基于網絡藥理學及分子對接技術分析六味地黃丸治療狼瘡腎炎的作用機制*

陳一鳴，李桓，武上雯，龔曉紅，陸超群，李松偉

1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046； 2.泗陽康達醫(yī)院，江蘇 泗陽 223700； 3.河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 4.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE) 是一種自身免疫功能受限介導的慢性炎癥性疾病，能在不同的血管及組織中引起免疫復合物沉淀，最終導致器官病變[1]。腎臟受累在SLE患者中很常見，狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE總體發(fā)病率和病死率高的主要危險因素[2]。目前，臨床針對LN的治療和預后方面取得的效果有限，腎衰竭的比例仍然居高不下[3]。中醫(yī)藥具有多靶點、多系統(tǒng)的調節(jié)作用，可作為治療LN的一種重要手段，但具體分子機制尚不明確。

古代醫(yī)學中未有LN病名的明確記載，而現代醫(yī)學將LN歸屬為“紅蝴蝶瘡”“腎臟風毒”“陰陽毒”“水腫”等范疇[4]。本病多屬素體稟賦不足，陰陽失調，腎陰本虧[5]。六味地黃丸是臨床治療腎陰虧虛的代表方劑。有研究表明，其可顯著提高環(huán)磷酰胺和糖皮質激素對LN的治療效果，并能有效減輕使用糖皮質激素和環(huán)磷酰胺的不良反應[6]。激素類藥物聯合六味地黃丸可通過降低其晚期糖基化終產物(receptor of advanced glycation end products，RAGE)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)及分形趨化因子(fractalkine，FKN)的表達水平，提高LN的治療效果[7]。另有研究表明，其還能夠有效降低SLE患者血清白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)及單核細胞趨化蛋白-4(monocyte chemotactic protein 4，MCP-4)水平、恢復輔助性T細胞1(Th1)和輔助性T細胞2(Th2)免疫平衡[8]。目前，六味地黃丸治療LN的臨床研究已得到多方驗證，但其具體作用機制尚不清楚。

本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法，旨在探究六味地黃丸治療LN的藥物有效成分及其潛在的治療作用機制，為后續(xù)LN的相關研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 有效成分的收集與篩選及其相關靶點的獲取使用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)檢索六味地黃丸中熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉和茯苓的化學成分。根據口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選出六味地黃丸的有效成分的作用靶點。通過Uniport數據庫標準化處理獲得與作用靶點匹配的基因。

1.2 LN疾病靶點獲取以“l(fā)upus nephritis”為關鍵詞，使用OMIM(http：//www.omim.org/)、GeneCards(http：//www.genecareds.org/)、DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)等數據庫，獲取與LN相關的疾病靶點。

1.3 獲取六味地黃丸治療LN相關的潛在靶點利用在線平臺Venny 2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/)將上述1.1與1.2獲得的靶點繪制韋恩圖，交集基因即為六味地黃丸治療LN相關的潛在靶點。

1.4 構建潛在靶點的蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡收集1.3獲得的潛在靶點上傳STRING數據庫(https：//www.string-db.org/)，種屬設置為“Homosapiens”，獲得PPI網絡，并通過Cytoscape(3.8.2)進一步繪制，節(jié)點即有效成分與疾病潛在的靶點，邊即節(jié)點與節(jié)點之間的相互關系，構建六味地黃丸治療LN的潛在靶點的網絡關系圖。

1.5 富集分析使用R語言的“BiocManager”，“org.HS.eg.db”，“clusterProfiler”等程序包，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，以確定靶基因的分子功能和作用機制，并通過氣泡圖將結果可視化。

1.6 分子對接篩選得到六味地黃丸中相應的藥物活性成分，通過PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其對應的2D結構；PDB(http：//www.rcsb.org/)獲得核心靶點3D結構。使用AutoDock、Vina軟件進行分子對接，利用PyMOL 軟件對結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 六味地黃丸有效成分收集、篩選及相關靶點獲取通過數據庫分析獲得六味地黃丸組方中的化學有效成分共計69個(熟地黃2個，山茱萸20個，山藥16個，牡丹皮11個，茯苓15個，澤瀉10個)。通過Uniprot數據庫對靶點蛋白標準化，共獲得六味地黃丸有效成分靶點基因210個。將中藥、化合物成分及靶點導入Cytoscape 3.8.2中，構建六味地黃丸組方的化學有效成分及預測靶點的關系網絡圖，見圖1。

