生物固碳：從自然生物到人工合成

肖璐，李寅

（1中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所，廣東，深圳 518055）

近年來(lái)，由于大氣中二氧化碳（CO2）濃度上升所導(dǎo)致的全球氣候變暖引起了全世界的高度關(guān)注。2020年9月，我國(guó)宣布了“二氧化碳排放力爭(zhēng)于2030年前達(dá)到峰值，努力爭(zhēng)取2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和”的目標(biāo)?！疤歼_(dá)峰、碳中和”的“雙碳”目標(biāo)，已經(jīng)成為產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)再升級(jí)和區(qū)域發(fā)展格局再重構(gòu)的重大歷史契機(jī)。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，一方面需要在建筑、工業(yè)、交通、電力、煉油、農(nóng)業(yè)等現(xiàn)有經(jīng)濟(jì)部門布局下做“減法”，調(diào)整能源和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，大規(guī)模減少碳排放，同時(shí)增加碳捕集與封存，如植樹造林等活動(dòng)，盡早實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”。另一方面則應(yīng)在未來(lái)綠色產(chǎn)業(yè)布局方面大力做“加法”，加速擺脫由煤炭、石油和天然氣為主要燃料和原料的傳統(tǒng)能源和工業(yè)體系，快速培育形成低碳、“零”碳排放的工業(yè)技術(shù)體系和產(chǎn)業(yè)布局，推動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)在實(shí)現(xiàn)“碳中和”目標(biāo)下的高速可持續(xù)發(fā)展。

將CO2轉(zhuǎn)化為人類可以利用的有機(jī)物是利用CO2的有效途徑之一。在自然界中，植物和微生物利用自養(yǎng)固碳途徑將CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，每年可固定超過(guò)7×1016g的無(wú)機(jī)碳［1］。通過(guò)合成生物學(xué)和代謝工程的手段對(duì)藍(lán)藻等自養(yǎng)微生物進(jìn)行改造，可以將CO2轉(zhuǎn)化為乙醇、乙酸、丙酮、丁醇、乳酸等化學(xué)品［2-4］。隨著合成生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)生物固碳的相關(guān)研究取得了很大進(jìn)展，已有一些文獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)述。如Gong等［5-6］詳細(xì)介紹了六條天然固碳途徑，并總結(jié)了合成生物學(xué)應(yīng)用于生物固碳研究取得的進(jìn)展；Correa等［7］在天然固碳途徑的基礎(chǔ)上，討論了人工固碳途徑的最新進(jìn)展和嗜熱微生物代謝在生物固碳領(lǐng)域的重要性。本文從天然固碳途徑、人工固碳途徑以及生物固碳途徑的能量供給三個(gè)方面，總結(jié)和介紹人工生物固碳研究的最新進(jìn)展。

1 天然固碳途徑的改造和應(yīng)用

如表1所示，自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)六條天然固碳途徑，分別為卡爾文循環(huán)（Calvin-Benson-Bassham cycle）、還原性TCA循環(huán)（reductive tricarboxylic acid cycle）、WL途徑（Wood-Ljungdahl pathway）、3-羥基丙酸雙循環(huán)（3-hydroxypropionate bi-cycle）、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)（3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle）和二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)（dicarboxylate/4-hydroxybutyrate cycle）［5］。

表1 六種天然固碳途徑的比較Tab.1 Comparison of six natural carbon fixation pathways

卡爾文循環(huán)是最早發(fā)現(xiàn)的生物固碳循環(huán)，也是被研究最多的生物固碳循環(huán)［8］?？栁难h(huán)是自然界中最主要的固碳途徑，地球上超過(guò)90%的碳固定是由卡爾文循環(huán)完成的［1，14］。2016年，Antonovsky等將卡爾文循環(huán)中的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）和磷酸核酮糖激酶（PRK）的基因?qū)氪竽c桿菌中，實(shí)現(xiàn)了卡爾文循環(huán)在異養(yǎng)微生物中的重構(gòu)［15］。近年來(lái)對(duì)卡爾文循環(huán)的應(yīng)用研究也較多。將卡爾文循環(huán)中的Rubisco等酶導(dǎo)入大腸桿菌、酵母等異養(yǎng)菌中，可以減少在發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)品時(shí)放出的CO2，從而提高產(chǎn)物的得率。例如，在大腸桿菌中單獨(dú)或組合表達(dá)卡爾文循環(huán)中的Rubisco和PRK兩個(gè)酶，可將每消耗1 mol阿拉伯糖放出的CO2從0.731 mol減少至0.621 mol［16］；而在釀酒酵母中表達(dá)卡爾文循環(huán)中的Rubisco和PRK，則可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，將乙醇產(chǎn)量提高10%［17］。

