LC-MS和LC-NMR在中藥三萜和甾體類成分快速鑒定中的研究進(jìn)展

李蓮慧 吳正波 王 葳 李大山 王文靜

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院暨云南省南藥可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500

中藥組成成分具有多樣性，在使用時一般需結(jié)合辨證施治原則[1]，其品質(zhì)與含量不但決定疾病防治效果，且直接影響患者的生命安全，所以有必要對中藥中的指標(biāo)性成分進(jìn)行定性定量分析。三萜和甾體類化合物是許多珍貴中草藥的主要有效成分，以游離或苷類形式廣泛分布于自然界的天然藥物中[2]。這兩類化合物都有著廣泛的藥理活性，其中，抗腫瘤活性一直是國內(nèi)外研究的熱點[3-7]。有些已被用作藥物或新先導(dǎo)化合物的可能來源[8]。但天然產(chǎn)物的內(nèi)在多樣性對分析、分離及檢測帶來了很大的挑戰(zhàn)，在早期的一些研究中，這兩類化合物通常被檢測為復(fù)合物[9]，若要完成分子結(jié)構(gòu)及其立體結(jié)構(gòu)的鑒定多通過NMR、MS、XRD、UV、IR、ORD、CD等波譜數(shù)據(jù)綜合分析，這不僅效率低、周期長、耗資大，不適合當(dāng)前快速發(fā)展的新藥研發(fā)過程，而且還經(jīng)常導(dǎo)致活性成分尤其是低含量成分的丟失或破壞。迄今為止，單獨針對此類成分結(jié)構(gòu)鑒定的報道日益增加。因此，選用一項高選擇性和高靈敏度檢測技術(shù)是準(zhǔn)確測定中藥中這兩類成分的重要選擇，也是一種重要的發(fā)展趨勢。

從單個技術(shù)采集到技術(shù)聯(lián)用，中藥化學(xué)成分分析采集技術(shù)層出不窮[10]。在聯(lián)用技術(shù)中，液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)和液相色譜-核磁共振(LC-NMR)聯(lián)用技術(shù)以其相對較高的分辨率、靈敏度和專屬性優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、生物、環(huán)保等領(lǐng)域[11-15]，近年來，該技術(shù)日臻完善，應(yīng)用前景日漸廣闊。相比于傳統(tǒng)HPLC或NMR技術(shù)，將該技術(shù)運用于結(jié)構(gòu)類型多樣的三萜和甾體類成分，更能快速準(zhǔn)確地提供結(jié)構(gòu)鑒定的特征信息。

筆者在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合最新研究動態(tài)，對近十年運用LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)分析中藥中三萜類和甾體類成分的方法進(jìn)行了綜述。

1 LC-MS聯(lián)用技術(shù)研究現(xiàn)狀

LC-MS聯(lián)用是以高效液相色譜為分離方法，質(zhì)譜為檢測手段的現(xiàn)代分析技術(shù)。在對未知成分進(jìn)行研究時，其原理是先基于高效液相色譜對于復(fù)雜樣品的高分離能力得到相對單一的化合物，再串聯(lián)質(zhì)譜得到特征碎片離子等結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，對未知成分進(jìn)行定性分析，此過程及目的也正好滿足中藥指紋圖譜研究的需要[16-17]。

三萜類和甾體類化合物多以缺少生色團的苷類形式存在，傳統(tǒng)的HPLC檢測方法通常因靈敏度不高而很難對微量成分進(jìn)行響應(yīng)測定[18]。而質(zhì)譜檢測可克服基質(zhì)抑制效應(yīng)，提供化合物的分子量和結(jié)構(gòu)信息，特別適合分析中藥復(fù)雜基質(zhì)中的三萜和甾體成分[9]。

