面向碳中和的微藻適應性實驗室進化研究進展

趙權宇

（南京工業(yè)大學藥學院，江蘇 南京 211816）

碳減排是關乎全球長遠穩(wěn)定發(fā)展的重大挑戰(zhàn)［1］。因此，必須降低大氣中的CO2濃度，嚴格控制全球溫度的上升在2℃［2］，甚至1.5℃以內［3］。繼簽訂《京都議定書》后，我國政府于2020年9月鄭重宣布了“CO2排放力爭于2030年前達到峰值，努力爭取2060年前實現碳中和”的減碳目標?；瘜W、物理和生物學方法均可進行CO2的封存和利用。在自然界，有6條天然的生物固碳途徑［4］。其中，Calvin循環(huán)是光驅動的好氧固碳途徑，廣泛存在于地球上的高等植物和藻類中。英國牛津大學和美國加州大學等單位的科學家在Nature共同撰文評價CO2減排的10條途徑，微藻產品是其中之一［5］。為早日達成碳中和目標，研發(fā)微藻基生物減排技術大有可為。

微藻通過光合作用固定CO2，在脅迫條件下富集油脂或淀粉等，是高效的光合細胞工廠。近10年來，微藻生物技術在生物燃料等領域的應用受到廣泛關注［6］。研究者在藻種選育、光生物反應器設計及大規(guī)模培養(yǎng)［7-8］、微藻收獲［9］等方面都取得了長足進步。然而，開發(fā)微藻基負碳途徑還需要克服一些技術瓶頸［10-12］。微藻生物燃料的生產成本仍然較高，用水量大，占用土地廣，這極大限制了其產業(yè)化步伐。多數微藻不能耐受超過2%的CO2，而工業(yè)煙道氣中除了10%～25%的CO2，還有NOx和SOx等污染物，這些煙道氣組分都會抑制微藻生長［13］。藻種選育是微藻固碳技術路線的起點，藻株強化后有助于達到穩(wěn)定固碳的目標。為解決微藻產業(yè)化層面的問題，可以利用廢水資源解決微藻培養(yǎng)中的水需求，可以通過生產高附加值產品提高經濟性［14-15］。

除了不斷發(fā)現新的天然固碳途徑［16］，合成生物學是強化微藻CO2固定、廢水處理和高附加值產品研發(fā)，構建微藻基碳中和途徑的強大工具。萊茵衣藻［17-18］、三角褐指藻［19-20］和微擬球藻［21-22］等的基因工程改造已經成為可能，然而利用合成生物學手段進行其他真核微藻的途徑重構或基因工程改造仍是困難的。很多具有應用潛力的微藻來自野外篩選，還沒有進行基因組測序，基因工程改造成功率低。并且，多數環(huán)境耐受性并不是簡單地由單個基因控制，多靶點的基因改造難度更大。適應性實驗室進化（ALE）是合成生物學的重要手段［23-24］，已經成功用于細菌、酵母和藻類的菌/藻種選育［25-26］。通過進化工程手段可以提高微藻對環(huán)境脅迫的耐受性［27］。其中，開發(fā)高附加值產品可提高微藻生物固碳過程的經濟性，尚需利用合成生物學手段調控或構建新的代謝途徑。微藻是良好的光合固碳底盤，本文將就面向碳中和目標的微藻適應性實驗室進化進行綜述。

1 微藻適應性實驗室進化的基本流程

適應進化可以不通過基因工程手段而活化潛在途徑、強化特定代謝表型或提高環(huán)境適應能力。自然界的生命體在長期演變中為適應環(huán)境變化存在自然選擇，由此產生適應進化。實驗室內，微生物的適應進化實驗可以作為研究進化的工具，也可以作為開發(fā)工業(yè)新菌株的手段［28-29］。

