菌種培養(yǎng)及保存過程中菌種退化的研究進展

李旻向 劉爾倫 周湘丹 曾光熙

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

菌種退化是指菌種在培養(yǎng)或保存的過程中，由于各種因素的影響而引起的某些優(yōu)良性狀劣化的現(xiàn)象，主要是由于自發(fā)突變的存在，使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，引起有關基因的負突變，從而導致菌種某些優(yōu)良性狀丟失。菌種退化不是瞬間發(fā)生的，而是一個由量變到質(zhì)變的過程，主要發(fā)生在傳代培養(yǎng)過程中。即使突變發(fā)生頻率較低，數(shù)目基數(shù)龐大的菌群中也會出現(xiàn)少量發(fā)生突變的個體，并在后續(xù)傳代培養(yǎng)中突變菌株逐漸取代目的菌株成為優(yōu)勢菌種，影響群體中某產(chǎn)物產(chǎn)量。

1 菌種退化的原因

1.1 自發(fā)突變

目前認為造成菌種退化的主要原因是自發(fā)突變。自發(fā)突變是指由于自然界中各種誘變劑的作用，或由于DNA在復制、修復等過程中堿基配對出現(xiàn)錯誤而導致有關基因結構發(fā)生改變而產(chǎn)生的突變[1]。對于微生物來說，其自身一些特殊的生理特性決定了自發(fā)突變頻率較其他生物更高。例如：大腸桿菌的代時為20 min，這說明其在一定時間內(nèi)DNA復制次數(shù)遠遠大于其他真核生物細胞，使其在復制過程中出現(xiàn)錯誤的概率增大，因而自發(fā)突變現(xiàn)象在微生物中的發(fā)生頻率更高。自然環(huán)境中存在大量誘變劑，包括某些化學物質(zhì)或者宇宙空間中的各種射線。在誘變劑的作用下，DNA結構變得不穩(wěn)定，更容易發(fā)生突變。

化學物質(zhì)能誘導微生物自發(fā)突變，但不是由單一的某種化學物質(zhì)所導致，而是由多種不明的誘變劑綜合作用導致的，這些化學物質(zhì)通常對微生物有著長期的誘導作用，即便是低劑量，也會對微生物的自發(fā)突變產(chǎn)生難以忽視的影響。例如，活性氧簇（ROS）就是一種常見的化學誘變劑，它是一種內(nèi)源性地引起細胞DNA損傷和老化的物質(zhì)。ROS能導致幾種形態(tài)的DNA損傷，包括單鏈和雙鏈斷裂、化學加成、錯誤交聯(lián)[2]。ROS中的過氧化氫作為一類細胞代謝產(chǎn)物，是由過氧化氫基團水解產(chǎn)生的。過氧化氫基團又被稱為“自由基”，是由生物體內(nèi)過氧化氫酶催化蛋白質(zhì)集團生成過氧化氫能對微生物DNA產(chǎn)生損傷作用，當損傷程度較高時，甚至會導致微生物死亡。

空間中存在的宇宙射線也是導致細胞自發(fā)突變的原因之一，宇宙射線的輻射作用造成DNA斷裂，從而導致DNA結構及穩(wěn)定性改變，進而造成突變。其中，DNA雙鏈斷裂是影響細胞DNA結構的主要DNA鏈斷裂類型，其是一種類型的DNA損傷，是真核生物中最有害的損傷，嚴重影響基因組完整性[3]，對微生物影響較大。同時，由于其在正常的修復機制下并不能得到修復，因而常常導致一系列問題，甚至導致細胞死亡。

