廣西德保矮馬冷凍精液制作與保存

文│鄧祝新 王國(guó)利 魏莎 李敏玲 許春榮 王英群 韋慧華 李牮伸 鄒樂(lè)勤 洪紹鋒（廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站）

當(dāng)前，世界上的大多數(shù)國(guó)家都在建立畜禽基因庫(kù)，畜禽基因庫(kù)中有精液、胚胎、體細(xì)胞等遺傳材料。家畜精液保存目的是將優(yōu)良品種（包括地方優(yōu)良品種）的精液進(jìn)行冷凍，長(zhǎng)期保存，這對(duì)保種和未來(lái)育種十分重要。家畜精液保存技術(shù)是隨著人工授精技術(shù)的推廣使用而產(chǎn)生的，原理是通過(guò)降低或抑制精子新陳代謝達(dá)到延長(zhǎng)精子壽命的目的。家畜冷凍精液發(fā)展迅速，特別在牛方面成效顯著。廣西壯族自治區(qū)2022年開(kāi)始進(jìn)行馬冷凍精液保存研究，目前還處在試驗(yàn)改進(jìn)階段。本研究旨在尋求能確保獲得較好凍后存活率的有關(guān)稀釋液配比和降溫速度等一些因素的“最優(yōu)”組合。

廣西德保矮馬研究所位于廣西百色市德?？h境內(nèi)，是現(xiàn)存、惟一的德保矮馬保種場(chǎng)。德保矮馬是我國(guó)最矮的地方馬種之一，也是世界稀有珍貴馬種，據(jù)文獻(xiàn)記載，德保矮馬是“吉祥馬”的象征。德保矮馬身高76～104厘米，具有性情溫順、體型矮小、體質(zhì)結(jié)實(shí)、體小力大、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良特性，德保矮馬用途廣泛，可用于使役、騎乘、觀賞和科研等。目前，純種德保矮馬數(shù)量較少，必須立即開(kāi)展保種工作，采集德保矮馬的遺傳材料，包括精液、胚胎、體細(xì)胞等。一直使用熏蒸冷凍法制作德保矮馬冷凍精液，導(dǎo)致德保矮馬凍精質(zhì)量一直不夠理想?，F(xiàn)在筆者針對(duì)如何提升德保矮馬冷凍精液質(zhì)量做了更深一步研究。采用法國(guó)卡蘇IMV公司提供的冷凍精液制作方案進(jìn)行德保矮馬冷凍精液生產(chǎn)。

一、采精種公馬的選擇

按照《NY/T 1900-2010畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范》，從保種場(chǎng)中不少于6個(gè)家系中挑選10匹公馬。公馬要求符合品種特征、特性，系譜清楚，三代以?xún)?nèi)無(wú)親緣關(guān)系，體況健康，無(wú)傳染性疾病和遺傳疾病。

二、采精前的準(zhǔn)備

假陰道的準(zhǔn)備：使用法國(guó)卡蘇公司生產(chǎn)的整套采精設(shè)備，包括采精筒、內(nèi)膽、皮外套、集精杯、專(zhuān)用塑料內(nèi)胎、漏斗。采精前向假陰道內(nèi)胎夾層灌入3500～4000毫升（45±2）℃熱水，而后在假陰道入口前l(fā)／2段用玻璃棒均勻涂抹潤(rùn)滑劑（液體石蠟油），無(wú)需打氣。灌水量視公馬陰莖的粗細(xì)、長(zhǎng)短而調(diào)整。采精過(guò)程中內(nèi)胎溫度為（45±2）℃。

臺(tái)馬的準(zhǔn)備：選擇與種公馬相匹配、健康溫順的母馬，將發(fā)情母馬牽引到采精棚內(nèi)保定好，依次用2%來(lái)蘇爾液和清水清洗后軀和外陰部，用干凈毛巾擦干，隨后將公馬牽引到母馬背后準(zhǔn)備采精。

三、采精方法

將種公馬牽至采精場(chǎng)，以臺(tái)馬刺激其性欲。采精時(shí)，采精員右手持假陰道把柄并靠在右臂肘處，公馬爬跨時(shí)立即站于臺(tái)馬右側(cè)，左手輔助將陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)；公馬射精后將假陰道的集精杯端放低并打開(kāi)活塞放氣，充分排精后，緩慢將假陰道豎起并移開(kāi)，迅速送檢。

四、采精頻率

成年公馬每周采精1次（每次采精需要爬跨3次）；青年公馬每周l～2次（訓(xùn)練青年公馬形成采精條件反射）。

五、精液品質(zhì)檢查

取下集精杯，用馬精液專(zhuān)用過(guò)濾紙做成漏斗狀，將新鮮矮馬精液注入漏斗中，過(guò)濾出干凈的原精，收集到一個(gè)100毫升的三角燒杯內(nèi)，在室溫環(huán)境下進(jìn)行檢查。

1.外觀檢查。射精量：用量筒測(cè)量精液量。色澤：正常情況下為淡乳白色或灰白色，帶有淡綠色、淡紅色、黃色、紅褐色等異常顏色的精液應(yīng)廢棄。氣味：新鮮精液略有腥味，氣味異常的應(yīng)廢棄。

2.顯微鏡檢查。精子活率評(píng)定：檢查時(shí)用移液槍取10微升，滴在載玻片上加蓋玻片，在400～600倍顯微鏡下觀察，每個(gè)滴片不得少于3個(gè)視野，求其活力的平均值。顯微鏡載物臺(tái)溫度應(yīng)保持37～38℃。精子活率＜ 0.7的精液應(yīng)廢棄。