微藻ALE的效率取決于初始藻株的種類、微藻的初始細胞密度和進化策略等（圖1）。初始藻株需具備一定的生長、抗逆或高產的基礎及潛力。微藻的細胞接種密度、培養(yǎng)體積和每次更新的體積等與細胞增殖密切相關，也影響突變藻株的篩選效率。ALE可為連續(xù)培養(yǎng)模式，也可為間歇培養(yǎng)模式。適應進化的常用方法是培養(yǎng)微生物達到一定的指標后進行傳代培養(yǎng)。不斷重復這個過程直至代謝表型趨于穩(wěn)定，獲得進化藻株。ALE的進化策略包括脅迫策略和非脅迫策略。需要指出的是，脅迫策略是常見的構建抗逆藻株的途徑，而非脅迫策略在不抑制生長的條件下，改善生長表型，并提高油脂等的累積［30］?；诨瘜W調節(jié)劑的適應性實驗室進化（CM-ALE）用于改善隱甲藻的脂質生成［31］?；瘜W調節(jié)劑抑制特定細胞內酶的活性，是一種調節(jié)碳分配的化學脅迫，顯著提高微藻的脂質生產。因此，CM-ALE是構建微藻進化菌株的有效策略。在適應進化中利用富里酸定向調控多不飽和脂肪酸的累積也取得了進展［32］?；瘜W調節(jié)劑可在不抑制微藻生長的條件下，定向調控微藻目標產物的合成，是目前的研究熱點。改變微藻ALE的藻種選擇、基本條件和進化策略，可能會獲得不同的進化藻株。微藻的基因突變也是隨機的。即使ALE的環(huán)境脅迫條件相同，同一個出發(fā)藻株經過不同的ALE也會產生不同的進化藻株。即使這些進化藻株的耐受性或進化表型相近，其突變基因也存在差異。

圖1 微藻ALE的基本流程Fig.1 Basic procedure of ALE for microalgae

2 微藻適應性實驗室進化的基本方法

“物競天擇，適者生存”是自然界的普遍規(guī)律。適應是能順應環(huán)境脅迫，或同種或異種生物的競爭，最后能生存下來的都屬于進化后的“強者”。這也是自然界物種不斷演變和極大豐富的原因。在實驗室保存的萊茵衣藻也出現了代謝表型的變化［33］。更多的是自然界中響應環(huán)境脅迫出現的突變藻株。在意大利Bossoleto二氧化碳泉附近的空氣中CO2的濃度可達1080～2160 mg/m3［34］，該地的藻株可以耐受3600 mg/m3的CO2。原則上，研究用的藻株都直接或間接來源于自然界，有些在篩選和純化后進行過誘變等改造。從極端環(huán)境等篩選藻株往往具有高耐受性，但是篩選工作量大，費時費力。為了獲得可以耐受更高濃度CO2或其他脅迫條件的藻株，ALE是可行的改善微藻代謝表型的技術途徑。從適應進化或馴化的時間尺度上，可以將ALE分為短期馴化和長期進化。

2.1 短期馴化

有些研究發(fā)現，2～19 d左右的短期馴化就可以獲得耐受酸性、高光強、高濃度CO2、高氨氮、高溫和高鹽度等環(huán)境脅迫的藻株。微藻短期馴化的基本條件和時間等總結于表1。相對來說，長期ALE比短期馴化可以獲得更穩(wěn)定和更具耐受性的藻株。經過257 d（1255代）獲得的進化萊茵衣藻藻株在0.2 mol/L NaCl的生長高于短期馴化（2 d）的藻株［41］。需要考慮兩個問題，短期馴化能否強化耐受表型，以及耐受表型能否穩(wěn)定遺傳。短期馴化能否成功，還要綜合考慮藻株和脅迫條件。高鹽［42］或煙道氣［43］等環(huán)境脅迫不能短期獲得耐受性，只能采取分段ALE。ALE包括出現不同耐受性突變株，以及高耐受藻株在不同周期中的逐步富集和低耐受株逐步被淘汰的過程（圖2）。短期馴化的藻株能否穩(wěn)定遺傳還需要更長期的考察。有必要對短期馴化和長期進化的藻株進行系統(tǒng)分析，探索相關的機制問題。