對(duì)卡爾文循環(huán)的改造，主要集中在對(duì)Rubisco的改造上［18］。Rubisco是一個(gè)雙功能酶，會(huì)同時(shí)催化底物RuBP與CO2和O2分別發(fā)生羧化反應(yīng)和氧化反應(yīng)，由于O2會(huì)競(jìng)爭(zhēng)該酶的活性中心，從而影響其固碳活性［19-20］。為了提高Rubisco的羧化活性，本研究組前期開發(fā)了一種基于大腸桿菌的活性導(dǎo)向篩選系統(tǒng)，使大腸桿菌的生長(zhǎng)與Rubisco的羧化活性關(guān)聯(lián)起來(lái)。利用該系統(tǒng)對(duì)聚球藻（Synechococcussp.）PCC7002的Rubisco進(jìn)行定向進(jìn)化，得到的突變體對(duì)CO2的比酶活提高了85%［21］。不同來(lái)源的Rubisco在酶學(xué)性質(zhì)上差異較大。藍(lán)藻Rubisco的固碳效率高，但對(duì)CO2/O2的選擇性低；而C3植物中Rubisco的固碳效率低，但對(duì)CO2/O2的選擇性高［18］。在一些研究中，為了解Rubisco的小亞基對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的影響，將不同來(lái)源Rubisco的小亞基與大亞基進(jìn)行組裝，獲得了雜合的Rubisco，可以提高羧化活性或者對(duì)CO2/O2的選擇性［22-23］。Rubisco改造的主要挑戰(zhàn)是Rubisco高羧化活性和對(duì)CO2/O2的高選擇性不能共存，需要對(duì)二者進(jìn)行平衡［19，24］。對(duì)卡爾文循環(huán)進(jìn)行改造，除了改造Rubisco，還可以改造途徑中的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和轉(zhuǎn)酮醇酶等。在藍(lán)藻中過(guò)表達(dá)這三種限速酶可以提高卡爾文循環(huán)的效率，從而提高藍(lán)藻生產(chǎn)化合物的產(chǎn)量［25］。在煙草中過(guò)表達(dá)景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶也可以提高卡爾文循環(huán)的固碳效率，進(jìn)而改善煙草的生長(zhǎng)［26］。

含有WL途徑的微生物可以利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品。一些產(chǎn)乙酸菌中存在WL途徑，所以它們可以利用CO2和CO作為碳源，利用H2作為能量來(lái)源產(chǎn)生乙酰輔酶A，合成乙酸、乙醇、丙酮、丁酸、丁醇和丁二醇等化學(xué)品［27-29］。合成氣的主要成分為CO2、CO和H2，主要來(lái)源于煤、石油、生物質(zhì)和有機(jī)廢物等物質(zhì)的氣化，來(lái)源廣泛且具有能量，是非常具有潛力的生物制造原料［30-31］。對(duì)含有WL途徑的產(chǎn)乙酸菌等微生物進(jìn)行改造，可以使它們能夠?qū)⒑铣蓺飧咝мD(zhuǎn)化為大宗化學(xué)品（表2），并且可以減少CO2和CO等廢氣對(duì)空氣的污染。從表2中可以看出，微生物合成氣發(fā)酵產(chǎn)丙酮、甲醇、乙醇和乙酸等化學(xué)品的產(chǎn)量很高（>40 g/L），其中丙酮的產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)100 g/L［32］。

表2 含有WL途徑的微生物利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品的產(chǎn)量Tab.2 Production of chemicals from syngas fermentation using microorganisms equipped with the WL pathway

3-羥基丙酸雙循環(huán)與3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)的固碳酶相同，都是乙酰輔酶A羧化酶和丙酰輔酶羧化酶，兩條途徑也共有許多中間代謝產(chǎn)物，但是關(guān)于這兩條途徑的酶學(xué)比較研究表明，它們是獨(dú)立進(jìn)化的［40-41］。Liu等［42］通過(guò)定向進(jìn)化對(duì)這兩個(gè)途徑的固碳酶丙酰輔酶A羧化酶進(jìn)行改造，使其羧化活性提高了94倍，實(shí)現(xiàn)了從乙酰輔酶A高效地合成丁二酸。二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)的固碳酶為丙酮酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活較高，因此該途徑的限速酶是丙酮酸合酶。丙酮酸合酶的還原羧化活性很低，且在體外環(huán)境中難以發(fā)生，反應(yīng)所需的外源電子供體電勢(shì)需低于?500 mV，才能有效驅(qū)動(dòng)丙酮酸合酶還原羧化反應(yīng)的發(fā)生［14，43-44］。目前僅有極少數(shù)丙酮酸合酶體外還原羧化反應(yīng)的報(bào)道［45-47］。與丙酮酸合酶相似，α-酮戊二酸合酶催化的羧化反應(yīng)也難以發(fā)生，需要極低電勢(shì)的還原態(tài)鐵氧還蛋白（Ferrodoxin，F(xiàn)d）提供還原力來(lái)推動(dòng)反應(yīng)，這極大地限制了還原性TCA循環(huán)的應(yīng)用。