精子密度檢查：種公馬每次采精應(yīng)測(cè)定1次精子密度。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定法：用白細(xì)胞細(xì)管吸取一定的原精，再吸取3%氯化鈉溶液將原精稀釋10倍，混合均勻后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器在顯微鏡下放大400倍計(jì)數(shù)，計(jì)算每毫升精液中的精子數(shù)。

3.精液品質(zhì)檢查記錄。精液品質(zhì)檢查記錄表包括種公馬馬場(chǎng)名稱(chēng)、種公馬號(hào)、年齡、品種、毛色特征、采精日期、采精量（毫升）、顏色、氣味、pH、密度（億個(gè)/毫升）、活率、稀釋液種類(lèi)、稀釋后活力、采精員、檢測(cè)員及備注。

六、鮮精的稀釋與平衡

1.鮮精的第一次稀釋與平衡。鮮精密度測(cè)量：使用卡蘇公司生產(chǎn)的家畜精子專(zhuān)用密度儀（ACCUREAD），取40微升原精，注入2.4毫升生理鹽水中，混合搖勻，進(jìn)行密度測(cè)定，并做好數(shù)據(jù)記錄。

鮮精第一次稀釋方法：使用卡蘇公司生產(chǎn)的馬專(zhuān)用稀釋液（離心稀釋液INRA 96），等溫加注，與原精按1∶1的比例混合均勻，然后在37℃的溫水中水浴，等待進(jìn)行離心之前的配平。

2.鮮精的離心。將第一次稀釋后的原精液用50毫升的離心管分裝，配平至2～4管，每管加入1～2毫升的離心緩沖劑。注入離心緩沖劑的方法：首先取出一管精液，將一根吸管直插到精液底部，然后用注射器抽取1～2毫升的離心緩沖劑（MAXI FREEZE ），從吸管頂部注入，直達(dá)精液底部，不能晃動(dòng)吸管，讓緩沖劑停留在底部，然后抽出吸管即可完成一份。以此類(lèi)推，逐一加完其他管子。之后進(jìn)行離心，2500轉(zhuǎn)20分鐘即可。取出離心管，去掉上清液部分，直至保留精液層為止，再用無(wú)菌一次性注射器，垂直插到精液底部，把離心緩沖劑抽取干凈，最后只剩下離心后的精子層。

3.鮮精的第二次稀釋。具體計(jì)算方法如下：

鮮精密度×精液體積＝精子總數(shù)

精子總數(shù)/每管精子總數(shù)＝分裝管數(shù)

分裝管數(shù)×每管體積＝加入冷凍液與抗凍劑的體積

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，分別加入冷凍稀釋液（INRA Freeze）與抗凍劑。一邊稀釋?zhuān)贿呯R檢觀察鮮精的密度，采取理論與經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行稀釋。一般情況下，實(shí)際量要少于理論值。

稀釋要求：

（1）灌裝使用0.5毫升的細(xì)管;

（2）5000萬(wàn)有效精子數(shù)/支（0.5毫升）;

（3）1.5億總精子數(shù)/支（0.5毫升）;

（4）鮮精的活力達(dá)0.7以上為符合冷凍制作要求。

4.鮮精的平衡與分裝。在常溫環(huán)境下，把德保矮馬鮮精液稀釋后水浴，然后靜置于4℃的恒溫冰箱內(nèi)。等待90分鐘后，在4℃的平衡柜里進(jìn)行分裝。分裝要求：使用0.5毫升的細(xì)管進(jìn)行精液分裝、封口。并且在細(xì)管上打印產(chǎn)地、品種標(biāo)識(shí)和日期。最后在細(xì)管凍精包裝的時(shí)候要注明標(biāo)簽、專(zhuān)人保管、存放管理。

七、冷凍精液的制作

冷凍制作使用了法國(guó)卡蘇公司的精子冷凍儀設(shè)備。將分裝好的細(xì)管精液排在冷凍專(zhuān)用架子上，迅速放置于冷凍柜內(nèi)進(jìn)行冷凍制作。在電腦軟件中選擇馬凍精制作專(zhuān)用程序，打開(kāi)程序進(jìn)行冷凍過(guò)程。整個(gè)冷凍時(shí)間為5分鐘左右，以60℃/分鐘的速度降溫，把細(xì)管精液從4℃快速冷凍到-140℃。產(chǎn)品即可成型，然后打開(kāi)冷凍儀，把細(xì)管精液從里面快速取出，瞬間完全浸泡到液氮里，直至液氮沸騰消失。此時(shí)，完成冷凍制作過(guò)程。

八、解凍與鏡檢

首先，用鑷子從液氮中取出凍精，空氣浴2～3秒。然后迅速完全浸泡到38.5℃的恒溫水浴鍋中，搖晃解凍1分鐘，取出、剪管，將全部精液擠入到指型管中，水浴。在電子顯微鏡下鏡檢：用移液槍吸取10微升滴在載玻片上，置于恒溫板上進(jìn)行鏡檢?；盍Φ扔诨虼笥?.3的為合格凍精。

九、精液冷凍保存

按照《NY/T 1900-2010畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范》，對(duì)選定德保矮馬精液進(jìn)行保存。每匹公馬保存凍精不少于300支，冷凍精液質(zhì)量要求：劑量≥0.4毫升，精子活力≥0.3，直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)≥5.0×107，精子畸形率≤25%，細(xì)菌數(shù)≤800個(gè)。細(xì)管標(biāo)記：以漢語(yǔ)拼音縮寫(xiě)標(biāo)明公馬品種、公馬號(hào)、生產(chǎn)日期（如德保矮馬5號(hào)2021年12月31日生產(chǎn)，印字為：DBAM 5 2021 12 31）。標(biāo)簽要求標(biāo)記如下內(nèi)容：品種、個(gè)體號(hào)、生產(chǎn)日期、數(shù)量、解凍后精子的活力、袋號(hào)。