循環(huán)游離DNA在甲狀腺癌診療中的應(yīng)用

李寧，朱春悅，洪方成，馮哲明，鄭玉鑫，張風(fēng)華

（1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院腺體外科，河北 石家莊 050051；3.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050051）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌癌類型，約占腫瘤總數(shù)的2%[1]。在過去的30年里，甲狀腺癌發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，在中國，甲狀腺癌已躋升至女性惡性腫瘤的第3 位，且發(fā)病出現(xiàn)年輕化趨勢，已成為我國30 歲以下女性增長最快的惡性腫瘤[2]。目前甲狀腺癌診斷主要依靠甲狀腺超聲及細(xì)針穿刺（fine needle aspiration，F(xiàn)NA），但是由于腫瘤的異質(zhì)性，使用FNA 評估的甲狀腺結(jié)節(jié)中有15%～30%無法鑒別良惡性[3]。在甲狀腺癌的復(fù)發(fā)檢測方面，目前依賴于頸部的超聲等影像學(xué)檢查和連續(xù)的甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）測量，然而Tg 具有器官特異度，但不具有腫瘤特異度，在有殘留甲狀腺組織的治愈患者中仍然可以檢測到，同時部分患者體內(nèi)存在甲狀腺球蛋白抗體干擾Tg 水平的測量，這些因素都會對甲狀腺癌復(fù)發(fā)的監(jiān)測造成阻礙。循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA） 是腫瘤細(xì)胞通過壞死或凋亡過程釋放的胞外核酸片段[4]，攜帶有腫瘤組織基因，作為液體活組織檢查的主要組成部分cfDNA 檢測技術(shù)顯示了無創(chuàng)、快速、易于重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，是腫瘤遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的實(shí)時代表[5]。近幾年循環(huán)中高水平的cfDNA 被發(fā)現(xiàn)與癌癥的診斷和進(jìn)展有關(guān)，并顯示出作為癌癥反應(yīng)生物標(biāo)志物的潛在特征[6]，在癌癥的診治和預(yù)測轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮作用。下面將圍繞cfDNA 在甲狀腺癌早期診斷、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等方面的應(yīng)用展開闡述。

1 cfDNA在甲狀腺癌早期診斷中的應(yīng)用

cfDNA 已被證明在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥的診斷中具有重要的臨床應(yīng)用價值[7-11]，在甲狀腺癌中可通過評估cfDNA 的定量分析、完整性、突變基因及甲基化水平協(xié)助甲狀腺癌的早期診斷[12]，這為甲狀腺癌的早期診斷提供了一種新的檢測指標(biāo)。

1.1 cfDNA定量分析及完整性檢測在甲狀腺癌早期診斷中的應(yīng)用

循環(huán)游離DNA 完整性（circulating free DNA integrity, cfDI）是指血漿或血清中較長的DNA 片段與較短片段的濃度之比。在細(xì)胞凋亡過程中，正常細(xì)胞會在血液中釋放大約180～200 bp 小而均勻DNA 片段，而腫瘤細(xì)胞會釋放出較長且不均勻的DNA 片段，導(dǎo)致癌癥患者的cfDI 提高[13]。cfDI 已被證實(shí)在區(qū)分肝臟、乳腺以及腎臟結(jié)節(jié)良惡性方面發(fā)揮有效作用，成為癌癥診斷和預(yù)后的一個有前途的生物標(biāo)志物[14-16]。Salvianti 等[17]通過基于定量2 個不同長度的擴(kuò)增子（分別為67 和180 bp） 來評估cfDI （180/67） 在甲狀腺癌患者與良性甲狀腺結(jié)節(jié)患者兩者之間的差異，發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者較良性結(jié)節(jié)患者及健康人cfDI 更高，這一發(fā)現(xiàn)支持cfDI 可能成為甲狀腺結(jié)節(jié)早期鑒別診斷的一個標(biāo)志物。

絕大多數(shù)cfDNA 是由非腫瘤細(xì)胞釋放的，由腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死后釋放的一小部分cfDNA 被稱為循環(huán)腫瘤 DNA （circulation tumor DNA，ctDNA）[18]。 ctDNA 分為核DNA 和線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。近年來大部分研究都集中在核DNA，近年提出mtDNA 可區(qū)分良惡性腫瘤，也可能為癌癥診斷和預(yù)后提供重要信息[19-20]。最近一項研究[21]使用定量熒光PCR 技術(shù)分析了甲狀腺癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者和正常人血液中mtDNA 的水平，發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌患者血漿中mtDNA 的完整性比值明顯增高，但是甲狀腺癌細(xì)胞釋放完整mtDNA 的機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