質(zhì)譜有高分辨質(zhì)譜(HRMS)和低分辨質(zhì)譜(LRMS)之分。基于HRMS靈敏度高、掃描速度快且質(zhì)量范圍寬，能提供母離子和子離子小數(shù)點后4～6位的精確質(zhì)量測定等優(yōu)點，該技術(shù)常被應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速鑒定和區(qū)分分子量(MW)近似的化合物[19]。但HRMS缺少靶標(biāo)性掃描模式，對微量成分的檢測不如LRMS[20-21]。發(fā)展至今，HRMS主要有飛行時間質(zhì)譜(time-of-flight，TOF)、四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(quadrupole time-of-flight，QTOF)和線性離子阱串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜(linear ion trap quadrupole-Orbitrap，LTQ-Orbitrap)等。常見的LRMS包括三重四級桿質(zhì)譜(triple quadrupole，TQ)、離子阱質(zhì)譜(ion trap，IT)，以及結(jié)合了前兩種質(zhì)譜優(yōu)點的三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜(triple quadrupole linear ion trap，QTRAP)[22]，另外，離子遷移譜與質(zhì)譜聯(lián)用作為一種新型分析技術(shù)，對于較低含量組分的分析鑒定有著重要意義，也常用于藥物的質(zhì)量控制、快速篩查和分析檢測[23]。相對而言，LRMS的掃描速度與分辨率雖不及HRMS，但該技術(shù)具有多種特有的掃描模式，對微量與痕量成分的檢測具有一定優(yōu)勢[24-25]。因此，將優(yōu)勢互補組合的HRMS-LRMS用于中藥成分鑒定更能提高檢測效率?，F(xiàn)將已報道的，針對中藥三萜和甾體類成分快速鑒定，對完善中藥質(zhì)量評價能夠提供技術(shù)支持的現(xiàn)代聯(lián)用技術(shù)的幾類常用方法介紹如下。

1.1 液相色譜-離子阱質(zhì)譜(IT-MS)聯(lián)用 Sut等[26]為了闡明銀背委陵菜(Potentilla argentea)和直立委陵菜(Potentilla recta)水提物的生物制藥潛力，采用一維、二維核磁共振結(jié)合LC-DAD-ESI-MS和LC-APCI-MS技術(shù)，建立了LC-MS、NMR化學(xué)相關(guān)圖譜，鑒定出鞣花素、黃酮醇苷和三萜等成分，并對每個成分進(jìn)行定量分析，最終證明兩種植物的水提物都是最有效的ABTS清除劑。

孟月華等[27]應(yīng)用Finnigan LCQ Fleet IT-MS對預(yù)知子提取物在ESI-MSn負(fù)離子模式下能夠得到較多三萜皂苷類成分的多級裂解信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)裂解形成的皂苷元以常春藤皂苷元(m/z 471)及少量阿江欖仁酸(m/z 487)、齊墩果酸(m/z 455)等為主，這些特征苷元碎片離子可作為鑒定皂苷類型的直接依據(jù)，最后共推測鑒定了17種皂苷類成分，為建立該類化合物的LC-MS指紋圖譜提供參考方法。

相比于其它聯(lián)用技術(shù)，IT-MS存在穩(wěn)定性差、動態(tài)范圍窄、質(zhì)量歧視效應(yīng)難以規(guī)避及軟件適配度差等問題，但I(xiàn)T-MS成本較低，適用于三萜、甾體類分子結(jié)構(gòu)的局部分析。

1.2 液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(QTOF-MS)聯(lián)用 Xia等[28]利用超高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-ESI-QTOF-MS)在SWATH MSE模式下，同時采集前體離子[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+和相應(yīng)的碎片離子，對刺五加葉片中的三萜皂苷進(jìn)行綜合結(jié)構(gòu)表征。SWATH MS作為一種互補的信息采集技術(shù)用于分辨洗脫物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果共有89個三萜皂苷和14個皂苷元被明確鑒定。在這些化合物中，有33個被鑒定為潛在的新化合物，包括首次報道的刺五加屬中的malonyl-saponin。此外，在進(jìn)行多元統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的三萜類化合物是大量穩(wěn)定存在的，Xia等[28]建議將其中幾個三萜皂苷作為建立刺五加化學(xué)成分指紋圖譜以及質(zhì)量評價的新指標(biāo)成分。

