基于ICAM-5 mRNA表達(dá)探討針刺治療缺血性中風(fēng)大鼠的作用機(jī)制研究

沈亞亭,謝西梅△,白 秀,白 樺,常小凡,唐園園,李秋宇

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710014；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)

腦卒中是全球范圍內(nèi)繼癌癥后導(dǎo)致成年人死亡的第二大病因，同時(shí)也是導(dǎo)致成年人傷殘的主要原因，其中高達(dá)87%的全球卒中歸因于缺血性卒中，嚴(yán)重危害人類健康[1-2]。缺血性中風(fēng)的病理生理學(xué)極其復(fù)雜，涉及多個(gè)過程，其發(fā)生是由于腦部血液供應(yīng)障礙，腦血流量降至臨界水平以下，導(dǎo)致氧氣和葡萄糖的輸送不足，從而觸發(fā)急性中風(fēng)后的一系列病理生理事件，主要包括能量衰竭、興奮性毒性、血腦屏障破壞、炎癥和細(xì)胞凋亡等，最終導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元死亡[3-5]。

研究表明[6-7]，針刺是中醫(yī)治療缺血性中風(fēng)的有效手段，有良好的抗氧化應(yīng)激和腦保護(hù)作用，可挽救缺血半暗帶周圍將要壞死的神經(jīng)元及促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，其主要通過改善大腦缺血區(qū)域的血流、抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程、促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)形成和細(xì)胞增殖以及抗細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮療效。研究已證實(shí)針刺對(duì)腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)ICAM-5也被發(fā)現(xiàn)廣泛參與了腦卒中的病理生理過程[8-9]。因此，本研究以缺血性中風(fēng)大鼠為研究載體，選用經(jīng)典大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注損傷(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，觀察針刺對(duì)缺血性中風(fēng)后腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和神經(jīng)元凋亡及ICAM-5 mRNA表達(dá)的影響，探討針刺治療缺血性卒中的作用機(jī)制，為臨床及研究工作者提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±30) g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜)2018-001。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心動(dòng)物房，保持溫度23～25 ℃，濕度60%～65%，所有操作均嚴(yán)格按照中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑及儀器 HE染色液(珠海貝索BASO BA4025)，TUNEL、DAPI染色液(AR1177)、Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒-FITC(MK1018),TBS緩沖液(AR0031),抗熒光淬滅PVP封片液(AR0036),以上試劑均購于博士德生物;PCR，Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó)，15596018);Loading buffer(上海威奧生物科技有限公司,WH1192)；第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen，美國(guó)，K1622)；qRT-PCR引物(QIAGEN，德國(guó)，208052)；恒溫箱(日本三洋，日本，MIR-262)；熒光顯微鏡光鏡(日本奧林巴斯，日本，BX51)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(ThermoFisher，美國(guó)，Mutiskan GO)；梯度PCR儀(ThermoFisher，美國(guó)，Veriti DX);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，GIS-1600)；熒光定量PCR儀(Roche，瑞士，Roche480Ⅱ Real Time PCR System)。

1.2 方法

1.2.1 缺血性腦卒中模型制備與評(píng)價(jià) 采用改良后大腦中動(dòng)脈線栓法制備缺血性腦卒中模型[10]，具體方法：用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿頸部前正中線切開皮膚，并鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，在靠近頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，隨后在距離頸總動(dòng)脈近分叉處剪一“V”形小口，將線栓從小口插入，松開動(dòng)脈夾，緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，直至距離頸總動(dòng)脈分叉處約(18.0±0.5)mm左右感到阻力時(shí)，停止進(jìn)栓，缺血1 h后拔掉線栓，縫合頸部傷口。造模后的動(dòng)物在自然蘇醒后，參照 Zea-Longa[11]的5級(jí)4分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其神經(jīng)障礙進(jìn)行評(píng)分。0級(jí)(0分)無神經(jīng)功能喪失；1級(jí)(1分)對(duì)側(cè)前肢不能充分伸展；2級(jí)(2分)向?qū)?cè)環(huán)行運(yùn)動(dòng)，輕度局灶神經(jīng)功能喪失；3級(jí)(3分)向偏癱側(cè)傾倒，中度局灶神經(jīng)功能喪失；4級(jí)(4分)不能自然行走，意識(shí)喪失。模型成功的標(biāo)志為實(shí)驗(yàn)大鼠蘇醒后Longa評(píng)分為1～3分并且無蛛網(wǎng)膜下腔出血。見圖1。