2 人工固碳途徑的研究進(jìn)展

天然固碳途徑存在一些缺陷，如固碳酶活性低導(dǎo)致途徑的固碳效率較低；需要經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)，對(duì)固碳效率有較大影響；有些天然固碳途徑的固碳酶比較復(fù)雜且難以異源表達(dá)等。這些問(wèn)題影響了天然固碳途徑的應(yīng)用。近年來(lái)，在合成生物學(xué)思想指導(dǎo)下，人工固碳途徑得到廣泛重視。相關(guān)研究主要包括兩個(gè)方面：一是利用天然固碳途徑中的固碳酶重新設(shè)計(jì)新的人工固碳途徑；二是尋找新的高效固碳酶設(shè)計(jì)新的人工固碳途徑。

2.1 利用天然固碳途徑中的固碳酶重新設(shè)計(jì)途徑

天然固碳途徑一般比較長(zhǎng)并且其中的固碳酶大多比較復(fù)雜，但也有一些固碳酶的活性很高，且結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶等。一些研究者利用這些簡(jiǎn)單且活性高的固碳酶重新設(shè)計(jì)固碳途徑，希望可以減少反應(yīng)步驟，提高固碳效率。2010年，Bar-Even等利用自然界中已知的約5000種酶，計(jì)算設(shè)計(jì)了一系列人工固碳途徑，對(duì)天然固碳途徑和這些人工固碳途徑進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)高固碳效率的途徑都具有比較相似的核心結(jié)構(gòu)，他們將這一結(jié)構(gòu)稱為丙二酰輔酶A-草酰乙酸-乙醛酸（MOG）途徑，其固碳效率比卡爾文循環(huán)高2～3倍［48］。作者使用MOG途徑設(shè)計(jì)的C4-乙醛酸循環(huán)，理論上可以將C4植物中草酰乙酸被還原為蘋果酸再脫羧生成丙酮酸時(shí)釋放的CO2轉(zhuǎn)化為乙醛酸，提高整體固碳效率。雖然到目前為止，C4-乙醛酸循環(huán)還沒(méi)有在體外或微生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，但是可以為后續(xù)設(shè)計(jì)人工固碳途徑提供新思路。

卡爾文循環(huán)不能直接生成2C產(chǎn)物，而需要先生成3C產(chǎn)物，再釋放一個(gè)CO2生成乙酰輔酶A，從而造成碳損失。2018年，Yu等針對(duì)這一問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一條丙二酰輔酶A-甘油（MCG）途徑［圖1（a）］來(lái)增強(qiáng)卡爾文循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)卡爾文循環(huán)到乙酰輔酶A的高效合成［49］。Yu等在體外和大腸桿菌體內(nèi)都證明了MCG途徑的功能，并且將MCG途徑導(dǎo)入聚球藻（Synechococcus elongates）中，證明了它可以增加聚球藻細(xì)胞中乙酰輔酶A的濃度，且碳酸氫鹽的同化作用也增強(qiáng)了2倍左右。已有的天然和人工固碳途徑通常包含了多個(gè)反應(yīng)，大多超過(guò)10個(gè)反應(yīng)。通常，固碳途徑中的反應(yīng)步驟越多，整體的固碳效率就會(huì)越低。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，作者設(shè)計(jì)了一條最小化的人工合成固碳途徑——POAP循環(huán)［50］［圖1（b）］。POAP循環(huán)是一個(gè)只包含四步反應(yīng)的最簡(jiǎn)酶促碳固定循環(huán)，通過(guò)丙酮酸合酶和丙酮酸羧化酶兩步反應(yīng)進(jìn)行固碳。丙酮酸合酶是POAP循環(huán)中最關(guān)鍵也最難實(shí)現(xiàn)羧化功能的酶，需要非常低電勢(shì)的電子供體來(lái)驅(qū)動(dòng)反應(yīng)［46］。前已述及，在生物體內(nèi)驅(qū)動(dòng)這個(gè)反應(yīng)的天然電子供體一般是Fd［51］。通過(guò)篩選一系列低電勢(shì)的Fd，作者實(shí)現(xiàn)了丙酮酸合酶的還原羧化反應(yīng)，在體外構(gòu)建了POAP循環(huán)并實(shí)現(xiàn)了固碳功能，固碳速率達(dá)到8 nmol CO2/（min·mg固碳酶）。與已發(fā)現(xiàn)的天然固碳途徑和人工固碳途徑相比，POAP循環(huán)固定1分子CO2只需要消耗1分子ATP和0.5分子還原力，具有較高的能量效率。由于丙酮酸合酶是高溫厭氧酶［52］，所以POAP循環(huán)可以在厭氧和相對(duì)較高溫度（50℃）下進(jìn)行CO2固定，為了解和研究遠(yuǎn)古生物中CO2的固定提供一個(gè)可供選擇的模型。