1.2 連續(xù)傳代

連續(xù)傳代能導致菌種退化，主要是由于在連續(xù)傳代的過程中，菌種發(fā)生自發(fā)突變的頻數(shù)會增加。傳代過程中發(fā)生自發(fā)突變的概率隨著傳代次數(shù)的增加而增加，尤其是負突變發(fā)生概率將大大增加。在連續(xù)繼代培養(yǎng)后，發(fā)酵菌株將經(jīng)歷退化過程，這與其生理等方面有重要關聯(lián)。例如，Bachmann等將一株乳酸乳球菌株連續(xù)傳代繁殖1000代，后續(xù)通過測序發(fā)現(xiàn)，3株傳代菌株中分別出現(xiàn)6處、7處和28處突變[4]。另一方面，在多次連續(xù)傳代的過程中，擁有負突變基因的衰退型細胞會更快地增殖并占據(jù)優(yōu)勢地位，從而使整個群體出現(xiàn)相關衰退性狀。在工業(yè)發(fā)酵中用于生產(chǎn)丙酮-丁醇-Tra（ABE）的產(chǎn)溶劑tic梭菌在多次連續(xù)傳代過程中失去了生產(chǎn)溶劑的能力[5]。經(jīng)過研究鑒定，對于多次繼代培養(yǎng)的平菇來說，其菌絲體中DNA損傷修復系統(tǒng)尤其是同源重組修復的雙鏈斷裂受損，從而導致菌株退化[6]。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件對菌種退化的影響巨大，其中，溫度、pH值、濕度、通氣量等是培養(yǎng)條件的重要衡量指標，氧氣、營養(yǎng)、保存溫度等是保存條件的衡量指標。在固定其他變量的條件下，可以篩選出某微生物菌種的最佳單一變量。即便對于同種微生物，也可能出現(xiàn)不同表型，而某些表型常被視為退化菌株的特征。例如，食用菌繁殖時通常會分泌多種胞外酶用來分解有機物，如纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶等[7]，不合適的培養(yǎng)條件會造成菌種退化，常常表現(xiàn)為長勢差、出菇遲、產(chǎn)量下降、質(zhì)量變差、抗性減弱等[8]；在繁殖階段也通常出現(xiàn)色素產(chǎn)量增加、子實體扭曲等現(xiàn)象[9-12]。

在菌種篩選工作中，培養(yǎng)基不合適會造成篩選工作困難，短期內(nèi)極易誤認為是保存條件不適宜而導致的菌種退化。若培養(yǎng)基中提供的有機物能直接被微生物利用，那么某些具有特殊有機物降解能力的微生物將不再消耗多余的能量合成降解特殊有機物的酶，乳糖操縱子試驗便很好地證明了該觀點，這也曾經(jīng)被學者稱為“生物合成的經(jīng)濟學效應”[13]。當然，這與菌種衰退是否具有顯著關系還需要進一步試驗證明。

已有研究表明，培養(yǎng)基的成分與菌種退化有一定的聯(lián)系。當培養(yǎng)基成分單一或者缺乏菌種所需的營養(yǎng)成分時，可能導致菌絲生長率下降。例如，當草菇長期在以葡萄糖為主要碳源的培養(yǎng)基上生長時，可能導致其對碳源吸收率降低而加速菌種退化，而通過更換碳源能提高菌絲對碳源的吸收率[14]。另外，培養(yǎng)基中成分構成與菌種代謝活動也有一定的聯(lián)系。鄒芒閣等[15]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基碳氮比對于藥用真菌某些代謝產(chǎn)物多糖產(chǎn)量有一定的影響，并且不同種類的藥用真菌最適碳氮比具有明顯差異，多糖合成量在不同濃度氮源下隨碳源變化而出現(xiàn)不同變化趨勢。但是，培養(yǎng)基碳氮比并不是對所有的菌種代謝活動都具有顯著影響。諸發(fā)會等[16]發(fā)現(xiàn)，利用茯苓菌株作為試驗菌種，在不同碳氮比濃度水平的處理下，各組茯苓菌株子實體形成無顯著差異。培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件優(yōu)化能較大程度地提高微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率、提高菌種活力、延緩菌種退化，而不同的微生物種類對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，所采用的培養(yǎng)基配方也各不相同。因此，培養(yǎng)基配方在延緩菌株衰退的科研工作中有重要意義。