表1 微藻的短期馴化Tab.1 Short-term acclimation for microalgae

2.2 長期進化

長期進化是獲得穩(wěn)定進化藻株的有效方式。一般來說，微藻在自養(yǎng)條件下生長速度比大腸桿菌或釀酒酵母等微生物在異養(yǎng)條件下慢，在環(huán)境脅迫條件下生長周期更長。微藻中的整個適應進化過程可能需要3個月到2年以上的時間。因此，提高適應進化的效率非常重要。微藻長期進化的內容總結于表2。為了提高對環(huán)境脅迫的耐受性，適應進化中的初始生物質濃度可能需要0.5～0.8 g/L［57］，每個循環(huán)（cycle）只能增殖2～3代（generation）。整個適應進化周期增殖代數少，適應進化效率低。一般來說，大腸桿菌或釀酒酵母等微生物的適應進化都在500～2000代。微藻的單一適應進化周期1～21 d不等［32，52］。因為在環(huán)境脅迫條件下微藻生長受到抑制，每個周期的最終細胞密度有限。因此，每個周期的增殖世代數可能會很低。為了獲得穩(wěn)定的藻株，總增殖代數是比總周期數更關鍵的評價指標［27］。提高適應進化效率還有一些新的方法。物理和化學誘變將帶來隨機的堿基突變，而適應進化過程是對誘變后藻株的再篩選，并修復誘變帶來的細胞損傷［58-59］。Kondo教授等［50］結合適應進化和誘變的新方法，雖然接種生物質濃度只有0.02 g/L，84 d后就獲得了耐鹽藻株。除了對純微藻的馴化，也有研究采用了對微藻群落的ALE，這樣得到的進化藻株更接近實際應用的需要。經過幾個月的適應進化，微藻群落可以耐受30% CO2，并在火力發(fā)電廠進行了側線測試［60］。需要注意的是，ALE的時間并非越長越好，進化70 d得到的進化株其生長和油脂含量等指標就略優(yōu)于進化80 d得到的進化株［61］。為了提高ALE的效率，目前已經建立了微滴培養(yǎng)系統(tǒng)的高通量ALE策略［62-63］。

3 微藻適應性實驗室進化的應用

3.1 CO2固定

微藻培養(yǎng)的CO2來源可以來自空氣或者煙道氣等工業(yè)廢氣。一般來說，一個藻株有最佳的CO2培養(yǎng)濃度。如果不能耐受高濃度CO2，可以通過ALE強化其對低pH的耐受并改善固碳能力。以10%或

20%CO2為脅迫壓力，選擇一株野外分離的小球藻為出發(fā)藻株，經過30個周期分別獲得了兩株進化藻株，AE10和AE20［64］。這兩株進化藻株在1%～30% CO2條件下均能高效固碳，而且AE10的固碳能力要強于AE20。這也說明，適當的脅迫壓力是ALE成功的關鍵之一，并非脅迫壓力越大獲得的進化藻株越好。煙道氣中的NOx和SOx在微藻培養(yǎng)基中累積，會快速降低培養(yǎng)基pH，同時也會存在鹽離子毒性。選擇經過一次ALE的進化藻株AE10作為新的出發(fā)藻株，以模擬煙道氣作為脅迫壓力，分5段遞增模擬煙道氣濃度進行適應進化后，獲得了新的進化藻株Cv（二次進化藻株），可以耐受10%CO2、200 mL/m3NOx和100 mL/m3SOx［43］，為微藻直接利用煙道氣進行固碳提供了可能。需要指出的是，工業(yè)煙道氣中還含有其他痕量污染物，對微藻也存在抑制作用［13］。研究發(fā)現，進化藻株AE10是通過10%CO2作為脅迫壓力經過ALE獲得的，但是AE10具有耐受高光強［65］和20 g/L NaCl［42］的多種抗逆性能，再經過兩段適應進化，獲得了可以耐受30 g/L NaCl的進化藻株S20［36］。從一個淡水藻株，到一個可以在海水中生長并快速固碳的藻株，ALE發(fā)揮了重要作用。