圖1 中藥-化合物-靶點網絡圖

2.2 疾病作用靶點獲取結果通過1.2中的數據庫檢索獲取LN的相關靶點1 357個與六味地黃丸的210個靶點繪制LN疾病靶點與藥物有效成分靶點韋恩圖，見圖2。

圖2 藥物預測靶點與疾病靶點的韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網絡的構建將2.2獲得的103個交集基因，上傳String在線數據庫，通過Cytoscape3.8.2，繪制PPI網絡圖，見圖3。共有103個節(jié)點和1 879條邊，獲得度中心性(degrree centrality，DC)前10位的核心基因：蛋白激酶B1 (AKT1)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、IL-6、腫瘤抗原p53(TP53)、IL-1β、轉錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、半胱天冬酶3(CASP3)、前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase 2，PTGS2)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP9)、CXC趨化因子配體8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)，見表1。

圖3 六味地黃丸治療LN的PPI網絡

表1 六味地黃丸治療LN的關鍵靶點(節(jié)點度值排序前10位)

2.4 GO功能、KEGG信號通路富集分析采用GO功能、KEGG信號通路富集技術，對獲得的103個參與六味地黃丸治療LN潛在靶點的基因進行宏觀生物學評價。共有4 481個GO功能，包括與對脂多糖、對細菌來源分子的反應以及活性氧代謝過程等3 812個生物學過程(biological process，BP)相關；與膜筏、膜微區(qū)及膜區(qū)等245個細胞成分(cellular component，CC)密切相關；與細胞因子受體結合、細胞因子活性及DNA結合轉錄因子結合等424個分子功能(molecular function，MF)有關，見圖4。

圖4 六味地黃丸治療LN關鍵靶點的GO功能富集分析

2.5 六味地黃丸治療LN關鍵靶點KEGG信號通路分析KEGG分析結果表明，關鍵靶點參與的信號通路242條，主要包括IL-17信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化、HIF-1信號通路等，見圖5。

圖5 六味地黃丸治療LN的KEGG信號通路富集分析氣泡圖

其中，在前30位通路中，AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β涉及15個以上的通路(圖6)，且在PPI網絡核心基因中均位列前10位，這表明AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β可能為六味地黃丸治療LN的關鍵靶點。

圖6 六味地黃丸治療LN的KEGG弦圖

2.6 活性成分與核心靶點的分子對接采用分子對接技術分析六味地黃丸中主要活性成分與AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β蛋白的相互作用。從PBD數據庫中獲得靶點蛋白相對應的晶體結構。分別下載其PDB Formant 格式文件，運用AutoDock、Vina軟件進行分子化合物依次虛擬對接，結果見表2。若結合能小于-7 kcal·mol-1，則表示具有強烈的結合活性。選取山柰酚(MOL000322)與AKT1(PDBID：3mv5)，槲皮素(MOL000098)與JUN(PDBID：5t01)，薯蕷皂苷元(MOL000546)與 IL-6(PDBID：4zs7)，薯蕷皂苷元(MOL000546)與 IL-1β(PDBID：3ltq)，薯蕷皂苷元(MOL000546)與TP53(PDBID：5o1h)，借助Pymol2.5.0軟件分別進行分子對接可視化分析，見圖7。

表2 活性成分與核心靶點的分子對接

圖7 分子對接模式圖

3 討論

《類經》曰：“然正本拒邪，正氣不足，邪反隨之而入，故曰相引”“蓋邪氣多有余，正氣多不足。”腎虛是LN發(fā)病的內在因素，而長期使用激素以及細胞毒類藥物，極易產生熱毒，內邪、外邪雜至，灼傷營陰，加重病情發(fā)展[9]。

采用網絡藥理學及分子對接技術揭示六味地黃丸治療LN的協同作用機理，發(fā)現六味地黃丸中的多種藥物活性成分可以通過多個靶點蛋白發(fā)揮治療LN的作用。研究表明，六味地黃丸治療LN的活性成分包括槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷元、谷甾醇、β-谷固醇、豆甾醇等。

