茯磚茶中冠突散囊菌的指標(biāo)要求和檢測方法分析

◎ 雷蘭蘭，舒 靜，張 曼，馮海霞，劉源博

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048）

涇陽茯磚茶在2013年09月26日以獨(dú)特的品質(zhì)獲得原國家質(zhì)檢總局“地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”稱號[1]，涇陽茯磚茶也被譽(yù)為“中國古絲綢之路上的神秘之茶”[2]，距今已有600多年的歷史，因其是在夏季伏天里加工制作，其香氣和作用又和茯苓相似，且蒸煮壓制后的外形呈磚狀，所以稱其為“茯磚茶”，屬于再加工茶類中黑茶緊壓茶的一種[3]。我國一千多種茶葉中，只有茯磚茶中生長繁殖有肉眼可見的金花菌，使得茯磚茶具有獨(dú)特的發(fā)酵茶風(fēng)味。

除了陜西涇陽，湖南益陽（安化）也是茯磚茶的產(chǎn)地之一。作為湖南特色產(chǎn)品的茯磚茶，是由安化的茶行采購原料黑毛茶運(yùn)至陜西涇陽，委托當(dāng)?shù)夭璺粔褐绍虼u茶[4]。無論是哪個產(chǎn)地的茯磚茶，其中均有大量不同種的微生物存在，但“金花菌”均是茯磚茶在加工筑制過程中產(chǎn)生的一種優(yōu)勢微生物。金花菌學(xué)名為“冠突散囊菌”，其子囊殼在茯磚茶茶葉中呈現(xiàn)肉眼可見的金黃色顆粒，俗稱“金花”。研究表明冠突散囊菌以茶葉基質(zhì)為營養(yǎng)成分生長，在生長代謝的過程中產(chǎn)生并分泌多種胞外酶，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等[5]。這些酶將茶葉中的纖維素、多糖、蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化、分解和降解成小分子物質(zhì)，小分子活性物不但能夠形成茯磚茶獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)，還使得涇陽茯磚茶具有調(diào)節(jié)血脂血糖、抗血栓、抗腫瘤和調(diào)理腸胃等方面的功效[6]。

1 茯磚茶產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中對冠突散囊菌指標(biāo)的要求分析

我國現(xiàn)行有效的茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)包括一個國家標(biāo)準(zhǔn)和兩個地方標(biāo)準(zhǔn)，分別是國家標(biāo)準(zhǔn)《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）、陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽茯茶》（DBS 61/0006—2021）和湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)《安化黑茶 茯磚茶》（DB43/T 569—2010），三者對茯磚茶的定義和茯磚茶中冠突散囊菌限量值的規(guī)定如表1所示。這3個標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的茯磚茶都是以黑毛茶為原料，主要的工藝過程均包括篩分、拼配、渥堆、定型、發(fā)花和干燥，最后包裝。對于冠突散囊菌的指標(biāo)，因?yàn)閲覙?biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品覆蓋范圍廣，所以制定的冠突散囊菌指標(biāo)要求最低，且未對產(chǎn)品質(zhì)量等級進(jìn)行分類，統(tǒng)一規(guī)定為20×104CFU·g-1。而涇陽茯磚茶因?yàn)閷儆诘乩順?biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，所以對冠突散囊菌的指標(biāo)要求較高，且按照產(chǎn)品質(zhì)量等級進(jìn)行分類要求，對特一級的要求是35×104CFU·g-1，對特二級和一級的要求是30×104CFU·g-1?！栋不诓?茯磚茶》中雖然將產(chǎn)品質(zhì)量等級分類為超級茯磚茶、特制茯磚茶和普通茯磚茶，但是對冠突散囊菌的指標(biāo)要求統(tǒng)一為30×104CFU·g-1，且注明該指標(biāo)為參考指標(biāo)，所以不用于產(chǎn)品合格與否的判定。因此綜合來看，陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽茯茶》（DBS 61/0006—2021）對冠突散囊菌的指標(biāo)要求最為嚴(yán)格。