Król-Kogus等[29]采用HPLC-ELSD-ESI-QTOF-MS方法對波蘭栽培的葫蘆巴種子中的甾體皂苷復(fù)合物進(jìn)行了定性和定量分析，該研究首次將兩根C-18柱串聯(lián)分析胡蘆巴皂苷，并對ELSD檢測器參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。在此方法下共檢測出26種呋甾固醇皂苷，其中24種已完成初步鑒定。在對波蘭和亞洲葫蘆巴種子中的總皂苷HPLC-MS圖譜進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，不同品種的皂苷種類和含量都存在顯著差異，與亞洲品種相比，波蘭胡蘆巴種子中原薯蕷皂苷含量最高，而其他甾體皂苷含量相對較少。

由此可見，LC-QTOF-MS由于離子化效率提高，在化合物結(jié)構(gòu)鑒別方面存在較大優(yōu)勢，可作為分析三萜和甾體及其皂苷的一種常用方法，但在色譜分辨能力上往往不足以分離分子量近似的化合物。應(yīng)用LC-MS/MS，可以提供苷元獨特的裂解模式，包括附著在苷元上的糖基的數(shù)量和類型的信息，以進(jìn)一步完善化合物的結(jié)構(gòu)表征[30]。

Ling等[8]開發(fā)了一種分離和表征蘆筍(Asparagus cochinchinensis，RAC)干根藥材中主要活性成分——甾體皂苷的一種方法。該研究首次使用電噴霧電離與四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-QTOF-MS/MS)相結(jié)合的新型高效液相色譜法對RAC中甾體皂苷進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。此方法因運用串聯(lián)質(zhì)譜，裂解所得到的離子信息得以進(jìn)一步放大，所以即使在極低濃度下，甾體皂苷也具有豐富的苷元和糖鏈結(jié)構(gòu)解析信息。最后，共檢測和鑒定了30個甾體皂苷，其中包括17個潛在的新化合物。此方法可廣泛應(yīng)用于化學(xué)成分相對復(fù)雜樣品的綜合分析，可為進(jìn)一步建立指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量控制提供化學(xué)基礎(chǔ)。但此方法在對糖單元的連接位置確認(rèn)上仍有一定局限性。

Li等[31]在UHPLC-QTOF-MS/MS分析基礎(chǔ)上，建立多反應(yīng)檢測掃描(MRM)的特征離子采集方法，對澤瀉三萜類成分進(jìn)行了全面表征，通過建立指紋圖譜對不同產(chǎn)地、不同炮制手段的澤瀉樣品中三萜類成分進(jìn)行成分差異研究。基于QTRAP-MS/MS的MRM技術(shù)建立的特征輪廓譜能夠?qū)?fù)雜的QTOF總離子流色譜圖簡化，采用此方法測定澤瀉三萜化合物，其響應(yīng)值約為QTOF-MS/MS的3倍，因此特別適合微量化合物的定性和定量分析。譜圖顯示，不同產(chǎn)地的澤瀉樣品經(jīng)炮制后其三萜類成分的相對含量發(fā)生不同程度變化。該研究所建立的MRM特征輪廓譜分析方法對不同產(chǎn)地/炮制手段的澤瀉藥材質(zhì)量控制具有潛在的應(yīng)用價值。

Q-TOF的出現(xiàn)有效地解決了中藥分析中組分復(fù)雜、定量困難等問題，但Q-TOF只能形成二級碎片，對于未知結(jié)構(gòu)化合物的解析尚有不足，且離子源更換麻煩，配套的液相系統(tǒng)穩(wěn)定性欠佳，在后期發(fā)展中應(yīng)更注重硬件適配問題。

1.3 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(TQ-MS)聯(lián)用 鑒于triple TOF-MS/MS具有較強的全掃描定性分析能力，而QTRAP-MS/MS具有良好的定量靈敏度和穩(wěn)定性，Chen等[32]將兩種技術(shù)的優(yōu)勢充分結(jié)合，采用超快速液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)和超快速液相色譜-三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)對西洋參(PJR)中的皂苷建立定性定量分析方法；采用UFLC-Triple TOF-MS/MS對PJR中的皂苷成分進(jìn)行鑒定，通過標(biāo)準(zhǔn)品對照分析，明確鑒定出23種皂苷，其余皂苷通過裂解行為分析也得以初步推斷。采用UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定不同采收時間的PJR樣品中13種皂苷的含量，并通過灰色關(guān)聯(lián)度分析(Grey Relational Analysis, GRA)對樣本質(zhì)量進(jìn)行了評價，為確定PJR最佳采收期提供了基本信息，對其質(zhì)量評價和控制有一定的指導(dǎo)意義。

