光合作用碳同化的合成生物學(xué)研究進展

盛陽陽，徐秀美，張巧紅，張立新

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建作物逆境適應(yīng)與改良國家重點實驗室，河南 開封 475004）

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織預(yù)測，到2050年，世界人口將激增34%，達到91億，糧食需求將增長50%～70%［1-2］。由于全球人口數(shù)量增多，而可利用耕地面積日益減少，糧食單產(chǎn)必須大幅提升才能滿足人類基本需求。氣候變化、土地鹽化等對農(nóng)業(yè)的影響使問題更加復(fù)雜。提高作物產(chǎn)量潛力的策略已經(jīng)開始在光合作用中研究，以推動一場新的綠色革命［3-5］。光合作用是作物產(chǎn)量形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，90%以上的植物干物質(zhì)來源于光合作用碳同化，因此，尋找新的技術(shù)策略提高作物碳同化效率是增加糧食單產(chǎn)以應(yīng)對糧食危機的重要手段。

通過理論計算，植物將光能轉(zhuǎn)化為有機物的效率僅約1%左右，光合作用效率還有很大的提升空間［6-7］。如何提高植物的光能利用率，制造更多的光合產(chǎn)物，是植物生產(chǎn)中的根本性問題。光合作用一般分為兩個階段：第1個階段稱為光反應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)化成同化力（NADPH和ATP）并產(chǎn)生O2，在類囊體膜上進行；第2個階段稱為碳同化，利用光反應(yīng)產(chǎn)生的同化力將CO2轉(zhuǎn)換為糖類，在葉綠體基質(zhì)中進行。光合作用可大致分為3個部分：①光能的吸收傳遞與轉(zhuǎn)換；②電子傳遞和光合磷酸化；③碳同化過程。光是驅(qū)動光合作用的能量來源，光能的吸收、利用和轉(zhuǎn)化直接影響著光合效率和光能利用率。而光能的高效利用不但可以為植物的碳同化提供還原力，還可以進一步促進光能的高效吸收［8-9］。

合成生物學(xué)是21世紀初新興的由分子生物學(xué)、基因組學(xué)、信息技術(shù)和工程學(xué)等融合的交叉學(xué)科。它按照人類需求對生物體進行人工設(shè)計、改造乃至重新合成非自然功能的生物系統(tǒng)［10-12］，來解決能源［13-14］、材料［15-16］、健康［17-18］和環(huán)境［19-20］等問題。合成生物學(xué)從最初的微生物系統(tǒng)開始，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到包括植物系統(tǒng)在內(nèi)的真核生物中［21-25］。合成生物學(xué)在人工構(gòu)建新的CO2同化通路中顯示出巨大的潛能，在提高Rubisco酶的羧化活性、引進CO2濃縮機制、減少碳損耗和降低光呼吸等方面已取得重要研究進展（圖1）。本文將對相關(guān)研究進行匯總并討論其在未來農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展前景。

圖1 提高光合作用碳同化效率總思路Ru-5-P—5-磷酸核酮糖；RUBP—1，5-二磷酸核酮糖；G2P—2-磷酸甘油酸；3-PGA—3-磷酸甘油酸；GAP—丙糖磷酸Fig.1 Overview of improving carbon assimilation efficiency of photosynthesisRu-5-P—Ribulose 5-phosphate;RUBP—Ribulose 1,5-bisphosphate;G2P—2-phosphoglyceric acid;3-PGA—3-磷酸甘油酸;GAP—Triose phosphate

1 提高Rubisco酶的羧化活性

Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）是光合作用碳同化的關(guān)鍵酶，催化CO2同化和光呼吸碳氧化的第1步反應(yīng)，在藻類、植物以及部分光合作用細菌中非常保守。Rubisco的羧化效率非常低，是光合作用碳同化反應(yīng)的限速酶［26-28］，因此提高Rubisco酶的羧化活性是提高碳同化效率的重要途徑之一。