表1 茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)中冠突散囊菌的指標(biāo)要求表

2 茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)中冠突散囊菌的檢驗(yàn)方法分析

目前對茯磚茶中冠突散囊菌數(shù)量的檢測，3個標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法都是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）中的第一法平板計(jì)數(shù)法。相較于涂布接種，該方法使用傾注接種的菌落是在培養(yǎng)基內(nèi)部生長，不便于挑取菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。把握不好傾注融化的熱瓊脂溫度，可能會影響部分有損傷的待檢菌的生長，但傾注法的接種量是涂布接種法的10倍，因?yàn)榧訕恿勘容^大，所以加樣誤差比較小。稀釋液為無菌蒸餾水、無菌生理鹽水或者無菌磷酸鹽緩沖液，無菌蒸餾水使用簡單方便，僅需滅菌分裝即可使用，不需要額外的試劑；生理鹽水和磷酸鹽緩沖液對生物細(xì)胞有更好的保護(hù)作用[7]，生理鹽水可以給微生物細(xì)胞一個相對穩(wěn)定的滲透壓，能夠防止細(xì)胞因滲透壓改變而破裂或脫水死亡；磷酸鹽具有較強(qiáng)的緩沖能力，可以為細(xì)胞維持一個較為穩(wěn)定的pH環(huán)境，避免細(xì)胞受損害。但是生理鹽水的配制方法更簡單，試劑成本也更低。劉凱利等[8]通過響應(yīng)面試驗(yàn)，研究了無菌水、不同濃度的氯化鈉稀釋液和磷酸鹽緩沖液對茯磚茶中金花菌菌落總數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)稀釋液為無菌生理鹽水時，金花菌的菌落總數(shù)計(jì)數(shù)最多。具體的操作步驟是稱取25 g固體樣品，加入225 mL無菌稀釋液，進(jìn)行充分地振搖或拍打，制成10倍稀釋的樣品勻液，再繼續(xù)進(jìn)行梯度稀釋。同時在進(jìn)行梯度稀釋的過程中，選取2～3個稀釋度，每個稀釋度分別取1 mL的樣品稀釋液加入兩個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。接著將冷卻至46 ℃的培養(yǎng)基約25 mL傾注于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混勻，置水平桌面待培養(yǎng)基完全凝固。瓊脂凝固后，將平板正置于（28±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。培養(yǎng)至第5天時記錄結(jié)果，選取菌落數(shù)在10～150 CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母[9]。從該過程可以看出，GB 4789.15—2016第一法平板計(jì)數(shù)法是霉菌和酵母菌的非選擇性計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法，是否適用于茯磚茶中冠突散囊菌的計(jì)數(shù)檢測還有待于驗(yàn)證。

3 茯磚茶取樣方式的討論

GB 4789.15—2016第一法中規(guī)定，對于固體樣品，稱取25 g用于制備10倍稀釋的樣品勻液。由于茯磚茶中的冠突散囊菌一般位于茶磚的中間部位，距離茶磚表面1 cm范圍內(nèi)幾乎無肉眼可見金花，而茶磚因?yàn)榻?jīng)過壓制工藝，內(nèi)部的金花也存在分布不均勻的現(xiàn)象，因此取樣方式的不同也會造成冠突散囊菌檢測結(jié)果有很大差異。目前常見的取樣方式為粉碎法和五點(diǎn)取樣法。粉碎法即為使用粉碎機(jī)將茶磚整體粉碎過篩后稱取25 g茶樣進(jìn)行檢測。五點(diǎn)取樣法是指在茶磚對角線上距離茯磚茶四角1～3 cm處的4個點(diǎn)和茶磚中心點(diǎn)取樣，每個點(diǎn)取樣5 g左右。劉凱利等[8]、馬躍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用粉碎法對茯磚茶中冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測，得到的茯磚茶中冠突散囊菌的數(shù)量為106CFU·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國家標(biāo)準(zhǔn)法的 105CFU·g-1，且粉碎法得到的數(shù)據(jù)整體穩(wěn)定性較高。但本實(shí)驗(yàn)室在使用粉碎法時發(fā)現(xiàn)，茶磚被粉碎后形成細(xì)小的茶粉，在檢測取樣時，細(xì)小的茶粉很容易漂浮到空氣中，造成實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境污染，所以該方法不適合批量檢測。相比粉碎法，五點(diǎn)法操作簡單，不需要粉碎機(jī)，僅使用微生物檢測實(shí)驗(yàn)室常用的無菌取樣工具即可進(jìn)行取樣，但是由于金花分布的不均勻性，五點(diǎn)法取樣不能夠代表茶磚中冠突散囊菌的真實(shí)數(shù)量。因此，檢測冠突散囊菌時，對茯磚茶的取樣方式還需要進(jìn)行研究。

4 3種培養(yǎng)基上冠突散囊菌的生長狀況

除了GB 4789.15—2016中規(guī)定的兩種培養(yǎng)基（孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂），再增加察氏瓊脂培養(yǎng)基，按照GB 4789.15—2016的檢驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，其中稀釋液使用無菌生理鹽水，對茯磚茶中冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢驗(yàn)。培養(yǎng)至第5天時，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種培養(yǎng)基上冠突散囊菌的生長狀況圖

孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的冠突散囊菌菌落形態(tài)致密，呈絨毛狀，邊緣呈清晰可見的圓形，且在孟加拉紅瓊脂上是非常典型的金黃色，與培養(yǎng)基本身的紅色基質(zhì)形成明顯的對比。而在察氏培養(yǎng)基上的冠突散囊菌菌落疏松，顏色暗淡，與培養(yǎng)基對比不夠清晰，難以計(jì)數(shù)。因此綜合考慮，孟加拉紅瓊脂為檢驗(yàn)茯磚茶中冠突散囊菌的最適培養(yǎng)基，這也與劉相真等[11]的研究結(jié)論一致。

5 結(jié)論

雖然茯磚茶的不同產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中對冠突散囊菌的指標(biāo)要求不同，但冠突散囊菌是評價茯磚茶質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)，其檢測方法卻存在問題和爭議。本文分析了冠突散囊菌檢測時不同取樣方式的優(yōu)缺點(diǎn)，描述了冠突散囊菌在3種不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，為茯磚茶中冠突散囊菌的檢驗(yàn)檢測提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。