1.4 雜菌污染導致基因重組

在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件不良或者操作條件不嚴格而導致雜菌污染，也會出現(xiàn)菌種退化風險。因為一旦出現(xiàn)雜菌污染并且在培養(yǎng)基中出現(xiàn)雜菌菌落，就有可能導致雜菌細胞部分片段的DNA被所篩選目的菌吸收，進而導致轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，有可能會改變所篩選菌種的基因型，若被整合的片段涉及相關酶合成基因，菌種便會發(fā)生一定程度的衰退。然而，雜菌污染導致菌株生活力下降并不意味著菌種一定發(fā)生了退化，當雜菌數(shù)大量增加時，會占據(jù)有利空間和營養(yǎng)物質(zhì)，從而導致目的菌數(shù)下降，這與真正的菌種退化有一定的區(qū)別，通過劃線分離的方法一般可以檢驗產(chǎn)量下降是否是由于雜菌污染[17]導致的。

1.5 噬菌體感染導致菌種退化

大量研究表明，噬菌體侵染也能導致菌種退化。以潛伏感染為主要特征的病毒顆粒進入宿主細胞后，噬菌體的遺傳物質(zhì)會整合至宿主DNA上以緩慢的增殖速度存在于宿主細胞，在此過程中有可能導致宿主細胞相關酶基因或相關化學物質(zhì)合成基因替換或者失活，從而導致菌種退化。另外一種情況便是在某種特定遺傳或者生態(tài)環(huán)境條件變化下，宿主細胞內(nèi)的病毒顆粒復制驟增[18]，病毒顆粒數(shù)目通過爆炸式增長并在宿主細胞中失控表達而導致宿主細胞生活力下降。對于某些食用菌來說，菌絲生長明顯受阻，長勢下降，表現(xiàn)為菌絲體退化等明顯特征；對于纖維素、木質(zhì)素分解菌來說，會出現(xiàn)產(chǎn)酶量低、菌落少而暗淡、活性差等一系列特征。

1.6 核型改變導致菌種退化

某些食用菌在生長過程中會產(chǎn)生菌種異核現(xiàn)象，而核型改變可導致菌種遺傳變異的發(fā)生，出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象[19]。具有不同遺傳性的核共存于同一細胞，極有可能導致遺傳性狀改變。另外，某些真菌如香菇具有特殊的生殖方式，即四極性異宗結合。這樣的結合方式使相同極性的孢子結合不可育，不能發(fā)育形成子實體，這一類菌絲最后將形成單核體，造成菌種退化[20]。

2 預防、延緩菌種退化的措施

菌種退化是遺傳因素與環(huán)境因素的綜合作用而產(chǎn)生的結果，對菌種退化現(xiàn)象的預防措施不能僅從單方面進行分析、考量，應綜合考慮展開。

2.1 創(chuàng)造科學的保存條件

引起菌種退化的外界環(huán)境因素眾多，其中溫度是最主要的影響因素，其作用原理是通過控制細胞內(nèi)生化反應速率，從而對細胞代謝產(chǎn)生影響。細胞在代謝旺盛時，繁殖速率相應提高，其過程中出現(xiàn)的突變也會相應增多。例如，在大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型中，溫度升高會導致其突變率顯著提高。因此，通過控制溫度能降低菌種退化概率，據(jù)此衍生出的最有效的技術便是菌種保存技術，目前國內(nèi)外公認防止菌種退化的最好辦法是采用液態(tài)氮超低溫保存[21]，而短暫保存時通常采用低溫保存，但低溫保存時間不宜過長。

在現(xiàn)有低溫保存技術下，通過加入各類輔助試劑被證明有更好的保存效果。例如，以甘油、海藻酸鈉和二甲基亞砜為低溫保護劑，采用真空冷凍干燥法制備厭氧氨氧化菌粉對于厭氧氨氧化菌的復壯效果最佳[22]，以半固體穿刺保存法保存工程大腸桿菌能達到1年左右的保存時間，對于某些菌種時間則更長[23]。以載體法對硝化細菌進行保存時，加入亞硝酸鹽有著更好的效果，此外還有空氣阻隔法、避光法等[24]。朱華玲等發(fā)現(xiàn)以0.1%PEG-6000水溶液保存法對多種真姬菇菌的保藏效果最佳[25]。周龍洋等研究不同保藏方法對66種真菌的保存效果，結果表明，對于短期保藏需求，斜面移植法效果較好；對于長期保存需求，液狀石蠟保存法及白膠塞封口法有更好的效果[26]。