3.2 廢水處理

微藻培養(yǎng)需要大量的水，而工農業(yè)廢水和城市污水中含有一定濃度的氮、磷，是微藻培養(yǎng)必需的營養(yǎng)元素。利用廢水培養(yǎng)微藻可以構建綠色生態(tài)循環(huán)，也有助于實現雙碳目標。高濃度苯酚會抑制微藻生長，出發(fā)藻株L3經過90 d的ALE，進化后的小球藻藻株L5可以去除500～700 mg/L的苯酚［57］。ALE也成功用于強化球等鞭金藻（I.galbanaParke）對苯酚的耐受性［51］。先在100 mg/L苯酚的脅迫下進化90 d，得到進化藻株PAS-1，再在200 mg/L苯酚的脅迫下進化90 d，得到PAS-2。PAS-1和PAS-2可以分別耐受200 mg/L和300 mg/L的苯酚。并且，這兩個進化藻株均可在5 d完全去除200 mg/L的苯酚。從垃圾滲濾液中分離得到藻菌菌群，經過2年的ALE，群落中小球藻的生長速率提高了兩倍，硝態(tài)氮和氨氮均可去除［53］。廢水和污水中往往含有細菌等微生物，開放式培養(yǎng)更是無法做到完全無菌，菌群的適應進化可以構建更具魯棒性的培養(yǎng)系統(tǒng)［66-67］。廢水中一定濃度的有毒有害物質，對微藻構成脅迫。有可能通過ALE強化耐受性并高效去除這些污染物。廢水的種類眾多，污染物的種類和濃度也千差萬別，ALE用于強化微藻廢水處理藻株的研究還有必要進一步深入。

3.3 表型強化

表型強化包括強化生長表型和強化代謝表型。野生型大腸桿菌的生物質合成只能達到理論計算值的40%～60%。剛剛構建的單基因敲除突變體甚至無法正常生長。這些突變體經過適應進化，生物質合成或代謝產物生產等均會顯著增加，與基因組尺度代謝網絡模型的預測結果接近［68］。微藻固碳之后，細胞內將進行碳分配，調控獲得更多的油脂或糖。理論上，抑制糖合成將提高油脂的累積。但是，經誘變獲得的兩株萊茵衣藻糖合成缺陷突變株的油脂含量并未顯著提高［30］。在最佳生長條件下，以該兩株藻作為出發(fā)藻株，經過84 d的ALE，進化后藻株的生長均得到強化。并且，其中一進化藻株在缺氮條件下的油脂含量與進化前相比提升了將近1倍。ALE除了強化了生長，對油脂［69］和色素的合成［46-47］也有促進作用。環(huán)境脅迫條件將在微藻胞內產生活性氧自由基，并調控碳分配向DHA等多不飽和脂肪酸［54-56］。微藻油脂等高附加值產品的累積往往通過培養(yǎng)過程的環(huán)境脅迫來獲得，但是環(huán)境脅迫會限制微藻生長。如果采取兩段法，第一段生長，第二段油脂或糖等累積，兩段法的總體時間過長會降低產率［65］。如果通過ALE獲得進化藻株，可以既不抑制微藻生長，又高產高附加值產品，將進一步提高微藻固碳技術途徑的可行性。