圖1 造模后大鼠圖片

1.2.2 針刺治療方法與分組 共募集92只大鼠，手術(shù)期間或之后死亡及造模不成功的大鼠共12只，余按照區(qū)組隨機(jī)化法，分為正常組(A組n=10)、假手術(shù)組(B組n=24)、MCAO模型組(C組n=23)與MCAO模型+針刺組(D組n=23)。A組:正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)；B組:僅將頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈游離出來，不做結(jié)扎、插線處理，余操作同C組；C組:采用改良后大腦中動(dòng)脈線栓法，制備缺血性腦卒中模型；D組:造模成功基礎(chǔ)上，給予針刺治療。選穴定位及操作參照華興邦等[12]研制的大鼠穴位圖譜，取“百會(huì)”“風(fēng)池”“曲池”“合谷”“足三里”“陰陵泉”與“三陰交”穴，針刺操作均由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的針灸醫(yī)師完成,針灸針選用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的一次性無菌華佗牌針灸針，規(guī)格：￠0.40 mm×13 mm，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB2024-1994；操作方法：穴位常規(guī)消毒后，百會(huì)穴，15 °角向后斜刺進(jìn)針2 mm；雙側(cè)風(fēng)池穴斜刺5 mm；余穴均直刺5～7 mm。均采用平補(bǔ)平瀉針法，1次/d，每次留針30 min，15 min行針1次，造模成功后第2天開始治療，5 d為1個(gè)療程，1個(gè)療程后休息2 d再進(jìn)行下1個(gè)療程，共進(jìn)行2個(gè)療程。非針刺組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，直至D組規(guī)定的針刺療程結(jié)束。見圖2。

圖2 治療中大鼠圖片

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo) HE染色:將大鼠經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛溶液，約100 mL，大鼠四肢肌肉抽搐、強(qiáng)直后取大腦皮層缺血半暗帶組織，將其在4%多聚甲醛中固定過夜，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度8 μm)。采用石蠟切片，脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ，各20 min；無水乙醇Ⅰ、Ⅱ，75%的酒精，各5 min；自來水沖洗后烘干。蘇木素浸染3 min，水洗后鹽酸酒精分化液分化2 s，水洗后烘干。伊紅染色浸染1 s，水洗3 s后100%酒精脫水2 s。最后用中性樹膠封片。普通光學(xué)顯微鏡下，觀察梗死灶情況并拍照。

TUNEL染色:取腦組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，標(biāo)本片上滴加新鮮稀釋的Proteinase K室溫消化10 min,0.01 M TBS洗5 min×3次；標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)以保持切片濕潤(rùn)。置于樣品濕盒中，37 ℃標(biāo)記2 h，0.01 M TBS洗5 min×3次；滴加封閉液，37 ℃孵育30 min,甩掉封閉液，不洗；用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后加至標(biāo)本片上。置于樣品濕盒中，37 ℃標(biāo)記2 h，0.01 M TBS洗5 min×3次；用抗體稀釋液1∶100稀釋SABC-FITC,混勻后加至切片上，37 ℃反應(yīng)30 min,0.01 M TBS洗5 min×4次;DAPI染色液室溫染色3 min，蒸餾水洗?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?。由對(duì)分組不知情的研究人員使用400倍熒光顯微鏡在每個(gè)切片中隨機(jī)觀察2～3個(gè)不同視野。

實(shí)時(shí)定量PCR:按照TRIZOL試劑說明書提取總RNA,采用First Strand cDNA synthesis Kit(Invitrogen K1622)反轉(zhuǎn)錄試劑盒冰上加樣。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增ICAM-5,正義:5′-ctcatccgaactttccagcg-3′;反義：5′-caaggtcaatgtgaggctcg-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度135 bp。內(nèi)參照β-actin引物序列,正義:5′-ctaaggccaaccgtgaaaag-3′;反義：5′-tacatggctggggtgttga-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度64 bp。PCR擴(kuò)增使用了10 μL反應(yīng)體系(包含1.5 μL H2O 、5 μL 2×SYBGEEN PCR mix、1 μL Primer和2.5 μL cDNA),反應(yīng)條件為：變性95 ℃,2 min,退火95 ℃,5 s,延伸60 ℃,10 s,反應(yīng)進(jìn)行45個(gè)循環(huán),PCR反應(yīng)結(jié)束后,將PCR反應(yīng)液從60 ℃緩慢升溫到95 ℃,以獲取溶解曲線。ICAM-5的轉(zhuǎn)錄水平通過循環(huán)閾值(Ct)方法定量，并通過與β-actin的比值將結(jié)果歸一化。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及神經(jīng)元凋亡的影響