2.2 尋找新的高效固碳酶用于人工固碳途徑

除了天然固碳途徑中的固碳酶外，自然界中可以用于固碳的羧化酶非常多，其中有一些羧化酶活性非常高。利用這些羧化酶設(shè)計(jì)全新的固碳途徑，可以顯著提高固碳效率。2016年，Schwander等成功在體外構(gòu)建了一條以CO2為底物從頭合成終產(chǎn)物乙醛酸的固碳循環(huán)——CETCH循環(huán)［53］［圖1（c）］。CETCH循環(huán)的核心固碳酶是巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶，該酶的比酶活可以達(dá)到110 U/mg，是迄今為止固碳活性最高的羧化酶，但這個(gè)酶在進(jìn)化過(guò)程中并沒(méi)有用于自養(yǎng)固碳途徑［57-58］。CETCH循環(huán)僅利用巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶作為固碳酶，途徑的固碳效率就達(dá)到了5 nmol CO2/（min·mg核心酶）。CETCH循環(huán)是第1條非天然人工固碳途徑，其在體外實(shí)現(xiàn)固碳功能，為創(chuàng)建人工固碳途徑開辟了新的道路［59］。2021年，人工生物固碳領(lǐng)域在CETCH循環(huán)之后又迎來(lái)了重大突破。淀粉是具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要碳水化合物，而合成人造淀粉是一個(gè)較大的挑戰(zhàn)。Cai等設(shè)計(jì)了一條ASAP途徑［圖1（d）］，利用化學(xué)-生物無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)以CO2和H2為原料合成淀粉［54］。ASAP途徑在H2驅(qū)動(dòng)下將CO2轉(zhuǎn)化為淀粉的速率可以達(dá)到22 nmol C/（min·mg總催化劑），比玉米中的淀粉合成速率高約8.5倍，為淀粉合成走出農(nóng)業(yè)路線開辟了新的道路。

除了設(shè)計(jì)利用CO2的人工固碳途徑外，因?yàn)镃O2可以高效地轉(zhuǎn)化為一碳化合物［60］，所以通過(guò)利用一碳化合物也可以實(shí)現(xiàn)固碳。CO2直接電化學(xué)還原可以產(chǎn)生甲酸，能量效率大于40%［61］；CO2加氫可以生成甲醇，這個(gè)過(guò)程的能量效率可以達(dá)到50%以上［62］。Lu等設(shè)計(jì)和構(gòu)建了從甲醛到乙酰輔酶A的全新途徑（SACA途徑）［圖1（e）］，可以利用甲醛生成乙酰輔酶A［55］，體外構(gòu)建的SACA途徑對(duì)甲醛的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了50%。這條途徑是乙酰輔酶A生物合成途徑中最短的途徑，并且不依賴于ATP，為未來(lái)從一碳化合物生產(chǎn)乙酰輔酶A及其衍生化學(xué)品提供了可能性，具有很大的應(yīng)用潛力。

SACA途徑的第一步和第二步的酶分別是乙醇醛合酶和磷酸酮醇酶，順序催化兩個(gè)甲醇分子縮合為一個(gè)乙醇醛及將乙醇醛轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸。這兩個(gè)酶都是通過(guò)人工設(shè)計(jì)得到，然后應(yīng)用于人工固碳途徑中。在人工固碳途徑中，酶是核心，為了提高酶的活性、選擇性等，對(duì)這些酶進(jìn)行計(jì)算設(shè)計(jì)和改造具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。Siegel等［56］通過(guò)計(jì)算設(shè)計(jì)獲得了一種甲醛酶，能夠催化3個(gè)甲醛分子生成1個(gè)二羥丙酮分子，實(shí)現(xiàn)一碳化合物向三碳化合物的轉(zhuǎn)變。作者利用所獲得的甲醛酶，設(shè)計(jì)了一條固碳途徑并命名為甲醛酶途徑［圖1（f）］，該途徑通過(guò)五步反應(yīng)可將CO2轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮，表明新酶設(shè)計(jì)可以促進(jìn)構(gòu)建全新的人工固碳途徑。