此外，多項研究[17,21-24]通過對cfDNA 定量分析發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中cfDNA 濃度水平較甲狀腺良性疾病及健康者明顯增高，表明cfDNA 的定量分析可成為甲狀腺癌早期診斷的潛在指標(biāo)。對于細(xì)針穿刺結(jié)果性質(zhì)不明的甲狀腺結(jié)節(jié)，可通過cfDNA 定量檢測進(jìn)一步鑒別良惡性結(jié)節(jié)，診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的敏感度為100%，特異度為92.3%[23]。亦可在常規(guī)參數(shù)如降鈣素（calcitonin，CT）無法應(yīng)用時，作為甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）的診斷指標(biāo)[25]。

1.2 cfDNA基因突變分析在甲狀腺癌早期診斷中的應(yīng)用

有研究[22]對甲狀腺癌患者、良性甲狀腺疾病患者及健康者進(jìn)行cfDNA 中特定基因的檢測，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E 基線水平在甲狀腺癌患者體內(nèi)的百分比明顯增高。Cradic 等[26]采集173 例甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者及20 例非PTC 患者血液行BRAFT1799A 檢測，發(fā)現(xiàn)該基因突變在PTC 患者中檢出率是11.6%，而在非PTC 患者的血液及石蠟包塊樣本中均為未發(fā)現(xiàn)該基因突變，由此可見BRAFT1799A 的檢測可能在甲狀腺癌診斷中發(fā)揮作用，但需進(jìn)一步研究證實(shí)。

1.3 cfDNA基因甲基化水平檢測在甲狀腺癌早期診斷中的應(yīng)用

除了cfDNA 基因突變外，血清DNA 甲基化評估作為一種新的甲狀腺癌診斷工具于2006年被提出[27]。如TIMP3、DAPK 等腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域的異常甲基化使基因處于失活狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致甲狀腺癌的發(fā)生[28]。目前關(guān)于甲狀腺癌早期篩查常用的異常甲基化狀態(tài)的基因有RASSF1[29]；Calca、CdH1、 TIMP3、 DAPK、 RARβ2[27]； SLC5A8、SLC26A4[30]。近幾年提出甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化狀態(tài)在甲狀腺癌早期診斷中也發(fā)揮著重要作用，循環(huán)中DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶基因（MGMT 和DNMT1） 啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)在甲狀腺癌的早期診斷中有較高的靈敏度及特異度[30]。

2 cfDNA在預(yù)測甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

甲狀腺癌切除術(shù)術(shù)前主要依靠影像學(xué)以及細(xì)針穿刺活檢來評估甲狀腺癌轉(zhuǎn)移情況，然而有些轉(zhuǎn)移灶單純依靠術(shù)前影像學(xué)檢測很難發(fā)現(xiàn)。cfDNA檢測在預(yù)測局部晚期或轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌中具有一定作用，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足。

PTC 中BRAFV600E 突變的全球發(fā)生率約為45%[31]，在中國更高達(dá)85%[32]。 在PTC 患者中BRAFV600E 的表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[33]，建議對攜帶該基因突變的患者進(jìn)行積極干預(yù)和規(guī)律隨訪，以防止腫瘤復(fù)發(fā)。研究[34-40]發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中BRAFV600E 突變與甲狀腺癌的腺體外侵犯、轉(zhuǎn)移以及腫瘤較強(qiáng)的侵襲性有關(guān)。BRAFV600E 突變亦是甲狀腺癌發(fā)生對側(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個重要危險因素，且與甲狀腺癌較高侵襲性和轉(zhuǎn)移性相關(guān)[41]。有研究[35]表明，NRAS 基因突變在cfDNA 中的敏感度為50.00%，特異度為98.18%，但其在腫瘤中的低頻率限制了其獨(dú)立應(yīng)用，可采用NRAS 突變與血漿BRAFV600E 檢測聯(lián)合的方法監(jiān)測甲狀腺癌轉(zhuǎn)移情況。

同樣，cfDNA 基因甲基化狀態(tài)在甲狀腺癌轉(zhuǎn)移方面也具有一定的預(yù)測功能，如：RAS 結(jié)合域家族蛋白1 （RASSF1） 和鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因（SLC5A5） 的甲基化水平與疾病侵襲性相關(guān)[42]；SLC5A8 基因通過促凋亡作用發(fā)揮抑癌功能，其甲基化狀態(tài)已在不同的癌癥中觀察到[43]，SLC5A8 的高甲基化狀態(tài)與甲狀腺癌的分期、多灶性和腺體外侵犯呈正相關(guān)[44]?；趯TC 患者血液中cfDNA定量檢測分析發(fā)現(xiàn)，cfDNA 的高檢出率與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵襲性密切相關(guān)[45]。