幾十年以來，研究人員為提高Rubisco催化效率一直不斷探索（表1）?？蒲腥藛T試圖在煙草中轉(zhuǎn)化藍藻Rubisco大亞基rbcL基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)能夠檢測到藍藻rbcL基因的轉(zhuǎn)錄本，但沒有檢測到藍藻rbcL蛋白［38］。由于藍藻中的rbcL基因在煙草中的表達情況不理想，科學(xué)家嘗試將紅藻Rubisco大亞基的rbcL基因轉(zhuǎn)到煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草與野生煙草相比生長緩慢，在子葉出芽后36 d，其長勢矮小，地上部干物質(zhì)減少。且轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性葉蛋白含量較低，尤其是煙草Rubisco含量較低，最終導(dǎo)致葉片CO2同化力和植物生長量的降低［29］。Lin等［30］敲除編碼Rubisco大亞基的天然煙草基因，通過進一步研究獲得了具有功能性藍藻Rubisco的轉(zhuǎn)基因煙草植株，該植株具有光合作用能力，支持自養(yǎng)生長，在較高的CO2濃度下表現(xiàn)出較好的羧化酶活性。野生型煙草中Rubisco的羧化酶活性沒有隨著CO2濃度的增加而增加，這證實了煙草Rubisco酶在125 μmol/L CO2濃度時已經(jīng)飽和，且在125 μmol/L、250 μmol/L和640 μmol/L的CO2濃度下，轉(zhuǎn)基因煙草植株中的Rubisco酶相比野生型均具有更強的羧化酶活性和更高的CO2同化率，這為通過尋找其他物種中高羧化活性的Rubisco酶，然后通過基因工程的改造，提高糧食作物中的碳同化效率提供了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)紅藻Griffithsia monilis和莧菜Amaranthus edulis中的Rubisco酶的CO2特異性/活性比分別是C3作物的2倍和1.5倍，用紅藻和莧菜的Rubisco酶代替現(xiàn)有的C3作物Rubisco可以分別增加超過25%和17%的碳同化［31］。此外，Prins等［33］在25個野生小麥中篩選得到Rubisco酶活性高的優(yōu)良品種，通過計算得出優(yōu)良品種中Rubisco酶的碳同化效率比普通小麥增加20%。

表1 Rubisco酶活性的合成生物學(xué)研究匯總Tab.1 Summary of Rubisco enzyme activity by synthetic biological research

Whitney等把深紅紅螺菌Rhodospirillum rubrum的Rubisco基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株可以存活和繁殖，但是需要高濃度的CO2。這與細菌Rubisco的動力學(xué)特征相一致，即紅螺菌Rubisco酶的底物特異系數(shù)（VcKo/VoKc）相對于其他物種是比較低的（Vc和Vo分別為Rubisco酶羧基化和氧化反應(yīng)的最大速率，Kc和Ko為CO2和O2的米氏常數(shù)）［39］。將煙草質(zhì)體中的Rubisco大亞基替換為人工合成的編碼融合肽，即用1條40個氨基酸的柔性鏈連接煙草Rubisco的大、小亞基。雖然Rubisco的CO2/O2專一性或羧化率幾乎沒有變化，但這種融合策略為煙草質(zhì)體中同時開始Rubisco的大、小亞基的轉(zhuǎn)化提供了新的思路［34］。通過對Rubisco酶的工程改造以提高農(nóng)作物的碳同化效率一直是我們的目標，然而僅僅改進Rubisco是否真的提高田間農(nóng)作物的碳同化效率還有待證明。

Ishikawa等在水稻中引入高粱Rubisco小亞基，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)基因植株的Rubisco的含量及催化活性均提高，但轉(zhuǎn)基因水稻的光合速率并沒有增加，這表明催化活性和Rubisco含量的增加都可能導(dǎo)致酶的光合活性的過剩［40］。最近的研究中他們進一步利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在之前發(fā)表的高粱Rubisco小亞基轉(zhuǎn)基因水稻中進一步敲除了水稻除OsRbcS1以外的其他4個基因——OsRbcS2～5，獲得Rubisco沉默水稻株系。結(jié)果表明植株中Rubisco含量相較野生型有所下降，而催化速率和CO2的親和力則明顯上升。雖然過表達高粱Rubisco基因的水稻中Rubisco積累水平較低，但是在高濃度CO2條件下，相較野生型展現(xiàn)更高的CO2同化效率，表明高粱Rubisco酶具有更高的羧化酶活性［32］。最新研究構(gòu)建一個RNAi-RbcS煙草（tobRrΔS）體系，通過葉綠體轉(zhuǎn)化rbcL-rbcS操縱子。在煙草中轉(zhuǎn)入不同的馬鈴薯rbcL-rbcS操縱子并加以改造后，其羧化率提高了13%～17%。此研究為在整個植物中引入新的Rubisco復(fù)合物提供了一個有效的生物工程改造策略［41］。