圖1 代表性的人工固碳途徑Fig.1 Representative synthetic carbon fixation pathways

2.3 人工固碳途徑的討論

從第一條人工固碳途徑CETCH循環(huán)到CO2合成淀粉的ASAP途徑，近年人工固碳途徑的研究取得了突破性進(jìn)展。這些人工固碳途徑總體可以分為兩類（表3）：一類是需要添加共底物輔助固碳的途徑，如已經(jīng)在體內(nèi)成功構(gòu)建和應(yīng)用的MCG途徑，需要磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作為共底物；另一類是可以利用CO2從頭合成有機(jī)物的途徑，如CETCH循環(huán)、POAP循環(huán)和ASAP途徑。從固碳效率來(lái)說(shuō)，這些人工合成固碳途徑已經(jīng)超過(guò)天然的卡爾文循環(huán)［2.58 nmol C/（min·mg總酶量）］［54］，其中ASAP途 徑固碳速率最高，淀粉合成速率可以達(dá)到22 nmol C/（min·mg總酶量）。從反應(yīng)數(shù)來(lái)看，SACA途徑由于以乙醛作為底物合成乙酰輔酶A，只需要3步反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)；在以CO2為原料從頭合成產(chǎn)物的途徑中，POAP循環(huán)只需要4步反應(yīng)，是目前最短、最簡(jiǎn)單的固碳途徑。從能量消耗來(lái)說(shuō)，人工固碳途徑普遍低于天然固碳途徑，如CETCH循環(huán)和POAP循環(huán)固定酶分子CO2只需要1分子ATP和0.5/1分子還原力。這與固碳途徑的產(chǎn)物有關(guān)，CETCH循環(huán)和POAP循環(huán)的產(chǎn)物乙醛酸和草酸的氧化程度較高，因此需要的能量輸入較少。

表3 人工固碳途徑的比較Tab.3 Comparison of artificial carbon fixation pathways

除了這些人工固碳途徑外，在改造大腸桿菌實(shí)現(xiàn)基于一碳化合物的半自養(yǎng)生長(zhǎng)方面，相關(guān)研究也取得了很大的進(jìn)展。如Gleizer等［63］在大腸桿菌中表達(dá)Rubisco和磷酸核糖激酶，使大腸桿菌能夠固定CO2合成生物質(zhì)。在該菌中共表達(dá)甲酸脫氫酶，再經(jīng)過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化后，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌利用甲酸作為碳源和能源進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)。Chen等［64］和Chen等［65］敲除了大腸桿菌磷酸戊糖途徑中的戊糖利用必需基因，然后表達(dá)了核酮糖-單磷酸（RuMP）途徑中的相關(guān)酶，構(gòu)建了一株“合成甲醇營(yíng)養(yǎng)缺陷”菌株，該菌株只有在甲醇存在時(shí)才能利用木糖或核糖生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)“合成甲醇營(yíng)養(yǎng)缺陷”菌株的代謝進(jìn)行重新編程和適應(yīng)性進(jìn)化，最終得到了能以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)的大腸桿菌。

3 生物固碳途徑的能量來(lái)源

生物的營(yíng)養(yǎng)方式一般分為自養(yǎng)和異養(yǎng)。異養(yǎng)微生物通過(guò)有機(jī)物提供碳源和能量，而自養(yǎng)微生物利用無(wú)機(jī)碳作為碳源，通過(guò)固碳途徑將無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)碳所需的能量一般來(lái)源于光能或無(wú)機(jī)物氧化。化能自養(yǎng)型微生物的能量一般來(lái)源于硫化合物、氫氣、金屬和氨等物質(zhì)的氧化［66-67］，在這一生命過(guò)程中能量主要是通過(guò)兩種形式被消耗，即還原力和ATP。

3.1 固碳途徑的還原力來(lái)源

CO2的固定需要攝入還原力。CO2中的碳是+4價(jià)，是碳的最高價(jià)態(tài)，而在有機(jī)物中碳是低價(jià)態(tài)的，所以需要還原力將CO2中高價(jià)態(tài)的碳還原為有機(jī)物中低價(jià)態(tài)的碳。在固碳途徑中還原力的表現(xiàn)形式主要有：NAD（P）H和還原態(tài)Fd等，如還原性TCA循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶利用NAD（P）H中的還原力來(lái)固定CO2，而二羧酸/4-羥基丁酸中丙酮酸合酶固定CO2需要還原態(tài)的Fd提供還原力。