在MRM應(yīng)用于三萜苷類的分析表征時，廣泛使用傳統(tǒng)的直接進(jìn)樣方式，此方法下，MRM離子對的使用并不規(guī)范。為此，Xia等[33]研究發(fā)現(xiàn)，三萜皂苷經(jīng)溫和的氣相分解質(zhì)子化或形成氨化前體(DPAP)后，可以高效、穩(wěn)定地生成一系列豐富的配基離子([A+H-nH2O]+(n = 0，1，2，3，…)?；谶@些考慮和發(fā)現(xiàn)，他們在QTRAP 4000儀器上設(shè)計了一種創(chuàng)新性的ESI+-MRM-DPAP-MS方案，可以對植物中的三萜皂苷進(jìn)行快速定性和定量分析。通過對20種中草藥中85個模型化合物的詳細(xì)研究，經(jīng)驗證、評價后正式提出了ESI+-MRM-DPAP-MS策略。他們將該方法實際應(yīng)用于三七(Panax notoginseng)、紅毛七(Caulophyllum robustum)、龍牙楤木(Aralia elata)等中藥中的總?cè)贫嘣镔|(zhì)群疊加圖譜采集，作為構(gòu)建質(zhì)量控制的綜合評價平臺，也表現(xiàn)出良好的敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

TQ-MS在保留了原四極桿質(zhì)譜的強定量能力的基礎(chǔ)上，提供了串級功能，使質(zhì)譜的定性能力和效率進(jìn)一步加強。除一般離子掃描功能外，TQ-MS還具有SRM、MRM、母離子掃描等功能，且MSM信噪比也有了明顯提高，這對特征基團的結(jié)構(gòu)研究有很大幫助。但TQ-MS在分辨率方面仍有不足，在進(jìn)行三萜、甾體類化合物鑒別時，近似m/z離子的干擾比較大。

1.4 液相色譜-離子淌度(遷移)質(zhì)譜(IMS)聯(lián)用 上述質(zhì)譜方法為三萜和甾體的結(jié)構(gòu)表征提供了極大的便利，但在鑒定結(jié)構(gòu)上僅具有細(xì)微差異的同分異構(gòu)化合物時仍具挑戰(zhàn)性，所以難以建立準(zhǔn)確、完整的HPLC/UPLC圖譜。而Colson等[34]發(fā)現(xiàn)，利用目標(biāo)組分在行波離子遷移質(zhì)譜(TWIMS)中離子遷移到達(dá)時間分布(ATD)的不同，可對立體異構(gòu)和位置異構(gòu)混合物進(jìn)行部分分離。但因同分異構(gòu)體皂苷ATD差異微小，必須先用液相色譜進(jìn)行初步分離，后用TWIMS分析才能監(jiān)測到?；诖耍麄兺ㄟ^整合上述方法再結(jié)合MALDI-TOF、LC-MS和碰撞誘導(dǎo)解離實驗分析了七葉樹(horse chestnut，HC)種子中的皂苷提取物，使結(jié)構(gòu)極其相似的七葉皂苷和異七葉皂苷得以分離鑒定。此方法的開發(fā)又大大拓展了質(zhì)譜的性能和應(yīng)用范圍，為進(jìn)一步完善三萜、甾體類指紋圖譜，提升中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新的思路。

Feng等[35]針對茯苓提取物中羊毛甾烷類化合物提出了一種基于UPLC-IMS-MSE聯(lián)用技術(shù)，并結(jié)合UNIFITM軟件對所獲取的MS數(shù)據(jù)進(jìn)行有針對性的過濾，建立內(nèi)部化合物數(shù)據(jù)庫，以快速區(qū)分和鑒別該提取物中同分異構(gòu)體的分析策略。因IMS可以根據(jù)質(zhì)譜的電荷狀態(tài)、形狀、尺寸進(jìn)行第二次分離，使得UPLC-IMS-MSE組合分析技術(shù)在分離鑒定方面更具優(yōu)勢。在此方法下，根據(jù)化合物的中性丟失、特征離子、裂解途徑情況，最終共鑒定出121種羊毛脂甾烷型三萜酸，其中有三種化合物被首次檢測到。