3 cfDNA在預(yù)測甲狀腺癌預(yù)后中的應(yīng)用

ctDNA 在預(yù)測甲狀腺癌預(yù)后中的效果明顯優(yōu)于其他影像學(xué)檢測和蛋白標(biāo)志物檢測。多項研究表明cfDNA 中特定基因突變的檢出率與甲狀腺癌總生存率及不良預(yù)后有關(guān)， 如PIK3CA[46]、BRAFV600E[47-48]、RETM918T[49]。有研究[47,50]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性MTC 患者中RET 基因和BRAF 基因突變更為常見，可預(yù)測其不良預(yù)后。同時發(fā)現(xiàn)在分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）和間變型甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC） 患者中，循環(huán)中NRAS 和TP53 突變的高表達(dá)狀態(tài)會增加腫瘤進(jìn)展的可能性[47]。

目前對于甲狀腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測主要依靠影像學(xué)檢查及常規(guī)生物學(xué)標(biāo)志的檢測，研究[47]發(fā)現(xiàn)通過cfDNA 檢測技術(shù)可以更早發(fā)現(xiàn)常規(guī)影像學(xué)檢測不到的微小殘留病灶及復(fù)發(fā)跡象，可成為一種重要的補(bǔ)充檢測方法。通過對甲狀腺癌患者中持續(xù)疾病狀態(tài)（persistent disease，PD） 及無疾病狀態(tài)（no evidence of disease，NED） 兩類患者血漿中的cfDNA 檢測，發(fā)現(xiàn)在PD 患者中cfDNA 百分比明顯高于NED 患者。與傳統(tǒng)檢測方法相比，cfDNA 在檢測疾病狀態(tài)和腫瘤負(fù)擔(dān)方面具有更高的敏感度和特異度[45]。Patel 等[36]通過對甲狀腺癌術(shù)前、術(shù)后血漿樣本中BRAFV600E 基因突變表達(dá)豐度差異的檢測來判斷微小病灶殘留及預(yù)測甲狀腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)。此外有研究[26,39,51]已證實(shí)BRAFT1799A 突變與PTC 的局部侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率有關(guān)，這說明BRAFT1799A 可能成為預(yù)測PTC 預(yù)后的潛在標(biāo)記物。

4 cfDNA 在監(jiān)測甲狀腺癌治療反應(yīng)中的應(yīng)用

當(dāng)前甲狀腺癌的治療方式以手術(shù)和放療為主，靶向治療逐步應(yīng)用于晚期放射性碘難治性甲狀腺癌患者的治療，提高其無進(jìn)展生存期[52]。在治療期間，cfDNA 液體活檢技術(shù)可作為識別細(xì)胞分子特征的微創(chuàng)方法，幫助預(yù)測疾病進(jìn)展、縱向監(jiān)測腫瘤細(xì)胞對治療藥物的反應(yīng)、提供個性化治療[53]。而且，治療期間總cfDNA 水平的變化在監(jiān)測治療反應(yīng)及指導(dǎo)治療方面的作用已在肝癌[54]、黑色素瘤[55]等多種癌癥中得到證實(shí)。cfDNA 水平較傳統(tǒng)標(biāo)志物在反饋治療反應(yīng)及疾病狀態(tài)變化方面具有更高的靈敏度[37]。通過檢測循環(huán)中的BRAFV600E[22]和RETv804M[56]可篩選出可能導(dǎo)致治療耐藥的新突變基因，動態(tài)觀察治療反應(yīng)，及時終止無效治療，針對性指導(dǎo)藥物選擇。

Salviant 等[17]對17 例患者治療前后血漿中cfDI水平進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)無論是否進(jìn)行放射性治療，治療后的cfDI 均低于治療前，這說明cfDI 檢測可能在監(jiān)測治療方面發(fā)揮作用，但仍需要進(jìn)一步的研究。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，cfDNA 檢測技術(shù)除具有簡單、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)外，與傳統(tǒng)標(biāo)記物相比還具有更高的敏感度，已在甲狀腺癌的早期診斷、微小殘留病灶、預(yù)后及治療反應(yīng)監(jiān)測中顯示其獨(dú)特的優(yōu)勢。但血液樣本的選擇、cfDNA 的檢測方法等可能會導(dǎo)致cfDNA 檢測靈敏度及敏感度降低，進(jìn)而影響最終檢測結(jié)果。因此，還需繼續(xù)深入了解cfDNA 脫落機(jī)制以及開發(fā)更靈敏的檢測方法并檢驗其在甲狀腺癌的診療中的應(yīng)用效果。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。