2.2 菌種復壯

對于已經(jīng)出現(xiàn)退化的菌種，可通過菌種復壯方法，及時分離正常菌株并對其純化，避免退化菌株占據(jù)優(yōu)勢而使整批菌種完全退化。王殿振等[27]利用菌種北蟲草為試驗材料，進行多次傳代培養(yǎng)得到目的退化菌種，采用多種復壯方法諸如蠶蛹回接法、孢子分離法、組織分離復壯法等進行菌種復壯，通過對比經(jīng)復壯后菌種與未經(jīng)復壯菌種菌絲日均生產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在各種菌種復壯方法中以蠶蛹回接法效果最佳。夏淑春等[28]利用蛹蟲草菌種為試驗材料，分別采用基內(nèi)菌絲分離法、分生孢子分離法、子囊孢子分離法等進行菌種復壯，對比各種復壯方法下菌絲生長量，發(fā)現(xiàn)子囊孢子分離法和蠶蛹回接法復壯效果顯著優(yōu)于分生孢子分離法?？阻麒萚29]利用草菇作為試驗材料，通過添加外源氨基酸對菌株進行培養(yǎng)，以探究外源氨基酸的潛在復壯作用，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加外源絲氨酸可顯著降低菌株中活性氧含量。

2.3 防止雜菌污染

對于菌種退化的預防不能僅從菌種考慮，對于外在環(huán)境的嚴格控制在眾多的科學研究及發(fā)酵生產(chǎn)中被證明更具科學性及可行性。在發(fā)酵工業(yè)中，外源污染是對菌種影響較大的重要因素之一，這也是導致工業(yè)發(fā)酵菌種目的產(chǎn)物產(chǎn)量降低的重要因素，包括雜菌污染導致發(fā)酵菌株優(yōu)勢地位被雜菌取代造成產(chǎn)量下降以及噬菌體感染菌株導致菌株衰退而影響產(chǎn)量。對于噬菌體感染的防治在近年來得到了一定的突破。張高娜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，對于噬菌體增殖感染發(fā)酵菌現(xiàn)象的預防，添加0.5%草酸或0.5%檸檬酸具有較好的效果。另外，選育抗噬菌體的優(yōu)良菌株對于解決噬菌體感染也有積極意義?？故删w選育有多種方法，其中通過自然誘變的方式得到優(yōu)良菌株已被多次報道[31]。對于雜菌污染的防治，在發(fā)酵、食品工業(yè)中早已形成完善的措施體系。例如，在食用香菇培育過程中，一般通過選育優(yōu)良菌種和嚴格無菌操作實現(xiàn)雜菌污染防治。在選育優(yōu)良菌種方面，通常選育具有菌絲旺盛、色澤潔白等特征的菌種；在嚴格無菌操作過程中，利用高錳酸鉀與甲醛以1∶2混合后對操作空間進行消毒殺菌在多年的菌株生產(chǎn)中被證明是極為有效的[32]。

3 結語

目前，對于菌種退化的預防及延緩，人們提出了各種合理的方法措施，但主要圍繞環(huán)境因素切入，并且更多體現(xiàn)在工業(yè)發(fā)酵、食品工業(yè)等與人類生活息息相關的方面。然而，由自發(fā)突變導致的退化問題目前仍然沒有比較好的解決方案，僅提出了一些相關建議，如利用某些代謝過程抑制劑如SOS阻斷劑等阻斷相關反應，利用基因工程的方法對微生物性狀進行改良并保證其穩(wěn)定性。但是，在微生物生理代謝機制及菌種退化控制方法等新技術上的研究甚少。總之，目前對于菌種退化的研究仍然是有限的，需要眾多的科研工作者不懈努力，最終改善甚至解決菌種退化問題。