Rubisco的生物合成依賴于輔助因子，包括用于折疊的ES型伴侶蛋白、用于組裝的伴侶蛋白RbcX及活化酶（RCA）的調(diào)節(jié)［35-36，42］。RCA是一種核基因編碼的可溶性葉綠體蛋白，具有ATPase活性，屬于AAA家族成員［43-44］，普遍存在于高等植物、綠藻和部分光合細菌中［45］。球形紅細菌Rhodobacter sphaeroides的IC型red Rubisco是一種能夠在植物葉綠體中組裝的紅型Rubisco［46-49］。共表達Rubisco及其同源活化酶可以提升Rubisco的活性，使植物的光合作用速率和生長提高1倍。更重要的是，球形紅細菌Rubisco在未來植物葉綠體中進行優(yōu)化提供了一個很好的蛋白質(zhì)支架，這對改善作物光合作用的研究具有重要意義［50］。最新的研究表明，在水稻中共表達水稻Rubisco酶和玉米Rubisco活化酶，可以減輕持續(xù)高溫對水稻的危害［37］。

此外，研究人員在玉米中同時過表達Rubisco大、小亞基及其裝配伴侶RAF1。雖然大亞基和小亞基的過表達對Rubisco含量沒有明顯影響，但Rubisco大、小亞基和RAF1共表達后，Rubisco的含量增加30%以上，轉(zhuǎn)基因植物中CO2同化力增加15%［51］。通過在煙草中表達擬南芥Rubisco大亞基基因及擬南芥裝配伴侶AtRAF1基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草本身和同源的Rubisco裝配伴侶AtRAF1已經(jīng)與擬南芥Rubisco大亞基進行了平行的功能共同進化。AtRAF1形成一個穩(wěn)定的二聚體，當與其同源擬南芥Rubisco大亞基共同表達時，增強了煙草葉綠體中的雜交組裝，并同時改善了葉片的光合作用［52］。

Flecken等［53］對藍藻RCA進行了結(jié)構(gòu)和機制的分析表明，在RCA-Rubisco復(fù)合物中，RCA位于復(fù)合物中Rubisco的催化位點上，并將Rubisco大亞基的N端尾部拉入六聚體孔。同時置換小亞基的C端，打開催化位點，釋放抑制劑，進而調(diào)控Rubisco酶的羧化活性。Saschenbrecker等［54］的研究表明，RbcX形成1個同型二聚體，有2個協(xié)同的RbcL結(jié)合區(qū)域，分別特異性結(jié)合RbcL亞基暴露的C端多肽，使RbcX的外周表面介導(dǎo)RbcL八聚體的組裝。Xia等［55］和Huang等［56］進一步研究表明每個RAF1二聚體捕獲一個RbcL二聚體，其C端尾部插入到Rubisco的催化位點，并進一步介導(dǎo)RbcL二聚體的組裝，形成Rubisco的八聚體核心。

2 引進CO2濃縮機制

除了提高Rubisco酶的羧化活性，提高Rubisco周圍CO2的濃度也可以提高CO2同化效率。自然界中已知的Rubisco都具有與羧化酶活性競爭的加氧酶活性，再加上Rubisco酶活性受其大亞基和小亞基的調(diào)控、組裝等影響，多種生物進化出了碳濃縮機制（CCM），以在Rubisco周圍濃縮CO2［57-58］。這些CCM會增加Rubisco周圍CO2的濃度，以提高CO2/O2比率［59］。這種機制廣泛存在于進行光合作用的有機體中，如光合微生物、藻類和植物等，使生物體在低濃度CO2環(huán)境中也有較高的光合速率。