面對中藥成分結(jié)構(gòu)類型多樣、濃度變化大、極性跨度大、異構(gòu)體廣泛等挑戰(zhàn)，色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不斷發(fā)展，在維度方面也繼續(xù)提升。以UPLC/IM-QTOF-HDMSE為代表，由離子遷移率提供離子分離附加維數(shù)，UPLC進(jìn)一步對成分進(jìn)行洗脫保留分離，使QTOF-MS得到了更多的結(jié)構(gòu)鑒別信息。這對從中藥的眾多成分中有選擇性地直接分析目標(biāo)結(jié)構(gòu)類型具有重要意義。

Huang等[36]在對桔梗的化學(xué)成分進(jìn)行綜合表征時運用UPLC/IM-QTOF-HDMSE聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)同位素豐度、元素組成和碎片離子信息，初步鑒定了187個化合物，其中三萜皂苷為85個。對洗脫順序進(jìn)行重點考察后確定C-3位上糖基與苷元的連接方式是三萜皂苷結(jié)構(gòu)異構(gòu)化的主要原因。在分析桔梗皂苷異構(gòu)體時，對UPLC/IM-QTOF-HDMSE和UPLC-QTOF-MSE兩種聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者鑒別的數(shù)量是后者的兩倍以上，由此可見此聯(lián)用平臺可支持結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣成分的深入研究。

近年來，IMS在異構(gòu)體分析方面彰顯出極大的優(yōu)勢，但該技術(shù)缺乏離子遷移主要標(biāo)準(zhǔn)，分析速度受遷移率與質(zhì)譜儀間界面效率的限制，因此，要將IMS用于三萜、甾體類化合物的快速鑒定需在上述問題上有所改善。

2 LC-NMR聯(lián)用技術(shù)研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的三萜和甾體類化合物的結(jié)構(gòu)表征分析方法，主要使用單一的核磁共振(NMR)技術(shù)對已純化的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，這使得樣品的前處理耗時費力。因此，對快速識別和表征結(jié)構(gòu)方法的需求越來越大。

現(xiàn)今，LC-NMR的相關(guān)運用在天然產(chǎn)物鑒定[37]、多聚物分析[38]、異構(gòu)體研究[39]等領(lǐng)域的應(yīng)用迅速增多。HPLC-NMR能夠?qū)⒎蛛x和結(jié)構(gòu)鑒定連為一體，大大簡化了分析過程。隨著該技術(shù)在藥物化學(xué)中的普遍應(yīng)用，現(xiàn)已逐漸成為這一領(lǐng)域中最強有力的分析手段之一，繼而也推動了藥材、飲片、提取物以及制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[40]，為建立更加有效、科學(xué)、可行的質(zhì)量評價體系，提升完善中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要支撐。

LC-NMR聯(lián)用技術(shù)最常見的有LC-NMR直接在線聯(lián)用和液相色譜-固相萃取-核磁共振(LC-SPE-NMR)在線聯(lián)用兩種模式，隨著分析要求的提高，LC-NMR又與質(zhì)譜(MS)、尺寸排阻(SEC)等技術(shù)聯(lián)合，LC-MS-NMR和LC-SEC-NMR聯(lián)用等技術(shù)應(yīng)運而生。

Horník等[41]以蕁麻根提取物為研究對象，比較了已有的HPLC-NMR法與他們自己開發(fā)的SEC-NMR法用于快速篩選植物甾醇的優(yōu)缺點。在進(jìn)行HPLC-NMR檢測后，共分離檢測到9種主要成分，在相似的游離植物甾醇1H NMR波譜中，明確鑒別Δ5-Avenasterol、Campesterol和β-Sitostanol等7種甾醇。此方法雖靈敏度較高，卻比較耗時；SEC-NMR法檢測速度相對較快，但由于檢測的是一段時間的洗脫成分，所以無法避免強烈的信號重疊，經(jīng)條件優(yōu)化后分離度有所提高，但靈敏度低、定量限過高等問題依然存在。由此可見，HPLC-NMR法用于分析甾醇類物質(zhì)更具優(yōu)勢。