2.1.1 HE染色結(jié)果 高倍鏡(200×)下A組和B組均可見大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞排列及形態(tài)正常，胞膜完整，胞質(zhì)豐富，核仁清楚；與A組相比，C組腦組織可見明顯的缺血及梗死灶，大鼠腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞間隙增大，胞體腫脹變形，排列紊亂，核仁變淺或缺失，呈明顯的病理學(xué)改變；與C組比較，D組缺血區(qū)正常與壞死細(xì)胞相間存在，細(xì)胞輪廓較清晰，僅出現(xiàn)少量細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)有顯著改善。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織神經(jīng)元HE染色(200×)

2.1.2 TUNEL染色結(jié)果 A組和B組的大鼠大腦皮層幾乎未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞(P>0.05)；與B組相比，C組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多，與C組相比，D組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠腦組織中的細(xì)胞凋亡(400×)

2.2 針刺對(duì)中風(fēng)大鼠缺血腦組織ICAM-5基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

RT-qPCR檢測(cè)ICAM-5 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：A組和B組大鼠腦組織中的ICAM-5 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組、D組大鼠腦組織中的ICAM-5 mRNA表達(dá)水平較A組、B組均降低(P<0.01)；但與C組相比，D組大鼠腦組織中的ICAM-5 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖5。

表1 各組大鼠缺血腦組織ICAM-5 mRNA表達(dá)

圖5 ICAM-5 Real-time溶解曲線

3 討論

缺血性腦卒中的病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中細(xì)胞凋亡在缺血性中風(fēng)的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。因此通過神經(jīng)保護(hù)療法來抑制細(xì)胞凋亡是當(dāng)前治療缺血性腦損傷的重要靶點(diǎn)。研究已證實(shí)針刺對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)ICAM-5也被發(fā)現(xiàn)廣泛參與了腦卒中的病理生理過程，具有促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和抗神經(jīng)元凋亡等重要作用，可在缺血缺氧條件下對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)建立局灶性腦缺血再灌注模型能夠明顯降低ICAM-5的表達(dá)，說明大鼠腦缺血后會(huì)抑制ICAM-5的表達(dá)；給予模型組針刺治療后，能夠顯著升高ICAM-5的表達(dá)，同時(shí)能明顯降低腦缺血對(duì)神經(jīng)功能的損傷，減少腦組織變形壞死范圍，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，說明針刺治療腦缺血大鼠可上調(diào)ICAM-5的表達(dá)從而起到腦保護(hù)作用。

已有大量研究證實(shí)腦缺血損傷后針刺治療可起到神經(jīng)保護(hù)的作用[13]。朱氏等[14]制備腦缺血再灌注大鼠模型，并與針刺治療后進(jìn)行對(duì)比觀察，發(fā)現(xiàn)針刺能減輕腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)缺損行為異常，縮小梗塞面積；羅氏等[15]研究發(fā)現(xiàn)，針刺督脈可減少腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而治療腦缺血；林氏[16]等研究發(fā)現(xiàn)針刺可通過調(diào)控相關(guān)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平，達(dá)到保護(hù)正常神經(jīng)細(xì)胞，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量的效果。本研究發(fā)現(xiàn)針刺可降低腦缺血對(duì)神經(jīng)功能的損傷，減少腦組織變形壞死范圍，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞間黏附分子-5(ICAM-5)是黏附分子免疫球蛋白超家族成員之一，只在神經(jīng)細(xì)胞表面表達(dá)，具有促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和抗神經(jīng)元凋亡等重要作用，可在缺血缺氧條件下對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用[17-18]。Guo等研究發(fā)現(xiàn)，在局灶性腦缺血小鼠模型中，缺血區(qū)腦組織中ICAM-5水平下降[8]。楊氏等通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，缺血缺氧環(huán)境可抑制ICAM-5的表達(dá)，而ICAM-5蛋白表達(dá)在缺血缺氧環(huán)境中具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以減輕缺血缺氧所致的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[9]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組ICAM-5 mRNA表達(dá)水平較正常組和假手術(shù)組均下降；而給予針刺治療后ICAM-5 mRNA表達(dá)水平明顯高于MCAO模型組，且參照HE染色腦組織變性壞死范圍及神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目，說明針刺的腦保護(hù)作用可能與上調(diào)了腦缺血大鼠ICAM-5的表達(dá)有關(guān)，本研究與先前學(xué)者研究結(jié)果一致[8-9,16]。

綜上所述，針刺可改善大鼠腦缺血損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)ICAM-5 mRNA表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用和減輕細(xì)胞凋亡有關(guān)。這些結(jié)果為ICAM-5參與腦卒中的生理病理過程提供了新的證據(jù)，并為針刺治療腦卒中的療效提供客觀依據(jù)。