天然固碳途徑一般存在于自養(yǎng)生物中，固碳途徑所需的還原力一般來(lái)源于光能和化學(xué)能。在光合自養(yǎng)生物中，還原力來(lái)源于光合作用［68］。光反應(yīng)過(guò)程中生成的NADPH和還原態(tài)的Fd可以作為還原力用于固碳途徑［69］。而在化能自養(yǎng)生物中，還原力一般來(lái)源于硫化合物、H2、CO等物質(zhì)的氧化［70］。例如一些微生物體內(nèi)的氫酶可以吸收H2，放出電子傳遞給NADP+和氧化態(tài)的Fd，從而生成NADH和還原態(tài)的Fd［71］，然后通過(guò)體內(nèi)的一些轉(zhuǎn)氫酶將電子傳遞給NADP+生成NADPH，從而用于固碳途徑［72，73］。一些極端環(huán)境微生物體內(nèi)的異化亞硫酸鹽還原酶和硫酸腺苷還原酶等，可以催化含硫化合物氧化并放出電子，從而生成NAD（P）H和還原態(tài)Fd，驅(qū)動(dòng)固碳反應(yīng)［74，75］。

近年來(lái)，也有一些研究將天然固碳途徑或者人工固碳途徑導(dǎo)入異養(yǎng)微生物中，使它們能夠利用有機(jī)物中的能量來(lái)固定CO2供給微生物生長(zhǎng)或生產(chǎn)化學(xué)品，如前文中提到的在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建MCG途徑并進(jìn)行固碳［49］。異養(yǎng)微生物中的能量來(lái)源于有機(jī)物，還原力的來(lái)源主要是有機(jī)物氧化釋放出電子，電子傳遞到NAD（P）+和氧化態(tài)的Fd等電子受體中，從而生成NAD（P）H和還原態(tài)Fd。所以，對(duì)微生物體內(nèi)還原力的研究也可以應(yīng)用于微生物體內(nèi)固碳途徑，從而提高固碳能力。在光合微生物中，NADPH是光合作用產(chǎn)生還原力的主要形式，但大多數(shù)脫氫酶更偏向于利用NADH作為還原力，若還原力的需求和供給耦合效率不高，就會(huì)造成光合微生物還原力的浪費(fèi)。針對(duì)這一問(wèn)題，本研究組將電子傳遞蛋白OmcS引入到聚球藻（Synechococcus elongatusUTEX 2973）中，證明了OmcS可以將多余的電子從質(zhì)體醌（PQ）傳遞至光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）中，從而推動(dòng)循環(huán)電子轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞內(nèi)的NADH濃度增加了60%，乳酸產(chǎn)量增加了4倍，生物量增加了60%，改善了藍(lán)藻中光合作用的NADH/NADPH輔因子不平衡問(wèn)題［76］。在另外一些研究中，也通過(guò)在微生物中引入催化NAD（P）H再生的酶來(lái)提高體內(nèi)NAD（P）H水平。Wang等在克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中引入NAD+依賴的甲酸脫氫酶、吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和葡萄糖脫氫酶等催化NADH再生的酶，使胞內(nèi)NADH/NAD+比例增加了78%～135%［77］。Xu等在大腸桿菌中引入巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）來(lái)源的兩個(gè)葡萄糖脫氫酶，使大腸桿菌胞內(nèi)的葡萄糖脫氫酶活性增強(qiáng)了近10倍。葡萄糖脫氫酶可以催化葡萄糖發(fā)生脫氫反應(yīng)生成NADPH，所以這一策略使NADPH在體內(nèi)和體外都能有效再生［78］。

還原態(tài)Fd也是還原力的一種表現(xiàn)形式。Fd是一類分子量很小的可溶性鐵硫蛋白，是一種重要的電子載體，可為眾多的反應(yīng)提供還原力［79］。Fd可以根據(jù)鐵原子氧化態(tài)的變化來(lái)接受或者釋放電子。Fd的氧化還原電位通常低于?200 mV，在專性厭氧微生物中可以低至?500 mV以下［80-81］，因此Fd不僅在各種代謝過(guò)程中充當(dāng)電子載體，在一些需要低電勢(shì)驅(qū)動(dòng)的氧化還原反應(yīng)中也具有重要作用［82-83］。在天然固碳途徑中，α-酮戊二酸合酶和丙酮酸合酶等酶催化的反應(yīng)需要很低的電勢(shì)（低于-500 mV）［44］，這些反應(yīng)都需要還原態(tài)Fd的參與。在近年的研究中，厭氧微生物來(lái)源的［4Fe-4S］等低電勢(shì)Fd已經(jīng)可以通過(guò)異源表達(dá)純化，并在大腸桿菌體內(nèi)和體外發(fā)揮作用［84-85］。

3.2 固碳途徑中的ATP來(lái)源

ATP是一種高能磷酸化合物，水解時(shí)能夠釋放出大量的自由能。細(xì)胞中多種代謝反應(yīng)都需要ATP的參與，每條固碳途徑都需要消耗ATP。ATP在胞內(nèi)的生成主要是通過(guò)兩種方式：一種是底物水平磷酸化；一種是ATP合酶利用膜內(nèi)外質(zhì)子梯度來(lái)合成ATP，包括氧化磷酸化和光合磷酸化等。