大自然經(jīng)過長期的進化，出現(xiàn)了多種不同的CCM。C4植物和CAM（景天酸代謝途徑）植物先將一個C3載體羧化成C4雙羧酸中間產(chǎn)物，然后在Rubisco附近（C4植物）經(jīng)過催化，供Rubisco催化的第2次羧化同化。C4植物的兩次羧化是從空間上分開的：①在葉肉細胞中，進行HCO3?的固定，隨后草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸，或谷氨酸在天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用下轉(zhuǎn)化為天冬氨酸；②四碳酸轉(zhuǎn)運到維管束鞘細胞中；③四碳酸脫羧產(chǎn)生CO2，而后CO2進入卡爾文循環(huán)中形成碳水化合物；④脫羧產(chǎn)生的三碳酸（丙酮酸或丙氨酸）重新回到葉肉細胞中；⑤三碳酸在丙酮酸磷酸二激酶作用下產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸［60］。而CAM植物的兩次羧化則是從時間上分開的：①在黑夜，CO2攝取，此時氣孔是張開的，生成蘋果酸儲存在液泡中；②在白天，液泡中的蘋果酸返回到細胞質(zhì)基質(zhì)中，釋放CO2，進入卡爾文循環(huán)形成碳水化合物［61］。由于C3植物缺乏CCM，所以科學(xué)家希望在C3植物中引入CCM，提高光合效率以提高作物產(chǎn)量［62］，據(jù)預(yù)測引入CCM可使植物產(chǎn)量提高60%，并提高水和氮的利用效率［63］。

首次將CCM轉(zhuǎn)化到水稻中的嘗試表明，轉(zhuǎn)入4種C4光合酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）、NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）和NADP-蘋果酸酶（NADP-ME），對CCM沒有任何改善［64］，這表明僅僅將C4光合酶轉(zhuǎn)化到不含CCM的作物中并不能形成CCM，可能是C3和C4植物維管束鞘細胞和葉肉細胞發(fā)育差異導(dǎo)致的結(jié)果。對C4水稻CCM進行改造的另一種嘗試是改變?nèi)~片的解剖結(jié)構(gòu)，Wang等［65］的研究表明，在水稻中組成型表達玉米ZmG2（GOLDEN2）或ZmGLK1（GOLDEN1-LIKE）基因后，水稻幼苗維管束鞘細胞中的葉綠體和線粒體增大，Rubisco、RCA等光合酶水平的提高，葉肉細胞與維管束鞘細胞之間的胞間連絲密度增加。最近一項研究報道了使用組成型啟動子和基因自身啟動子驅(qū)動玉米ZmG1和ZmG2基因在水稻中的表達，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)基因水稻葉片中維管束鞘細胞中葉綠體的數(shù)目和體積均增大，且具有正常的基粒結(jié)構(gòu)和類囊體膜［66］。這一系列結(jié)果表明GLK能夠誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生類似C4植物的花環(huán)結(jié)構(gòu)，是C3植物中CCM改造的一個方向。

有報道稱轉(zhuǎn)運蛋白本身可以提高碳同化率，盡管同化程度有限［67］。在水稻［68］和大豆［69］中通過轉(zhuǎn)化藍藻ictB基因，可以提高其光合速率和生物量。盡管藍藻或萊茵衣藻的其他轉(zhuǎn)運蛋白可以在植物細胞內(nèi)進行正確定位，但是并不能增加煙草、擬南芥的產(chǎn)量或者促進其生長［70-72］。因此，優(yōu)化轉(zhuǎn)運蛋白的活動仍然是一個挑戰(zhàn)，但在此之前，我們要考慮的重點是怎樣在C3植物中組裝含有Rubisco的區(qū)室，因為Rubisco區(qū)室的建立將使Rubisco周圍CO2濃度進一步增加，為碳同化效率的提升提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