4 微藻適應性實驗室進化的機制分析與合成生物學

4.1 機制分析

進化前后的藻株在生理生化［70］、基因水平［71］、轉錄水平［72-73］、代謝物濃度［45］和表觀遺傳［58］等方面均存在差異。出發(fā)藻株和進化藻株的比較組學分析有利于理解進化藻株對環(huán)境脅迫的響應與耐受機制［74］。微生物的適應進化多數是點突變，進化前后的菌株只在1～80 bp堿基上存在差異，只有在個別情況下是大片段基因變化造成的表型差異［75］。而且，可能有多個基因型具有相似的表型。釀酒酵母耐受鹽酸和乳酸的研究也表明有多個途徑都可以實現耐酸表型［76］。藻類的基因組比微生物大得多，基因注釋也不完善。適應進化前后比較基因組學研究將從根本上揭示適應進化的分子機制。此外，需要從熱力學等角度認識適應進化過程。黃和等［54-56］構建了多個裂殖壺菌的進化株。綜合分析這些裂殖壺菌適應進化藻株的發(fā)酵過程。結果表明，DHA發(fā)酵過程的有效能效率與生物量產率存在線性關系（R2=0.8044），說明適應進化可以通過強化生長表型提高DHA有效能效率，為進一步通過適應進化提高DHA發(fā)酵性能提供參考［77］。

轉錄組學可以在全基因組尺度比較出發(fā)藻株和進化藻株的實時差異。光合作用對微藻生長具有重要影響。一般的環(huán)境脅迫可能會對光合系統(tǒng)活性造成損傷，使得微藻的生長受到抑制。對比耐受苯酚進化藻株L5和出發(fā)藻株L3，比較轉錄組結果表明適應進化確實強化了代謝網絡中多數基因［70］。但是苯酚的存在仍會下調光合作用、氧化磷酸化和部分氨基酸代謝相關基因的表達。耐受苯酚的機制來源于光合作用、抗氧化酶和色素合成等相關基因的上調［70，78］。對可耐受30 g/L的鹽的適應進化藻株S30和AE10進行無參轉錄組分析［42］。結果表明，高鹽度嚴重影響光合作用、氧化磷酸化、脂肪酸合成和酪氨酸合成代謝，相關基因顯著下調?？寡趸?、CO2固定、部分氨基酸代謝、中心碳代謝和ABC傳遞系統(tǒng)顯著上調。值得注意的是，除了C3固碳途徑，C4固碳途徑和景天酸代謝途徑的基因都顯著上調。這說明相關途徑與耐鹽相關。耐受模擬煙道氣的進化藻株Cv在模擬煙道氣和10%CO2中的比較轉錄組結果中顯著變化的基因僅有495個，集中在光合作用、氧化磷酸化和氨基酸代謝等代謝途徑中［43］。進化藻株Cv在模擬煙道氣中通過上調光合作用、氧化磷酸化、氮還原和硫代謝中cysA基因，快速利用氮和硫，防止溶解在培養(yǎng)基中的NOx和SOx降低pH，保護微藻光合系統(tǒng)。耐受苯酚［70］、鹽［42］和模擬煙道氣［43］的適應進化轉錄組學機制研究結果表明，耐受性均涉及光合系統(tǒng)、抗氧化等多個代謝途徑中多個基因的顯著變化，進行多基因的合成生物學改造存在困難。經過650天ALE得到可耐受高濃度葡萄糖的寇氏隱甲藻（C.cohnii）進化藻株［52］。代謝組學分析結果表明，甘油、谷氨酸、丙二酸和琥珀酸是中樞代謝物。這些組學分析獲得了微藻的一些代謝調控規(guī)律和耐受機制，比較基因組學的研究可以獲得更多基因或元件信息，為合成生物學改造提供借鑒。

4.2 進化工程的動態(tài)研究

為深入理解適應進化的機制，需要考察適應進化的動態(tài)過程。在ALE過程中，隨著周期的增加，產生不同的突變株，而且突變株種群也在不斷變化（圖2）。在環(huán)境脅迫條件下，能夠適應的突變將保存下來，并在種群內部占據主體，最后可能得到單一突變體，或者得到幾個突變體的組合。如果能快速鑒別和篩選這些高耐受突變體，將顯著提高ALE效率。在提高耐受性的ALE中，環(huán)境脅迫壓力是主要的篩選條件，如果是面向提高生長和代謝物高產表型的ALE，則需要研發(fā)有針對性的檢測指標或生物傳感器。