生物固碳途徑需要固定CO2并將其還原為有機(jī)物，這些反應(yīng)通常在熱力學(xué)上是不利的，所以固碳途徑需要ATP攝入，ATP水解釋放的大量自由能可以為這些反應(yīng)提供能量［86-87］。提高ATP的水平對(duì)固碳途徑具有推動(dòng)作用，相關(guān)研究主要包括提高底物水平磷酸化酶表達(dá)、增強(qiáng)電子傳遞鏈和質(zhì)子梯度以及提高ATP合酶的活性等方面［88］。

在微生物體內(nèi)提高催化底物水平磷酸化反應(yīng)的酶表達(dá)水平和活性可以提高胞內(nèi)的ATP水平，從而提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量。例如，在大腸桿菌中提高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因表達(dá)水平和活性，可以增強(qiáng)CO2的固定并增加ATP產(chǎn)量［89］。ATP合成主要是通過(guò)電子傳遞鏈傳遞電子形成的質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)，所以電子傳遞鏈和質(zhì)子梯度的強(qiáng)度對(duì)ATP合成有很大影響。pH值對(duì)質(zhì)子梯度的影響很大，酸性條件有利于質(zhì)子梯度的產(chǎn)生。例如，在酸性條件下，出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）和白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）的胞內(nèi)ATP水平都有明顯提高［90-91］。ATP合酶是生成ATP的關(guān)鍵酶，提高胞內(nèi)ATP水平最直接的方法是對(duì)ATP合酶進(jìn)行改造和過(guò)量表達(dá)，以提高ATP合酶活性。雖然ATP合酶非常復(fù)雜，但是在一些研究中，過(guò)表達(dá)體內(nèi)ATP合酶，對(duì)提高胞內(nèi)ATP水平也有一定的效果。Xu等通過(guò)在念珠菌（Candida utilis）中表達(dá)來(lái)自擬南芥的ATP合酶基因，增強(qiáng)了ATP再生和胞內(nèi)ATP供應(yīng)［92］。此外，在酵母和擬南芥中過(guò)表達(dá)擬南芥來(lái)源的ATP合酶，都能提高ATP合成水平［93］。

3.3 非生物能驅(qū)動(dòng)的固碳途徑研究進(jìn)展

還原力和ATP是生物固碳途徑的直接能量來(lái)源，而光能和有機(jī)物、硫化物、H2等化學(xué)能可以轉(zhuǎn)化為還原力和ATP，從而間接為生物固碳途徑提供能量。近年來(lái)，一些研究者們嘗試在固碳途徑中直接引入化學(xué)能、光能以及電能等能量形式，使生物固碳與化學(xué)催化、光催化和電催化等相結(jié)合。由于熱力學(xué)限制，CO2的還原不能自發(fā)進(jìn)行，需要外部能量來(lái)驅(qū)動(dòng)，這些能量形式為CO2的還原提供了更強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)力，而將它們與生物固碳結(jié)合可以將CO2轉(zhuǎn)化為更高價(jià)值的C2+產(chǎn)品［94］。如前文提到的ASAP途徑中，Cai等在途徑的第一步利用ZnO-ZrO2催化劑催化令CO2和氫氣生成甲醇，催化甲醇生成速率達(dá)到0.25 g/（h·g催化劑），甲醇再經(jīng)過(guò)一系列的酶催化合成淀粉［54］。

光催化CO2的還原類似于自然界的光合作用，植物和光合微生物通過(guò)吸收光能將CO2和H2O轉(zhuǎn)化為有機(jī)物的過(guò)程，這一過(guò)程的能量來(lái)源是光能。而光催化CO2的還原可以看做是人工光合作用，其中的光催化劑是半導(dǎo)體或者染料。光催化CO2的還原反應(yīng)條件非常溫和，可與生物固碳相結(jié)合，將半導(dǎo)體光催化納米材料與微生物形成雜化體系，即半人 工光合作 用系統(tǒng)［95］。Sakimoto等［96］和Zhang等［97］用硫化鎘納米材料CdS和金納米材料AuNCs誘導(dǎo)非光合細(xì)菌Moorella thermoacetica自光敏化，從而利用光能將CO2還原為乙酸。在模擬日光下，量子產(chǎn)率分別達(dá)到了2.44%±0.62%和2.86%±0.38%，前者在435～485 nm LED燈下量子產(chǎn)率達(dá)到52%±17%的極高水平。Wang等［98］將硫化鎘（CdS）納米顆粒覆在光合細(xì)菌Rhodopseudomonas palustris表面。在可見光作用下，R.palustris的生物質(zhì)、類胡蘿卜素和聚-β-羥基丁酸酯（PHB）的產(chǎn)量分別增加到148%、122%和147%，并且光合效率從原來(lái)的4.31%提高到5.98%，這表明CdS納米顆粒在電子產(chǎn)生和傳導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。