藍藻的CCM都是基于跨膜（一個或幾個膜將介質(zhì)和Rubisco分開）的HCO3?和（或）CO2的主動運輸完成的［73］。藍藻的CCM系統(tǒng)主要由無機碳吸收系統(tǒng)和羧酶體組成［74-76］，共擁有5種不同的CO2吸收運輸系統(tǒng)［77］：①細胞質(zhì)膜上的BCT1，一種可誘導(dǎo)的對HCO3?具有高親和力的轉(zhuǎn)運蛋白，屬于運輸ATP酶家族；②細胞質(zhì)膜上的SbtA，一種可誘導(dǎo)的對HCO3?具有高親和力的依賴Na+的轉(zhuǎn)運蛋白，可能是低流速的Na+/同向轉(zhuǎn)運蛋白；③細胞質(zhì)膜上的BICA，一種低親和力、高通量、依賴Na+的HCO3?的轉(zhuǎn)運蛋白，可能也是低流速的Na+/HCO3

?同向轉(zhuǎn)運蛋白；④NDH-Ⅰ4，可能存在于質(zhì)膜上，是一種基于特殊的NDH-Ⅰ復(fù)合物的組成型CO2吸收系統(tǒng)；⑤類囊體膜上的NDH-Ⅰ3，是基于修飾的NDH-Ⅰ復(fù)合物的第2個CO2吸收系統(tǒng)，在無機碳有限條件下被誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且比NDH-Ⅰ4具有更高的吸收親和力。在藍藻中，Rubisco被封裝在羧酶體中［77-78］，它們進化出了含有羧酶體、Rubisco［79］和碳酸酐酶［80-81］蛋白質(zhì)的細胞。在這種CCM中，碳酸氫鹽通過主動運輸轉(zhuǎn)運到碳酸酐酶缺乏的細胞質(zhì)中，然后進一步運輸?shù)窖b有Rubisco的羧酶體中，被碳酸酐酶脫水形成CO2。人們認為，羧酶體為CO2和O2提供了擴散屏障，使CO2進入、O2釋放，從而增強羧化并抑制氧化［82］，此機制使得CO2的同化在專用區(qū)室中進行，增加了Rubisco周圍CO2的濃度，提高了碳同化效率。CMM具有多種作用：一是改善CO2供應(yīng)，在環(huán)境中CO2或溶解的無機碳減少時提供競爭優(yōu)勢；二是在N、P、Fe和S等營養(yǎng)供應(yīng)不足時改善資源使用效率；三是可以作為一種能量耗散方法。因此，碳濃縮機制對CO2、營養(yǎng)和能量等環(huán)境均有重要的調(diào)節(jié)作用。

羧酶體組裝涉及至少6個基因產(chǎn)物之間的一系列蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用以形成代謝核心，外殼圍繞核心組裝。這種復(fù)雜性給羧酶體轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)和組裝到異源系統(tǒng)中帶來了重大挑戰(zhàn)。在藍藻中構(gòu)建一種嵌合蛋白，它在結(jié)構(gòu)上和功能上取代了羧酶體形成所需的4種基因產(chǎn)物，該蛋白質(zhì)是根據(jù)羧酶體核心中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用設(shè)計的，由此產(chǎn)生的羧酶體可以進行光合作用［83］。所以通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合來簡化羧酶體組裝過程也是未來一個提高碳同化的途徑。此外，CCM是一個復(fù)雜的調(diào)控機制，在C3作物中引入CCM是否真的對作物有益，還有待進一步的確定（表2）。轉(zhuǎn)運蛋白和碳酸酐酶的引入［72，86］以及怎樣在C3植物中組裝含有Rubisco的區(qū)室可能會為C3作物提高光合作用碳同化效率提供一個好的解決方案。

表2 CO2濃縮機制的合成生物學(xué)研究匯總Tab.2 Summary of CO2 enrichment mechanisms by synthetic biological research