LC-SPE-NMR是一個相對較新的概念，Koning等[42]于1998年第一次發(fā)表了在線SPE裝插與NMR探針耦合的例子，后續(xù)才有人報道相關(guān)的應(yīng)用。

Khakimov等[43]以冬芥(barbarea vulgaris, winter cress)的無毛型(G)和短柔毛型(P)為研究對象，展示了一種利用GC-MS、LC-MS/MS和LC-SPE-NMR/MS聯(lián)用分析平臺篩選三萜皂苷的方法。該研究使用Bruker/Spark Prospekt 2 LC-SPE系統(tǒng)連接MicroTOF質(zhì)譜，以15min為一個收集點，通過LC-SPE-NMR/MS和GC-MS分析洗脫液后發(fā)現(xiàn)，兩種冬芥中的8種三萜苷元的分子量存在差異。若單獨使用各種分析方法，要實現(xiàn)從復(fù)雜的混合物樣品中直接闡明皂苷的完整結(jié)構(gòu)是具有較高挑戰(zhàn)性，然而，多個平臺聯(lián)合使用，可以獲得大量關(guān)于苷元的結(jié)構(gòu)以及糖基的數(shù)量和連接位置等綜合信息。Khakimov等[43]所提出的方法實現(xiàn)了詳細(xì)比較植物提取物中的完整皂素譜以及水解樣品中的皂素苷元譜。

LC-NMR有多種操作模式，如連續(xù)流、環(huán)貯流、停流等，不同模式在圖譜質(zhì)量、分析時間上有明顯區(qū)別，在實際操作中，可根據(jù)樣品的特性和檢測目的來靈活調(diào)節(jié)。目前，該技術(shù)相對較低的靈敏度和較高的鑒定限是阻礙其發(fā)展的根本原因之一。在分析三萜和甾體類化合物時，為了提高該技術(shù)的靈敏度，大多研究者會選擇在NMR探頭、磁體、參數(shù)、運行模式上做調(diào)節(jié)，但對HPLC系統(tǒng)操作條件的選擇和優(yōu)化也是重要的措施之一。

Goulas等[44]以HPLC-SPE-NMR和HPLC-DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)聯(lián)用為分析手段，對狹葉香科Teucrium polium的提取物進(jìn)行研究。在多次實驗后，在0.1%醋酸溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脫，0.6 mL/min流速，Bruker AV-500NMR儀，3 mm LC SEI 13 C- 1H探頭測定條件下，發(fā)現(xiàn)了在狹葉香科中含量最高、活性最強的成分為金石蠶苷，抗氧化的主要成分為毛蕊花苷和二甲氧基槲皮素。此條件下，可于在線檢測的同時，直接建立LC-NMR信號圖譜，實現(xiàn)以最快速度對其中的三萜苷類進(jìn)行歸屬和指認(rèn)，且對于特征的末端官能團而言，峰的信號強度還可作為定量的依據(jù)。

3 總結(jié)與展望

文章綜述了近十年來LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)用于三萜和甾體類化合物的分離、檢測和鑒別，可推動中藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的分析手段和方法進(jìn)一步完善。三萜和甾體類化合物雖結(jié)構(gòu)類型多樣，但卻有規(guī)律可循，尤其在LC-MS中三萜皂苷類中各類糖基斷裂產(chǎn)生的中性丟失是最為明顯的裂解特征，而后期UPLC的引入，無論在靈敏度還是在準(zhǔn)確性上都有所提高?？傮w而言，兩種聯(lián)用技術(shù)的特點是將HPLC的高效分離能力和MS、NMR精確的結(jié)構(gòu)表征能力巧妙結(jié)合起來，在應(yīng)用過程中二者各有優(yōu)劣，可合理綜合使用。建立穩(wěn)定、高效和準(zhǔn)確的分析方法，無論是對中藥整體還是其中的三萜、甾體類成分都有重大意義。在今后的研究過程中還應(yīng)不斷地優(yōu)化LC-MS和LC-NMR聯(lián)用技術(shù)向更快、更精準(zhǔn)方向發(fā)展，推動中藥化學(xué)成分指紋圖譜的完善和建立。