槲皮素是一種分布廣泛且具有多種藥理學作用的黃酮類化合物[10]。研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗纖維化等多種生物學功能[11]。周小剛等[12]證明，槲皮素可能通過調節(jié)自身免疫，減少炎癥因子生成，抑制補體系統(tǒng)過度激活從而對紅斑狼瘡小鼠模型有明顯的保護作用。

山柰酚也是一種廣泛存在于多種水果、蔬菜以及中草藥等天然植物中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌及抑制蛋白激酶等多方面的藥用價值[13]。山柰酚可以增強調節(jié)性T細胞(Tregs)的抑制功能，通過老鼠動物實驗發(fā)現，其可提高Tregs的叉頭盒P3(transcription factor forkhead box P3，FOXP3)表達水平，并防止由膠原蛋白引起關節(jié)炎的組織病理改變，同時能減少PIM1介導的FOXP3磷酸化S422，尤其是對一系列炎癥性疾病(如類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強直性脊柱炎等)的預防和治療提供參考[14]。

薯蕷皂苷元是一種廣泛分布于葫蘆巴屬及薯蕷屬植物中天然甾體皂苷元，常被用作合成甾體藥物的前體[15]。薯蕷皂苷元在降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎和抗增殖活性等方面發(fā)揮重要作用[16]。薯蕷皂苷元可以通過抗氧化、免疫等方面改善慶大霉素誘導的大鼠腎毒性，血清肌酐、尿素氮、白蛋白和總蛋白水平升高，尿電解質水平升高，促炎細胞因子、抗氧化參數顯著下降，并表現出明顯的劑量依賴性腎臟保護作用[17]。

GO功能富集分析顯示，多個生物學進程涉及AKT1、JUN、IL-6、TP53和IL-1β等核心靶點。其中，AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又叫作蛋白激酶B，是磷脂酰激醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K)/AKT信號轉導通路上控制細胞增殖、存活和細胞周期的主要下游靶蛋白，同時磷酸化的AKT還可調控下游因子介導炎癥反應[18]。并且可以通過激活AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路，與SLE的發(fā)病機制密切相關[19]。IL-6是重要的免疫調節(jié)因子和炎癥因子，可以刺激B細胞分化。實驗證明，IL-6表達水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病密切相關[20]。TP53基因擁有廣泛的生物學功能，生物信息學分析表明，miR-564在SLE患者中得到了調節(jié)，而TP53是miR-564的核心靶基因[21]。IL-1β是一種多效性免疫調節(jié)細胞因子，它被證明是一種有效的促炎藥物，在炎癥反應中也是有重要作用的細胞因子[22]。其也被證明與SLE的易感性和活動度密切相關[23]。

KEGG信號通路富集分析顯示，六味地黃丸可通過IL-17信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化和HIF-1信號通路等發(fā)揮生物學作用，以影響LN疾病進程。既往研究發(fā)現，狼瘡模型小鼠的 miR-23b能夠通過抑制IL-17/核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活來保護機體，而IL-17能降低細胞中miR-23b的表達，激活IL-17信號通路，從而促進自身免疫性疾病的發(fā)展[24]。TNF是一種介導自身免疫反應的重要效應因子，在狼瘡患者血清中水平較高[25]。狼瘡患者的TNF-α信號通路被激活，并通過NF-κB激活炎癥信號通路，造成局部炎癥暴發(fā)、組織損傷壞死和自身抗原暴露，加速疾病的發(fā)生和發(fā)展[26]。Th17細胞分化水平與SLE活動度密切相關[27]。潘海峰[28]發(fā)現，SLE患者Th17通路相關因子血清水平及mRNA水平表達均有異常，表明Th17通路調節(jié)異常與SLE的疾病進展密切相關。HIF-1能調控與代謝相關基因或酶的表達，具有調節(jié)免疫細胞分化的作用[29]。通過上調HIF-1水平，狼瘡小鼠模型腎小球系膜細胞增殖明顯，系膜細胞凋亡減少，說明HIF-1能促進細胞的增殖從而加重狼瘡的病理變化[30]。

綜上所述，六味地黃丸可能通過槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷元等多種化學活性成分，對LN起防治作用。