此外，另一種途徑——將羧酶體引入不含CCM作物的葉綠體中，也在探索中［84］。在C3作物葉片中引入藍藻CCM的模擬實驗表明，在不改變?nèi)~片解剖結(jié)構(gòu)的情況下，可以實現(xiàn)近60%的葉片凈CO2吸收率。羧酶體在大腸桿菌中的異源表達產(chǎn)生與天然宿主相似的二十面體復(fù)合物。在體內(nèi)，復(fù)合物能夠與羧酶體蛋白組裝并同化CO2，并且純化后的蛋白能夠在體外同化CO2，證明了羧酶體在外來宿主中進行穩(wěn)健組裝的潛力［85］。迄今為止，羧酶體的葉綠體表達一直是一個挑戰(zhàn)，需要十幾種蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達。將簡化的羧酶體成功引入到葉綠體中，為葉綠體中全功能α-羧酶體的逐步構(gòu)建提供了基礎(chǔ)［87］。由于每種作物的生長發(fā)育的機制的不同，其體內(nèi)的葉綠體所需的羧酶體的數(shù)目也不清楚［88］。通過在本氏煙草中瞬時表達多種β-羧酶體蛋白亞基，能夠觀察到在植物葉綠體中組裝成高度有組織的類似于空的區(qū)室組件［84］。再加上藍藻羧酶體已在煙草中功能性表達的事實［33，40］，這些研究都為將來合成出具有完整功能的葉綠體羧酶體提供理論依據(jù)。

3 降低光呼吸

光呼吸即植物在光下吸收O2，釋放CO2。光呼吸始于Rubisco酶的雙功能性：它不僅催化Rubisco的羧化，也催化Rubisco的氧化。O2和CO2競爭與Rubisco反應(yīng)，并且Rubisco氧化與羧化發(fā)生在Rubisco的同一活化部位。其催化方向取決于環(huán)境中CO2和O2的分壓。當CO2分壓高于O2分壓時，Rubisco與CO2發(fā)生羧化反應(yīng)生成PGA（3-磷酸甘油酸）；反之，發(fā)生氧化反應(yīng)，生成PGA和磷酸乙醇酸，磷酸乙醇酸在磷酸乙醇酸磷酸酶的作用下變成乙醇酸（C2）進入C2氧化光合碳循環(huán)，簡稱C2循環(huán)，即光呼吸［89-91］。從碳同化的角度看，光呼吸將光合作用同化的20%～40%的碳轉(zhuǎn)化為CO2又重新釋放到空氣中；從能量的角度看，每釋放1分子CO2需要損耗6.8分子ATP和3分子NADPH，還產(chǎn)生NH3，由此造成的凈光合效率損失達20%～50%［92-95］?，F(xiàn)已經(jīng)提出了4條替代現(xiàn)有路線的光呼吸支路（表3）：葉綠體甘油酸支路［96］；過氧化物酶體甘油酸支路［98］；葉綠體乙醇酸氧化支路［99］和3-羥基丙酸支路［101］。與生物體內(nèi)的自然過程相比，在ATP需求、還原電位、碳化學(xué)計量或所涉及的細胞數(shù)量方面具有優(yōu)勢［102］。

表3 光呼吸支路的合成生物學(xué)研究匯總Tab.3 Summary of photorespiration pathways by synthetic biological research

在葉綠體甘油酸支路中，將大腸桿菌乙醇酸分解代謝途徑引入擬南芥葉綠體中，獲得了葉綠體乙醇酸直接轉(zhuǎn)化為甘油酸的植物（圖2）。轉(zhuǎn)基因植物生物量大大增加，并含有更多的可溶性糖，這反映了光呼吸的減少和光合作用的增強，說明從光呼吸中轉(zhuǎn)移葉綠體乙醇酸可以通過C3光合作用提高作物的生產(chǎn)力［96］。在亞麻薺中引入了編碼大腸桿菌乙醇酸分解代謝途徑的酶基因，轉(zhuǎn)基因植物減少了光呼吸并增加了光合作用，亞麻薺的產(chǎn)量增加了50%～73%［103］。然而，僅在葉綠體中表達乙醇酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因品系顯示出類似的結(jié)果，即旁路導(dǎo)致生長增強，生物量增加，如將大腸桿菌中的乙醇酸脫氫酶轉(zhuǎn)入到馬鈴薯中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表現(xiàn)出更強的光合作用和更高的塊莖產(chǎn)量［97］，且葡萄糖、果糖等的含量均顯著上升［104］。在擬南芥中也有相似的結(jié)果［105］。此外，與乙醛酸鹽一起孵育可以增加大豆葉肉細胞中的碳同化［106］。但是，在這些轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體中產(chǎn)生的乙醛酸的作用和命運還不是很清楚。