為了更好地理解ALE的動態(tài)過程，已經開發(fā)一個ALE的優(yōu)化程序，ALEsim［79］，為進一步設計和優(yōu)化ALE提供了工具。ALEdb 1.0則是一個微生物ALE的網上數據庫［80］，該數據庫包含11000個突變體的信息。通過以往這些ALE的成功實驗結果，可以更精準地設計微藻ALE過程。需要注意的是，部分文獻中關于ALE過程的描述不夠細致，或者根本沒提供ALE過程的詳細數據，很難進行系統(tǒng)比較。這也要求在微藻的ALE實驗中采集足夠的信息，為今后的分析打下基礎。更需要從酵母［81-83］或細菌的ALE中借鑒經驗，完善微藻ALE的設計［24，83］。

4.3 合成生物學在ALE中的應用

近年來，合成生物學在基因組編輯［84-86］、代謝調控［87-88］等方面都有了突破性進展。合成生物學和進化工程結合［89］，將提高微藻ALE的效率，構建更有抗逆性和固碳能力的藻株。

ALE為合成生物學提供新的抗逆基因或元件。ALE后獲得的進化藻株中存在一定的基因突變，通過比較基因組學等手段可以獲得潛在的抗逆基因或代謝工程改造的候選基因。相關元件的挖掘將為進一步的合成生物學改造提供參考［90］。生物元件是合成生物學的基本要素之一［91］。目前，利用比較基因組學等手段，獲得了微藻耐受低溫等的基因和元件信息。在極地雪藻（Chlamydomonas nivalis）從22℃轉到4℃培養(yǎng)時，12個轉錄因子和3個RNA鍵合蛋白出現顯著變化，積極調控微藻進行響應［92］。通過基因組、轉錄組和蛋白質組等多組學數據全面分析了可在接近0℃生長的小球藻的基因、轉錄和蛋白等水平的差異，進一步的發(fā)掘將會獲得新穎的生物元件［93］。通過合成生物學手段強化光合系統(tǒng)效率，對微藻的藻種改造至關重要［94］。在藍藻中獲得的相關元件也可為真核微藻借鑒。

從進化藻株篩選的候選抗逆基因等還需要進行驗證。已從自然進化的藻株中發(fā)現了基因變異［71，95］。在低濃度CO2的環(huán)境中，微囊藻（Microcystis）的無機碳利用基因以bicA+sbtA為主。當CO2濃度增加，則以bicA為主［95］。在模式微生物中發(fā)現候選抗逆基因，通過合成生物學手段改造微生物，再通過ALE強化表型是比較成熟的菌種改造路線。比如，檸檬烯會抑制解脂耶氏酵母生長，造成檸檬酸產量低。通過轉錄組學發(fā)現82個基因上調響應檸檬烯脅迫。從中選擇8個候選基因進行改造，確實獲得了高產檸檬烯的酵母菌株［96］。微藻的轉錄組等組學信息也揭示了一些顯著變化基因，可以采取類似策略進行改造。但是真核微藻的合成生物學改造在模式微藻中成功率較高［97］。對非模式真核微藻很難通過反向代謝工程手段進行驗證。主要原因是受限于真核微藻基因組信息和基因操作工具的缺乏、低效。比如微藻同源重組效率低［98-99］，而非模式微藻的基因組編輯工具尚需完善［100］。微藻的代謝調控機制非常復雜，往往是多個基因協(xié)同作用，而多基因的基因操作就更為困難。此外，真核微藻中光合作用也非常重要，但是釀酒酵母和大腸桿菌均無光合系統(tǒng)，藍藻等原核生物的基因操作較為成熟，可以考慮在藍藻中驗證。利用合成生物學手段進行多位點編輯，可以獲得具有遺傳多樣性的進化菌株，也是提高ALE效率的潛在方法［24］。基因組多位點編輯在酵母中應用較廣［101］，但是對于微藻還是困難的。隨著技術的發(fā)展，非模式真核微藻的基因組編輯工具將更高效，其基因組多位點編輯也會成為可能。