CO2電化學(xué)還原就是一個(gè)利用電能將CO2在電解池中還原的過(guò)程。通過(guò)將電能引入到酶催化反應(yīng)中可以實(shí)現(xiàn)生物固碳，如甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶等催化的固碳反應(yīng)［99］。Reisner團(tuán)隊(duì)［100］將甲酸脫氫酶與金屬氧化物TiO2偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)高效電催化CO2還原為甲酸，轉(zhuǎn)換數(shù)達(dá)到（11±1）s-1，是Rubisco轉(zhuǎn)換數(shù)的近10倍。還有一些微生物可以耐受低電壓，并利用電子作為能量來(lái)源，利用這些微生物可以開發(fā)用于CO2還原的微生物電催化，如Methanococcus maripaludis、Methanolacinia petroleumearia、Methanobacterium congolense等產(chǎn)甲烷菌。Schlager等［101］利用產(chǎn)甲烷菌制造微生物電解池，以CO2作為唯一碳源，利用電能生產(chǎn)甲烷，生產(chǎn)率達(dá)到了22%。

4 生物固碳面臨的問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)

目前，大多數(shù)研究集中在利用天然固碳途徑來(lái)固定CO2生產(chǎn)化學(xué)品，或?qū)μ烊还烫纪緩竭M(jìn)行改造來(lái)提高它們的固碳效率。其中，考慮到Rubisco是自然界中分布最廣泛的固碳酶，與所有植物的生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)息息相關(guān)［102］，因此關(guān)于Rubisco改造和卡爾文循環(huán)應(yīng)用的研究較多。自然界中可能還存在未被發(fā)現(xiàn)的天然固碳途徑，挖掘新的、高效的天然固碳途徑并實(shí)現(xiàn)應(yīng)用，是生物固碳的一個(gè)重要方向。從設(shè)計(jì)新的高效人工固碳途徑角度，固碳酶的選擇和設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。天然固碳途徑中一些酶活性很高，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶等。除了這些酶外，大自然中可以固碳的羧化酶非常多，其中有一些酶活性很高，但是在生物進(jìn)化的過(guò)程中卻并沒(méi)有用于固碳途徑中。以這些高活性的羧化酶為基礎(chǔ)，有可能設(shè)計(jì)出更高效的人工合成固碳途徑，提高固碳途徑的效率。因此，挖掘或設(shè)計(jì)新型、高效固碳酶，并用于人工固碳途徑的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，也是一個(gè)重要的方向。

對(duì)CO2固定的研究除了設(shè)計(jì)人工固碳途徑外，另一個(gè)重要的因素就是能量，而目前對(duì)于CO2固定的能量研究較少。很多自養(yǎng)微生物可以利用光能和H2、硫化物等無(wú)機(jī)化學(xué)能進(jìn)行固碳［74］。對(duì)這些自養(yǎng)微生物進(jìn)行工程改造，使它們能夠生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)品，是一個(gè)重要的努力方向。但是自養(yǎng)微生物一般生長(zhǎng)比較慢，生產(chǎn)化學(xué)品的產(chǎn)量較低，一般難以滿足工業(yè)化的需求。因此，將自養(yǎng)微生物的固碳途徑導(dǎo)入異養(yǎng)微生物中進(jìn)行異養(yǎng)固碳也是目前的一個(gè)熱點(diǎn)。大腸桿菌的遺傳背景清晰、遺傳操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快，是異養(yǎng)固碳生產(chǎn)化學(xué)品非常合適的宿主。另外，也可以考慮引入新的能量利用途徑以及新的能量形式進(jìn)行生物固碳研究。對(duì)光能的利用不僅可以通過(guò)光合作用，也可以通過(guò)一些非典型光合系統(tǒng)，例如視紫紅質(zhì)和一些可以吸收光能的生物材料等。近年來(lái)，電化學(xué)研究的發(fā)展也為利用電能進(jìn)行生物固碳提供了可能性，未來(lái)生物電能利用系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建在生物固碳應(yīng)用方面，還有很大的想象和發(fā)展空間。

合成生物學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展為生物固碳研究提供了多種方向和可能性。研究者們對(duì)自養(yǎng)生物、固碳途徑、固碳酶和能量的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用越來(lái)越豐富。但是由于CO2是高度氧化的產(chǎn)物，電子輸入CO2的速度決定了CO2還原的速度。未來(lái)，生物-化學(xué)相組合的技術(shù)體系，或許會(huì)成為廉價(jià)、高效CO2還原和固定轉(zhuǎn)化的核心方向。