在過氧化物酶體甘油酸支路中，繞過了線粒體中的甘氨酸到絲氨酸的轉(zhuǎn)化，同時將CO2釋放的位置從線粒體裝移到過氧化物酶體，避免了NH3的釋放并保存了還原能力（圖2）。把大腸桿菌中的乙醛酸連接酶和羥基丙酮酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化到煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草雖然理論上回收了75%的乙醇酸，但是只表達一種關(guān)鍵酶時，植物生長發(fā)育受阻［98］。

在葉綠體乙醇酸氧化支路中，2-磷酸乙醇酸轉(zhuǎn)化為乙醇酸，然后直接被氧化成CO2，使光呼吸途徑的碳全部丟失（圖2）。在擬南芥葉綠體中引入完整的乙醇酸分解代謝途徑：乙醇酸氧化酶、蘋果酸合成酶和過氧化氫酶。過氧化氫酶活性強的擬南芥有較高的光合速率［99-100］。理論模型預(yù)測2-磷酸乙醇酸完全氧化時會產(chǎn)生負面影響，生物量積累所必需的碳和氮的損失會降低光合作用和植物生長的效率［107］。葉綠體乙醇酸氧化支路最終歸因于葉綠體中的CCM［108］，因為此支路把CO2全部釋放到葉綠體中，然后通過CO2的同化，來改善光合作用［109］。已在水稻中觀察到葉綠體/基質(zhì)鞘迫使光呼吸的CO2通過基質(zhì)離開細胞，然后重新被Rubisco同化［110-111］。但是在植物中也存在CO2從線粒體到葉綠體的主動通道［112］。因此通過改變光呼吸所產(chǎn)生CO2的重新定位可能不是增加作物碳同化的高效方式。

與上述所有釋放CO2的支路相反，3-羥基丙酸鹽支路通過將2-磷酸乙醇酸先轉(zhuǎn)化為乙醛酸，再經(jīng)過一系列酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸，使光呼吸產(chǎn)物直接返回到碳同化途徑中，即實現(xiàn)光呼吸期間CO2的凈同化（圖2）。在藍藻（S.elongatus）中異源表達綠曲霉（Chloroflexus aurantiacus）和聚磷菌（Accumulibacter phosphatis）中的7種酶，成功實現(xiàn)了3-羥基丙酸鹽旁路，且所有的酶均具有完整的酶活性。但是沒有觀察到藍藻有任何表型的變化，可能是因為其已經(jīng)存在了非常高效的CCM［99］。

此外，根據(jù)藍藻乙醇酸脫羧途徑整合到C3光合途徑的動力學(xué)模型得出，與C3模型相比，藍藻乙醇酸脫羧旁路模型的凈光合速率增加了10%，來自支路細胞間CO2供應(yīng)增加導(dǎo)致PGA增加54.8%，同時減少光呼吸中間體。該研究增強了C3植物中藍藻脫羧途徑的工程，以繞過光呼吸，從而提高光合作用的效率［113］。最近，新的研究中將一種新的光呼吸支路引入水稻葉綠體（圖2）。這種支路的特點是在乙醇酸完全氧化成CO2的過程中不產(chǎn)生還原力，由3種水稻酶（乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶和過氧化氫酶）依次催化。攜帶這3個基因的轉(zhuǎn)基因植物在溫室和田間條件下都表現(xiàn)出光合作用的增強和產(chǎn)量的提高［114］。

圖2 天然和合成的光呼吸支路黑色箭頭，經(jīng)典的光呼吸旁路；藍色箭頭，葉綠體甘油酸支路；橙色箭頭，過氧化物酶體甘油酸支路；綠色箭頭，葉綠體乙醇酸氧化支路；紫色箭頭，3-羥基丙酸鹽支路；紅色箭頭，水稻中新的光呼吸支路RUBP—1，5-二磷酸核酮糖；G2P—2-磷酸甘油酸；3-PGA—3-磷酸甘油酸Fig.2 Natural and synthetic photorespiratory bypassesBlack arrow,classic photorespiratory bypass;Blue arrow,chloroplastic glycerate bypass;Orange arrow,peroxisomal glycerate bypass;Green arrow,chloroplastic glycolate oxidation bypass;Purple arrow,3-hydroxypropionate bypass;Red arrow,A new photorespiratory bypasses in rice RUBP—Ribulose 1,5-bisphosphate;G2P—2-phosphoglyceric acid;3-PGA—3-phosphoglyceric acid