5 挑戰(zhàn)與展望

微藻通過光合作用進行固碳，在自然界中為碳循環(huán)貢獻著力量。面向“雙碳”重大戰(zhàn)略需求，需要發(fā)揮微藻的優(yōu)勢，提出可行的碳中和路線。根據這些技術路線的需要，ALE強化藻種代謝表型和耐受性，并提高這些技術路線的技術可行性和經濟可行性。目前，微藻的ALE還存在效率低、機制分析不明確、合成生物學應用少等問題。

（1）進一步提高微藻的固碳效率，服務碳中和目標。微藻固碳的利用率和對不同工況的適應性還有待提高。部分進入培養(yǎng)系統(tǒng)的CO2停留時間短，造成對CO2的利用率低。從光生物反應器的結構設計等方面可以提高碳的利用率，對藻種來說，微藻快速生長就可以高效固碳。還需要提高微藻對不同工況的適應性，特別是室外培養(yǎng)中溫度和光強等周期性變化。在培養(yǎng)體系中加入CO2吸收劑也是增加CO2溶解度和固碳效率的方法，有些吸收劑對微藻也會產生抑制，需要通過ALE強化對這些吸收劑的耐受性。

（2）提高微藻廢水處理效率，滿足微藻對水資源需要同時有效固碳。微藻廢水處理中除了氨氮和鹽脅迫，不可避免地還要受其他化合物和微生物的影響。對于含菌系統(tǒng)如果提高微藻的生長，發(fā)揮藻和菌各自的作用，也可以通過ALE構建更穩(wěn)定的體系，進而提高微藻廢水處理效率。

（3）綜合開發(fā)微藻高附加值產品，提高碳中和路線的經濟性。ALE除了可以提高微藻的生長，并高效固碳，還提高了油脂或者色素的產率。為了進一步提高微藻碳中和技術路線的經濟性，還需要篩選新的微藻高附加值產品?？梢酝ㄟ^加入化學誘導劑的方法提高這些產品的產率，相關的策略還有待進一步完善。

（4）探索微藻ALE的分子機制和代謝調控規(guī)律。微藻進化藻株的機制分析從根本上來說，還要通過比較基因組和表觀組學的方法進行分析。目前相關研究還不充分，因為微藻的基因組測序數量比微生物少得多，基因注釋還不完善。轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學等更多的是從代謝調控角度闡明相關機制。轉錄組及代謝組的研究一般僅停留在代謝網絡層面，對信號傳導途徑的研究不多?？鼓嫘耘c信號傳導途徑息息相關。構建多組學的系統(tǒng)生物學分析，將有助于明確對微藻代謝和抗逆機制的認識，并為進一步的合成生物學研究服務。

（5）提高微藻ALE的效率。隨著微藻ALE研究的深入，特別是可以借鑒其他微生物ALE的成果，從藻株篩選、ALE條件和進化策略等角度合理設計，努力使微藻盡快達到ALE的終點，獲得進化藻株。搜集ALE中的動態(tài)信息并構建模型，獲得ALE的進化規(guī)律?？梢院驼T變等方法結合，構建更多的突變體，并高效篩選滿足耐受性的藻株。加入適當濃度的化學調節(jié)劑，可以在不抑制微藻生長的前提下，調控胞內代謝產物累積，也有利于提高微藻ALE效率。

（6）發(fā)揮合成生物學的優(yōu)勢，構建非天然固碳途徑。以微藻作為可光合作用的底盤，通過進化工程強化藻株的耐受性，并獲得更多的進化藻株。通過比較基因組學分析等，發(fā)掘固碳和抗逆元件，可以在其他生物中進行異源表達，并合成新的非天然代謝途徑，為實現碳中和目標貢獻力量。隨著基因編輯技術的發(fā)展，真核微藻的基因工程改造效率將不斷提高。研發(fā)新模式微藻的底盤細胞，并通過合成物學手段構建固碳和高附加值產品生物合成新途徑，將助力微藻合成生物學技術實現碳中和目標。