高，SOD降低，提示miR-142inhibitor轉(zhuǎn)染所產(chǎn)生的保護作用可被 si-Keap1逆轉(zhuǎn)。SOD是評估機體氧化反應情況的重要指標，被稱為氧自由基殺手，可有效清除機體氧自由基[27]，而氧自由基是造成組織損傷的關鍵因素[16]。本次研究結(jié)果顯示，通過提高SOD水平降低氧化應激損傷的發(fā)生，激活Nrf2/Keap1信號通路抑制miR-142表達，進而對腎臟起到保護效果[28]。通過動物研究發(fā)現(xiàn)，黃芩甲苷可降低DN小鼠腎臟組織中miR-142表達，因此本次研究在細胞體外研究時同樣進行黃芩甲苷干預，結(jié)果顯示，黃芩甲苷可逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞損傷，升高Nrf2、Keap1蛋白表達，降低細胞凋亡率，增加SOD水平。進一步分析發(fā)現(xiàn)，過表達miR-142可逆轉(zhuǎn)黃芩甲苷所產(chǎn)生的細胞保護作用，共表達Keap1、miR-142時，過表達Keap1使miR-142 mimic對細胞產(chǎn)生的影響再次被逆轉(zhuǎn)。通過以上研究數(shù)據(jù)可以看出，黃芩甲苷對于高血糖導致的腎臟損傷可以起到保護作用，而且該作用是通過抑制miR-142表達并激活Nrf2/Keap1信號通路完成的。

綜上所述，糖尿病腎病存在miR-142過表達情況，從而抑制Nrf2/Keap1通路激活，黃芩甲苷可逆轉(zhuǎn)miR-142對Nrf2/Keap1信號通路的抑制作用，提高Keap1、Nrf2表達，進而達到改善糖尿病腎病的目的。