雖然合成光呼吸支路工程能夠在一定程度能夠降低光呼吸，但是也會對植物產(chǎn)生一些不良的后果。例如，在過氧化物酶體甘油酸支路中，光呼吸氮循環(huán)中的一些乙醛酸鹽，從轉(zhuǎn)化為甘氨酸的過程中轉(zhuǎn)移出來，轉(zhuǎn)基因植物在暴露于空氣中時會表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)，如生長緩慢、較低的CO2同化率等［97］。在葉綠體乙醇酸氧化支路中會產(chǎn)生對植物葉綠體有氧化損害的H2O2［98］。鑒于這種限制，歐盟資助的FET開放項目“未來農(nóng)業(yè)”旨在實施有效的光呼吸代謝旁路，旨在通過將酶工程和代謝工程相結(jié)合，以提高許多栽培作物的光合效率，包括水稻、小麥、大豆、棉花和馬鈴薯等［115］。

4 展望

隨著全球人口總量的持續(xù)增長，在2100年為100億～150億人提供糧食是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，面對有限的土地資源，只有采取強有力的措施來提高作物的生產(chǎn)力才能滿足這一任務(wù)。

近年來，利用合成生物學(xué)提高碳同化率已經(jīng)取得一定進展，仍有一些亟待解決的問題，主要是：①Rubisco羧化酶活性的調(diào)節(jié)、Rubisco亞基不能在質(zhì)體中有效折疊或組裝等也是一個復(fù)雜的分子機制，限制著農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用；②CCM的形成是一個復(fù)雜過程，在C3作物中引入C4光合酶，并不能形成CCM。在不含CCM的作物中引入羧酶體，如何實現(xiàn)羧酶體蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達也是一個限制性因素；③合成的光呼吸支路在一定程度上可以降低光呼吸，但是支路中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，如乙醛酸的命運還不是很清楚，需要進一步的探索。

利用合成生物學(xué)對光合作用碳同化進行改造，不僅可以提升作物碳同化效率和生物量，而且還能降低大氣中的CO2濃度，減少溫室效應(yīng)。未來合成生物學(xué)可以在以下方面進行改進，以期提高作物的產(chǎn)量：①尋找高羧化活性的Rubisco酶及高效的C4物種的Rubisco酶；探究Rubisco在葉綠體中的成功折疊、組裝到功能維護等多個復(fù)雜的分子過程，為在作物中高羧化活性Rubisco酶的功能性表達提供基礎(chǔ)。②探究C4作物中CCM形成的機制及藍藻羧酶體多種蛋白質(zhì)的協(xié)同表達，為在C3作物中引入CCM創(chuàng)造條件。③尋找新的光呼吸替代支路，減少光呼吸代謝產(chǎn)物的生成，提升支路釋放出的CO2利用率。④尋找非依賴于卡爾文循環(huán)的CO2同化新途徑。通過對已知酶反應(yīng)的重組設(shè)計，對CO2重新同化，定向轉(zhuǎn)化成人類需要的目的產(chǎn)品［97］。此外，未來合成生物學(xué)還可以在以下方面做進一步的研究：①篩選C3/C4分化的遺傳調(diào)控機制和高光效基因，挖掘調(diào)控C4植物花環(huán)結(jié)構(gòu)以及C4途徑關(guān)鍵酶基因特異性表達的關(guān)鍵調(diào)控因子；②設(shè)計新型光合固碳回路，改造或重組光呼吸支路，重構(gòu)CO2回收再利用支路；③建立基于基因組模塊化編輯改造技術(shù)的精準高效穩(wěn)定的遺傳操作體系，實現(xiàn)高光效功能模塊在植物底盤中的優(yōu)化組裝和適配，提高底盤植物的光合效率。通過合成生物學(xué)方法設(shè)計并重構(gòu)高光效回路，建立新型高效人工植物光合新體系具有非常大的市場前景，對于推動農(nóng)業(yè)以及食品加工業(yè)等經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。